背
景
肿瘤微环境（TME）：指肿瘤细胞周围的环境，包括血管、免疫细胞、成纤维细胞、细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）等。这些组分与肿瘤细胞相互作用，影响肿瘤的生长、侵袭和治疗响应。
3D培养技术：传统的2D细胞培养无法完全模拟体内环境。3D培养技术通过提供一个更加立体和复杂的细胞生长环境，更好地模拟了真实组织的特性，因此在药物测试和疾病模型研究中越来越受到重视。
药物筛选平台：用于评估药物候选物的活性和安全性。这些平台可以是体外的细胞模型、动物模型或是基于机器学习的模型。一个理想的药物筛选平台应该能够准确预测药物在体内的效果。
光片荧光显微镜（LSFM）：一种先进的显微镜技术，它使用薄的光片照亮样品，从而获得高分辨率的3D图像。这种技术特别适合于观察大型生物样品，如细胞团或组织。
针对支持性TME是癌症药物开发中备受关注的一种方法。然而，评估TME靶向候选药物存在一系列独特的挑战。研究者开发了一个全面的筛选平台，可以对自体组织血管化肿瘤球状体 (VTS) 中的药物诱导效应进行监测、量化和排序。
方
法
本研究开发了一种基于血管化乳腺肿瘤球状体的平台，通过光片荧光显微镜对肿瘤微环境靶向药物进行排名评估。
1. 构建了血管化乳腺肿瘤球状体模型，该模型能够模拟真实肿瘤的生长和微环境。
2. 使用光片荧光显微镜对这些球状体进行观察和分析，以评估不同药物对肿瘤微环境的影响。
3. 开发了一种方法，可以从描述性数据集中提取和加权参数，以确定对血管效应最有意义的参数。
4. 通过利用人类观察者的直觉评估能力，他们开发了一种方法来对药物效果进行排名。
5. 提出了一种基于机器学习的方法，可以进一步提高药物效果的识别和排名能力。
6. 建立了一个详细的结构分析数据集，并利用这些数据对药物效果进行了全面和个性化的排名。
结
果
图1 血管化肿瘤球状体的产生、治疗、制备和评估
a.多步骤过程的示意图，包括细胞系的预工程、VTSs的生成、处理、样品制备/染色、包埋、成像、3D图像处理和图像分析，可创建数据集，用于并排比较TME靶向药物引发的复杂结构效应
b. 使用MDA-MB-435s细胞生成的室性心动过速的预处理三维切片图像。
c. 同一VTS的xy平面的分区表示。
d. 通过MDA-MB-468细胞生成的VTS进行预处理。黄色箭头显示CD31+ PV结构，形成管腔。
图2 培养期间复杂VTSs的组成和结构的渐进变化
a. 图像分析程序:预处理后，3D图像经历了一个四方面的分析程序，生成（i）单个细胞区室的表面透视图，（ii）单个细胞的定位，（iii）PV网络的追踪，以及（iv）VTS内假脉管系统远端分布的评估。
b. 培养12天后VTS大小的变化。根据LSFM采集的图像计算容积。
c. 基于MCF7的VTSs在12天培养期内的时间分辨变化。
d. 培养12天后VTS成分的变化。
e. 在基于MDA-MB-231、MDA-MB-435s和MCF7的VTSs中培养12天后PV节段直径的时间分辨分布。
f. 在基于MDA-MB-231、MDA-MB-435s和MCF7的VTSs中培养12天后PV节段分支水平的时间分辨分布。
g. 基于MDA-MB-231、MDA-MB-435s和MCF7的VTSs中培养12天后，三维像素距离最近PV的时间分辨分布。
图3 不同肿瘤细胞系对VTS组成和结构的影响
a. 仅从成纤维细胞、内皮细胞和THP-1s（不含肿瘤细胞）产生的VTSs的结构，或在添加五种不同肿瘤细胞系的情况下产生的VTSs的结构
b.培养9天后VTSs的体积。
c. VTSs内细胞间室的相对体积。
d. 三维冠状切面穿过xy平面上的VTS中心。通过添加MDA-MB-435s或MCF7肿瘤细胞产生的VTSs。
e. TCs与成纤维细胞之间的距离比较。
f. TCs和成纤维细胞与最近PV的距离比较。
g. 用MDA-MB-231、MCF7或ZR75-1肿瘤细胞产生的VTSs中的示踪PV。
h. VTSs内PV网络总容量的分布。
I. VTSs内PV段直径的分布。
j. VTSs内PV支路水平的分布。
图4 不同肿瘤细胞系对巨噬细胞掺入和细胞外基质分布的影响
a. 仅从成纤维细胞、内皮细胞和THP-1s（不含肿瘤细胞）或添加五种不同肿瘤细胞系产生的VTSs的相对CD11b+容量。
b. CD11b+细胞在由MCF7细胞产生的VTS中的分布。
c. CD11b+细胞在由Sk-Br-3细胞产生的VTS中的分布。
d. 巨噬细胞距离VTSs内最近PV的三维像素距离。
e. 在加入不同肿瘤细胞系的情况下产生的VTSs中的相对Col IV+体积。
f. 与PVs直接相关的Col IV+体积占CD31+ PV体积的比例。
g. 基于MCF7的VTS中Col IV的分布。
h. 基于MDA-MB-231的VTS中Col IV的分布。
I. 基于MDA-MB-435s的VTS中的Col IV分布。
j. 基于71个参数的描述性数据集的主成分分析结果。
图5 抗血管生成药物对VTS组成和结构的影响
a. 基于未处理的MDA-MB-435s的VTSs架构。
b. 经AXI处理后的基于MDA-MB-435s的VTSs的结构。
c .在用三种不同抗血管生成剂治疗的基于MDA-MB-435s的VTSs中追踪PV网络。
d-e. 治疗后基于MDA-MB-435s、MDA-MB-231的VTSs中CD31+细胞的绝对体积。f-g. 治疗后通过在基于MDA-MB-435s、MDA-MB-231的VTS中追踪确定的单个CD31+-PV网络的体积。
h-i. 治疗后基于MDA-MB-435s、MDA-MB-231的室性心动过速患者PV节段直径的分布。
j. 比较治疗后基于MDA-MB-435s、MDA-MB-231的VTSs中的TCs和成纤维细胞与最近PV的距离。
图6 药物对VTS组成和结构影响的排序
a. 四名未经培训的观察者负责对照所有适当的对照品，对MCF7和MDA-MB-231器械组中所有经处理的室性心动过速的PV进行评级。观察者评分（OS）代表所有评分的平均值。
b. MCF 7和MDA-MB-231组中所有治疗的OS与数值PV参数的相关性分析。
c. 数值PV参数与OS相关性的计算因子方程。
d. 在用于评估的MDA-MB-435s数据集中，比较OS与计算的血管效应指数（VEI）
e. 计算MCF7、MDA-MB-231和MDA-MB-435s组中所有测试药物的静脉注射指数。
f . MCF7、MDA-MB-231和MDA-MB-435s组中测试药物的抗血管生成作用与血管破坏作用。
g-h. 计算MCF7、MDA-MB-231和MDA-MB-435s组中所有测试药物的肿瘤细胞效应指数和成纤维细胞效应指数。
I. 对照组和MCF7的RS-504393治疗组 VTSs的PV结构。
j. 对照组和治疗组MDA-MB-231 VTSs中PV的结构(AXI，RS-504393)。
k. MDA-m b-231 VTSs、对照组、ZD-7155和LDC 1267治疗组的组成。
l. 与(k)中相同的穿过处理过的MDA-MB-231 VTSs的正面切面，但是肿瘤细胞簇的3D呈现是假彩色的，以表示不同的连接对象。
m. 在对照组和用ZD-7155治疗后，正面切开MCF7室性心动过速。
图7 BMP-1抑制剂UK 383367的影响
a. 计算得出的经UK 383367处理的VTSs中不同隔室的影响指数。
b. 对照和UK 383367处理的MDA-MB-231 VTSs中CD11b+-巨噬细胞的表面呈像。
c. 基于对照和UK 383367处理的VTSs中不同肿瘤细胞系的VTSs中相对胶原IV+-体积。
d. 对照和UK383367处理的MCF7 VTSs中的CD31+（红色）和胶原IV+（蓝色）体积。
e. 对照组和UK383367处理的MDA-MB-435s VTSs中Hif1α+-细胞的密度。
f. MDA-MB-435s细胞产生的VTSs中Hif1α+细胞的分布。
g. 不同微环境条件下PTX对MDA-MB-435s细胞的EC50值。
h. 不同微环境条件下CDDP对MDA-MB-231细胞的半致死浓度。
I. 在2D或在具有NHDFs、HUVECs和THP-1的完整VTS环境中培养的所有GFP+肿瘤细胞中CD44+的百分比。
j. 在添加不同细胞类型的情况下，在2D或3D球状体中培养的MDA-MB-435s细胞中ALDH1A和CD44表达的FACS分析结果。
图8 特定细胞成分的遗传操作
a. 从CTRL、VEGF-A或PDGF-B OE ZR75-1肿瘤细胞产生的VTSs中的示踪PV。
b. ZR75-1 VTSs中总VTS体积中CD31+体积的百分比。
c. ZR75-1 VTSs中PV段平均直径的分布。
d. CD11b+-巨噬细胞在对照组、VEGF-A组或PDGF-B组ZR75-1 VTSs中的位置。
e. ZR75-1 VTSs中CD11b+-巨噬细胞的密度。
f. 在ZR75-1 VTSs中CD11b+-巨噬细胞到VTS表面的最小距离的分布。
g. 产生Snai1/Twist1 OE MDA-MB-231肿瘤细胞和成纤维细胞以产生遗传修饰的VTS的示意图。
h. Snai1或Twist1 OE对MDA-MB-231肿瘤细胞或NHDFs影响的主成分分析。
I. 由CTRL、Snai1或Twist1 OE MDA-MB-231细胞产生的室性心动过速中PV节段直径的分布。
j .由CTRL、Snai1或Twist1 OE NHDF产生的VTS内PV段直径的分布。
k. 从CTRL或Snai1 OE MDA-MB-231生成的VTS中的跟踪PV。
l. 肿瘤细胞到VTSs中最近假血管的平均距离，由CTRL、Snai1或Twist1 OE NHDF生成。
m. 由MDA-MB-231-GFP和NHDF-DsRed生成的VTS(表面:透明灰色)内的PV网络(红色)。一些PV位于VTS表面附近或表面上(白色箭头)。
n. 热图，显示从MDA-MB-231-GFP和NHDF-DsRed生成的VTS中最近PV(红色)的距离。VTS的中心几乎没有PVs。
O. 由MDA-MB-231-GFP和NHDF-Twist1生成的VTS(表面:透明灰色)内的PV网络(红色)。PVs的最外层基本上从VTS的表面缩回(黄色箭头)。
p. 热图，显示从MDA-MB-231-GFP和NHDF-Twist1生成的VTS中最近PV(红色)的距离。
结
论
本文的研究旨在开发一种基于血管化乳腺肿瘤球状体平台的方法，通过光片荧光显微镜对肿瘤微环境靶向药物进行排名评估。研究结果表明：
1. 通过详细的结构分析，可以获得描述性数据集，用于比较药物对血管效应的影响，并实现药物的排名评估。
2. 多参数描述性数据集具有丰富的细节信息，可以用于药物排名，相较于单一终点测定的方法更具优势。
3. 利用人类观察者的直觉评估，可以提取和加权描述性数据集中最有意义的参数，从而实现药物的排名评估。
4. 大规模的三维图像数据集可以通过众包的方式进行标注和排名，为机器学习模型提供基础。
5. 在培养时间的优化方面，研究发现在培养时间达到稳定状态后，细胞间的动态变化对结果不再产生影响，因此可以选择稳定状态的时间点进行实验。
6. 不同肿瘤细胞系在构建肿瘤微环境时会产生特定的差异，包括组织成分和结构等方面的变化。
综上所述，本研究提出了一种基于血管化乳腺肿瘤球状体平台的方法，可以通过光片荧光显微镜对肿瘤微环境靶向药物进行排名评估，并揭示了不同肿瘤细胞系在构建肿瘤微环境时的差异。这一方法为个性化药物测试提供了新的途径。
参
文
考
献
Ascheid D, Baumann M, Pinnecker J, et al. A vascularized breast cancer spheroid platform for the ranked evaluation of tumor microenvironment-targeted drugs by light sheet fluorescence microscopy. Nat Commun. 2024;15(1):3599. Published 2024 Apr 27. doi:10.1038/s41467-024-48010-z
感谢浙江省人民医院输血科来稿！
公众号｜输血人
本期编译｜李凯强 徐伟
欢迎投稿 koloohh@163.com
