背
景
血小板（PLT）储存损伤是由Murphy等人首先提出的一个术语，用来描述在PLT储存期间观察到的有害变化，如乳酸水平升高、pH值降低、表面膜糖蛋白（尤其是GPIb）的损失，以及对ADP和胶原蛋白的聚集反应降低。
导致PLT储存损伤的机制是多因素的，包括来自PLT收集、处理、储存和收集后操作的物理应激以及单胞PLT老化引起的生化改变。
储存损伤将导致单采PLT释放出一些物质，包括一些可溶性分子，以及一些膜性颗粒（PSLPs）。这些PSLPs的大小和表面性质将影响其在循环中的命运，包括细胞摄取，与血管系统细胞的相互作用，转移生物活性分子的能力等。这项研究对PLT储存损伤的产物膜性颗粒（PSLP），包括脱颗粒PLT、PLT鬼影（空的血小板质膜，没有颗粒、其他细胞器和细胞质内容物）、膜碎片和细胞外膜囊泡PEVs）进行了分析。
方
法
①单采血小板的采集和储存
采集12名健康献血者的单采PLT，并将所有血小板收集并储存在血小板振摇器中，温度20-24℃，连续水平振摇7天。
②PSLPs的分离
在储存的第1、3、5和7天，从单采PLT中收集5 mL样品;将终浓度为1µM的前列腺素E1 （PGE1）加入到PLT样品中，1000 g在室温下离心30分钟，从含有PSLPs的上清中分离完整的PLT。
③电镜观察PSLPs的大小和形态
利用ImageJ软件对扫描电镜（SEM）图像进行分析，计算圆度值，评价血小板在不同储存时间的形态变化。透射电镜（TEM）观察PSLPs内容物。
④流式细胞技术（FC）
将含有PSLPs的上清液用1.5% BSA/PBS稀释，使得分析期间每秒可获得1000至2000个颗粒。
将300 μL稀释后的上清液与饱和浓度的cd41a（FITC/PE），cd62p （pe;10 μL, 1:10）， TOM20（Alexa 647;10 μl, 1:5）， lc3 (fitc;5 μL）单克隆抗体，或乳酸粘附素（FITC;10 μL, 1:5）以及膜标DHPE（Texas Red, 20 μL, 1:10）在室温条件下孵育20 min;（cd41a——血小板标记分子；cd62p——血小板激活后标记分子；TOM20——线粒体标记分子；lc3——自噬标记分子；PS——磷脂酰丝氨酸）。
⑤蔗糖密度梯度离心
PSLPs颗粒受到蔗糖密度梯度的影响，100000g超速离心14小时后，收集到3个群体的PSLPs。
结
果
图1 储存过程中单采PLTs的形态学和超微结构分析
图2 PSLPs的计数随储存时间延长增加
图3 单采PLTs上清液由具有广泛尺寸分布的 PSLPs组成
图4 通过密度梯度分离的PSLPs的超微结构分析
图5 通过密度梯度分离的PSLPs群体的FC分析
图6 血浆分离术PLTs在室温保存期间释放线粒体(MITO)
结
论
研究提出了单采PLTs在室温储存过程中PSLP生成的演变过程。发现不同类型的PSLPs来自功能激活的血小板和正在死亡的血小板。与活化相关的PSLPs，包括PEV，在储存早期（第1-3天）释放；在此之后，主要释放与凋亡和坏死相关的PSLP。
研究中使用的水平震荡，目前通常用于血小板储存，但与缓慢（3 RPM）循环震荡相比，它对血小板的剪切应力要高得多。需要进一步的研究来评估不同类型的震荡如何影响PLTs的激活状态和PSLPs的定量特征。发掘这些不同的PSLPs群体对血管内皮细胞和其他相关血细胞的影响，并充分了解输注PSLPs在体内的功能意义对未来评估PLTs输注疗效有重要作用。
参
文
考
献
De Paoli, SH, Patel, M, Elhelu, OK, et al. Structural analysis of platelet fragments and extracellular vesicles produced by apheresis platelets during storage. BLOOD ADV. 2024; 8 (1): 207-218.
感谢西南医科大学附属医院输血科来稿！
公众号｜输血人
本期编译｜郭天虹 黄远帅
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