背
景
血小板因子4 (PF4)，也称为C-X-C基序配体 4，是一种从血小板α颗粒中释放的7.8kDa趋化因子。PF4形成具有致密球状结构和赤道带强正电荷的四聚体，它与带负电荷的分子紧密结合，包括内皮蛋白聚糖和感染因子。PF4抗体与PF4形成免疫复合物，是肝素诱导的血小板减少症 (HIT)和疫苗诱导的免疫性血小板减少症和血栓形成(VITT)发病机制的基础。
PF4对血小板的直接影响尚未得到广泛研究。PF4可增强血小板活化，并且最近已被证明可诱导血小板聚集，但其潜在机制尚未得到研究。本研究发现PF4与血小板生成素(TPO)受体c-Mpl结合，诱导Janus激酶2(JAK2)的激活。JAK2抑制剂ruxolitinib可抑制血小板对PF4和VITT抗体的聚集。
方
法
1、洗涤血小板制备
从征得同意的患者或无药物的健康志愿者身上抽取血液，装入含3%枸橼酸钠的真空冷凝器或血清分离管中。室温下200g离心20分钟，收集富含血小板的血浆（PRP）。用0.2μg/mL前列环素将PRP以1,000g离心10分钟，然后重悬于改良Tyrode’s-HEPES缓冲液。
2、VITT IgG分离
使用蛋白A柱从一名VITT患者的血浆中分离出总 IgG。柱上收集的IgG经过洗脱、收集和浓缩后透析到磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。总蛋白浓度使用分光光度计检测。
3、透光聚集测定
将血小板预热至37℃，并与PF4和/或抑制剂预孵育5分钟。在搅拌条件下（1200转/分）加入激动剂，并在7-30分钟内测量血小板聚集情况
4、蛋白质磷酸化
用依菲巴特（9μM）预处理预热至37 ℃的血小板（4×108/mL）。反应10分钟后终止，样品经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、电转移和Western印迹。在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳胶上切除95kDa的物质，进行质谱分析。
结
果
图1 PF4通过与c-Mpl结合和激活JAK2-STAT3/5通路来诱导血小板聚集
图2 JAK2和c-Mpl阻断剂可抑制血小板对PF4的反应
图3 依菲巴特可阻止血小板向PF4聚集
图4 PF4与c-Mpl的结合会破坏TPO的结合
图5 Ruxolitinib不阻断CRP或凝血酶介导的血小板聚集
图6 血小板生成素可引起与PF4相似的血小板聚集反应，并被ruxolitinib 阻断
图7 在阻断血小板聚集到CRP的浓度下，Syk和Src抑制不会阻断PF4介导的血小板活化
图8 分离的VITT
IgG通过FcγRIIA以PF4依赖的方式激活血小板，但FcγRIIA下游信号抑制剂或iv.3阻断受体不会阻断PF4介导的血小板活化
结
论
本研究证明了PF4结合并激活血小板上的血小板生成素受体、细胞性骨髓增殖性白血病蛋白 (c-Mpl)。这会导致Janus激酶2(JAK2)激活以及信号转导子和转录激活子(STAT)3和STAT5磷酸化，从而导致血小板聚集。抑制c-Mpl-JAK2通路可抑制血小板对PF4、VITT血清以及从VITT患者血浆中分离出的PF4和IgG组合的聚集。这些结果支持一种模型，即基于PF4的免疫复合物通过Fc域与FcγRIIA 结合以及PF4与c-Mpl 结合来激活血小板。
参
文
考
献
Buka RJ, Montague SJ, Moran LA, et al. PF4 activates the c-Mpl-Jak2 pathway in platelets. Blood. 2024;143(1):64-69.
感谢浙江省人民医院输血科来稿！
公众号｜输血人
本期编译｜朱佳男 陈秉宇
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