【Blood】线粒体tRNA的假尿苷修饰调控红细胞生成

假尿苷修饰（Ψ）是指由假尿苷酶（PUS）催化的尿苷（U）转化为假尿苷（PUS）的过程，是RNA中最常见的修饰。

红细胞生成是一个具有不同阶段的复杂过程，任何干扰都可能导致贫血。铁粒幼细胞性贫血（SA）是一种以环形铁粒幼细胞为特征的贫血。先天性铁粒幼细胞性贫血（CSA）相关的致病基因主要参与涉及线粒体的生物学过程，如血红素生物合成、铁硫簇生物合成、线粒体翻译和呼吸，这表明贫血与线粒体密切相关。目前临床上有一种罕见的SA称为线粒体肌病，乳酸酸中毒和铁粒幼细胞性贫血（MLASA），PUS1是与MLASA相关的第一个被鉴定的基因，但PUS1在红细胞生成中的作用仍不清楚。

1、通过DNA测序探究MLASA患者是否存在遗传基因突变

2、通过电穿孔将Yamanaka因子导入来自患者的骨髓单核细胞中构建诱导多能干细胞MLASA-iPSC ；

3、通过CRISPR-Cas9同源修复PUS1突变基因，构建MLASA-Res-iPSC细胞系；

4、通过流式细胞术、WB、RT-qPCR、ROS检测和线粒体膜电位等实验检测红细胞分化、蛋白和RNA表达以及线粒体功能；

5、通过转录组和蛋白质组测序研究疾病发病机制；

6、通过相应的突变小鼠模型研究突变基因对体内疾病影响；

7、通过体外细胞实验、体内动物疾病模型探究雷帕霉素对疾病的影响并据此对患者进行药物治疗

1.在MLASA患者中发现一种新的PUS1 p.P175fs突变

图1.PUS1 p.P175fs突变导致红系分化异常

A. MLASA患者骨髓铁染色的代表性图像。黑色箭头表示环形铁粒幼细胞。

B. 2013年至2019年该患者药物治疗后血常规各项指标，贫血并未明显改善。

C. 患者家族的谱系树（左图）和DNA测序结果的色谱图（右图）。患者具有纯合子PUS1突变（ p.P175fs ），并且她的父母携带相同的杂合变体，表明这种突变是遗传的。

2.构建iPSC细胞系并验证PUS1的P175fs突变导致其mRNA和蛋白表达量下降

补充图1. 患者来源的iPSC 系的建立和验证

B. 从患者骨髓单核细胞产生iPSC的示意图。

D. Normal-iPSC、MLASA-iPSC和MLASA-Res-iPSC的DNA测序验证PUS1基因突变和校正

J. iPSC中PUS1基因的mRNA表达水平

K. iPSC中PUS1蛋白水平，MLASA-iPSC组中PUS1蛋白几乎不表达。mtPUS1定位于线粒体，nPUS1定位于细胞核。

3.PUS1缺陷导致红细胞生成障碍

图1.PUS1 p.P175fs突变导致红系分化异常

D. 从iPSC到红细胞分化的3阶段示意图：iPSC集落形成、造血诱导、红细胞分化

E. 不同时期红系细胞分化效率。分析正常和MLASA-Res-iPSC分化效率相近，MLASA-iPSC分化效率减慢。（i）iPSC集落的代表性图像。（ii）血管内皮细胞（HE）和（iii）成红细胞的流式细胞术分析。（iv）由HE体外产生的CD71+ CD 235+细胞和CD 71- CD235-细胞的细胞团块

F-H. iPSC集落大小的定量，造血内皮细胞的百分比

图1.PUS1 p.P175fs突变导致红系分化异常

I. 两阶段红细胞分化示意图

J. 在生血诱导的第一个6天后，HE细胞的百分比在MLASA-iPSC、正常和MLASA-Res-iPSC 之间是相似的;

K. 在另一个6天的红细胞分化阶段之后，MLASA-iPSC比正常-iPSC和MLASA-Res-iPSC成红细胞少。

4.PUS1缺陷导致线粒体功能受损

图2. PUS1的缺险损害iPSC中的线粒体功能

AB. 流式细胞术评估三种iPSC系中的线粒体量和与线粒体膜电位（MMP）的比率。

C. iPSC中mtDNA表达量。

D. iPSC中的细胞ATP水平。

E-G. iPSC中的线粒体（E）、总细胞（F）和细胞质（G）ROS水平。

图2. PUS1的缺险损害iPSC中的线粒体功能

H-I. iPSC中的细胞耗氧量。

寡霉素（Oligo）、FCCP和鱼藤酮/抗霉素A（Rot/AA），监测耗氧率（OCR）。

J. 线粒体呼吸链复合体（OXPHOS）的活性分析。MLASA-iPSC中复合物I、III活性减弱。

5.靶向线粒体tRNA（mt-tRNA）的PUS1的假尿苷修饰（Ψ）缺失影响线粒体蛋白表达

补充图5. 具有PUS1缺陷的iPSC中线粒体蛋白的合成减少

AB. 通过免疫荧光评估iPSC的总体线粒体翻译，PUS1缺失导致线粒体蛋白合成减少。

图3.PUS1通过下调特定的线粒体tRNA来调节线粒体翻译

A. 在iPSC中差异表达的mt-tRNA的热图

B.MLASA-iPSC中五种下调的mt-tRNA的简化二级结构，Ψ28 为PUS1修饰的潜在假尿苷位点

C.CMC引物延伸测定法证实Ψ28是PUS1靶标

D. 13种线粒体基因组编码蛋白表达排序

E-F. 在iPSC中线粒体基因组编码蛋白的蛋白质表达水平

G-H. 在iPSC中核编码的线粒体亚基的蛋白表达水平

I. iPSC中氧化呼吸链基因的mRNA表达水平

6.雷帕霉素改善由PUS1缺陷引起的红细胞生成障碍

补充图6. 翻译效率差异基因和蛋白质组学研究均富集在线粒体氧化呼吸链信号通路中

A-G. MLASA-和MLASA-Res-组的iPSC核糖体测序（Ribo-Seq）和蛋白质组学分析，上调差异基因富集在mTOR 信号传导和OXPHOS通路，蛋白质组学的差异基因也富集在OXPHOS通路

图4.雷帕霉素通过抑制整体蛋白质合成来消除由PUS1缺失引起的红系分化停滞

A. 在缺氧条件下用雷帕霉素处理后iPSC成红细胞生成效率；

B. iPSC中S6（左）和4E-BP1（右）的磷酸化水平；

C-D. iPSC（C）和iPSC衍生的HE细胞（D）中4E-BP1的磷酸化水平

E. 两个iPSC系之间TOP或TOP样mRNA 的翻译效率（TE）的差异。

F. 通过嘌呤霉素掺入测定检查整体蛋白质合成；

G. 通过OP-puro掺入实验监测HE细胞中蛋白质合成速率，H. 在从HE向红系分化期间，通过在用雷帕霉素处理48小时的HE细胞中的OP-puro掺入实验监测蛋白质合成速率；

I-J.在复合物III抑制剂抗霉素A（I）和4 NQO（J）处理后正常iPSC中复合物III的活性；

K-L. 在抗霉素A处理后的正常iPSC中的S6（K）和4E-BP（L）的磷酸化水平；

M-N. 在4NQO处理后的正常iPSC中的S6（M）和4 E-BP 1（N）的磷酸化水平。

7.PUS1缺陷小鼠有贫血症状

图5.PUS1缺陷损害小鼠红系细胞发育

A. 不同性别的4周龄野生型（WT）和PUS1S172 fs/S172 fs小鼠（S172fs）的全血细胞计数分析

B-D.4周龄小鼠骨髓（BM）中成红细胞的流式细胞术分析

E-G.4周龄小鼠脾（SP）细胞中成红细胞的流式细胞术分析

H. 竞争性移植试验示意图。

I.系列竞争性移植试验中成熟红细胞的供体细胞频率

8.PUS1缺陷导致小鼠线粒体功能障碍

图6. PUS1缺陷小鼠表现出线粒体功能障碍

A-B.用流式细胞术检测Lin- / LKS- / LSK+ / LT-HSC / ST-HSC 746 / MPP / MEP / CMP / GMP细胞的线粒体量和MMP；

C-D. 通过流式细胞术评估骨髓Ter 119+细胞细胞的线粒体量和MMP；

E-F. 骨髓Ter 119+细胞的细胞质（E）和线粒体（F）ROS水平

G-H.测量小鼠骨髓细胞中的细胞耗氧量

I. WT和突变小鼠中线粒体呼吸链复合物的活性

J.WT和S172fs组之间的骨髓细胞的ATP水平

该研究利用体外患者特异性iPSC和体内小鼠模型，证明PUS1缺陷引起特定mt-tRNA假尿苷修饰缺失，引起线粒体功能障碍和mTOR信号传导途径的异常激活，导致红细胞生成障碍和贫血，并表明西罗莫司（雷帕霉素，一种mTOR抑制剂）能有效地改善MLASA患者的贫血表型，为线粒体tRNA假尿苷修饰在控制红细胞生成中的关键作用提供了新的见解，并为面临蛋白质翻译相关挑战的贫血患者提供了潜在的治疗策略。