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背景
血小板和中性粒细胞作为内环境的哨兵相互配合保护机体免受无菌性和感染性损伤，维持机体的完整性。然而，在病理条件下，血小板和中性粒细胞也可引起血栓炎症从而导致心肌梗死（MI）、静脉血栓栓塞（VTE）或中风等致命性血栓事件。
血小板和中性粒细胞都起源于骨髓(BM)，血小板由骨髓（BM）中的巨核细胞（MK）产生，窦周间隙是血小板和中性粒细胞在血液和骨髓间的通信枢纽。然而，人们对骨髓中巨核细胞和中性粒细胞之间相互作用知之甚少。目前尚不清楚这些相互作用是否存在以及是否参与不良的血栓炎症反应，从而最终导致血栓并发症。
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方法
1.原代小鼠胎儿肝细胞衍生巨核细胞培养 在胚胎 13.5-14.5 天获取小鼠胎儿肝细胞。悬浮细胞在含有 70 ng/ml 凝血生成素（TPO，ImmunoTools）的 DMEM 培养基（10% 胎牛血清+1% 青霉素/链霉素）中培养 5 天。第五天，使用牛血清白蛋白（BSA）梯度法富集巨核细胞。
2.骨髓来源的 MK 分离
3.白细胞分离 分离小鼠中性粒细胞。从脾脏（B 细胞和 T 细胞）或 BM 中获取 B 细胞、T 细胞和单核细胞。
4.共培养 将来源于骨髓的巨核细胞或胎儿肝细胞(FLC)(用于染色)播种在涂有 100 mg/ml 纤维蛋白原的 6 孔培养皿中，并在培养基中培养 6 小时。30 分钟后，向 MK 培养液中中性粒细胞。中性粒细胞与白细胞的比例根据中性粒细胞的数量比例进行调整（100% 中性粒细胞、75% B 细胞、24% 单核细胞、12% T 细胞）。6 小时后收集上清液，用 1%多聚甲醛(PFA)在 RT 条件下固定 10 分钟。将释放的血小板颗粒(PP)离心并用直接荧光标记的 CD42d-APC、Ly6G-PE 和 CD61-FITC 抗体染色，然后用流式细胞仪进行分析。
5.共培养(免疫印迹) 分离出干净的 MK 群后制备样本（10 毫克）并进行免疫印迹。
6.血细胞计数分析。
7.流式细胞分析 成熟的 MK 则以 CD41+/CD42d+ 双阳性群体进行分选。通过碘化丙啶染色对 MK 的倍性进行量化。
8.网状血小板的定量
9.中性粒细胞耗竭 使用药物对Mrp8-cre/Rosa26-iDTR 小鼠进行中性粒细胞耗竭。
10.单核细胞和 B 细胞耗竭 10-12 周大的 C57BL/6 雄性小鼠连续 5 天（静脉注射）抗CCR2（MC-21）或同型对照抗体。为了消耗 B 淋巴细胞，Cd19-cre/iDTR 小鼠连续 3 天（静脉注射）白喉毒素。
11.体内 N-乙酰半胱氨酸（NAC）治疗 10-12 周大的小鼠被分配接受 N-乙酰半胱氨酸或 0.9%NaCl （载体）静脉注射，连续 5 天后采集血液和骨骼进行进一步分析。
12.血小板寿命测定 为量化血小板寿命，进行了生物素脉冲标记试验。
13.体内可视化细胞标记 使用抗体使得体内可视化中性粒细胞和 MKs。
14.颅内多光子成像技术
15.体外 MK 与中性粒细胞相互作用的延时成像
16.过继性中性粒细胞转移
17.Mrp8-cre（+）/iDTR小鼠的过继性中性粒细胞转移
18.骨整体包埋染色
19.免疫荧光染色
20.ROS 定量和体外 ROS 可视化
21.小鼠 BM 细胞因子谱分析
22.构建急性心肌梗死小鼠模型和氯化铁（III）诱导小鼠颈动脉血栓形成模型
23.氯化铁（III）诱导的肠系膜动脉血栓形成中的血小板募集
24.下腔静脉血流受限的静脉血栓形成模型和LPS 诱导炎症模型
25.生成骨髓嵌合体
26.招募急性ST段抬高型心肌梗死（症状出现时间小于12小时）患者
27.GWAS 分析
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结果
图 1.中性粒细胞拔除 PPL 形成的 MK
中性粒细胞与BM内的巨核细胞相互作用，中性粒细胞通过牵拉PPL（前体血小板）片段来促进血小板的产生。
图2.在血栓形成过程中，中性粒细胞的清除会加速PPL的生长和释放
循环中性粒细胞清除导致血管内和窦周间隙的PPL出芽部位MK-中性粒细胞相互作用减少，回输中性粒细胞恢复了中性粒细胞对PPL的牵拉，并加速了PPL的生长和破碎。
图 3.中性粒细胞表达的 CXCR4 可调控中性粒细胞清除和血小板生成
中性粒细胞减少抑制循环血小板数量和网状血小板的生成，中性粒细胞与血小板发生直接结合才能促进血小板生成且需要中性粒细胞的机械力传导；中性粒细胞敲除CXCR4向窦周间隙归巢减少，与巨核细胞结合减少且PPL生长速度减慢释放时间延长。
图 4.中性粒细胞衍生的活性氧驱动血栓形成
胞外ROS减少导致血小板生成减少；巨核细胞与中性粒细胞相互作用促进胞内ROS的产生并激活了MLC和ERK信号通路。
图5.心肌梗死通过中性粒细胞的清除引发血栓形成
MI期间，中性粒细胞与巨核细胞结合导致大量促血栓形成的血小板生成。
图6.在心血管疾病中，中性粒细胞CXCR4的基因敲除可以防止继发性缺血事件并降低血栓风险
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结论
该研究发现中性粒细胞通过CXCR4-CXCL12被募集到巨核细胞的PPLs出芽位点（窦周间隙），通过直接力传递和ROS依赖的机械信号来“牵拉”MK，从而促进PPLs的生长和释放。
中性粒细胞在血栓炎症过程中促进网织血小板的释放，增加动脉血栓形成和心肌梗死后反复缺血事件的风险。因此靶向中性粒细胞驱动的血小板生成减少促血栓形成的网织血小板的供应可能是一种有效的抗血栓方法。
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参考文献
Petzold T, Zhang Z, Ballesteros I, et al. Neutrophil "plucking" on megakaryocytes drives platelet production and boosts cardiovascular disease. Immunity. 2022;55(12):2285-2299.e7.
感谢浙江省人民医院输血科来稿
微信号｜输血人
本期编译｜张嫣瑜 陈秉宇
