Chestnut Studying
摘要
Treatment with the toll-like receptor 4 agonist monophosphoryl lipid A conditions innate immunocytes to respond robustly to subsequent infection, a phenotype termed innate immune memory. Our published studies show that metabolic reprogramming of macrophages is a prominent feature of the memory phenotype. We undertook studies to define the functional contributions of tricarboxylic acid cycle reprogramming to innate immune memory. We observed that priming of wild-type mice with monophosphoryl lipid A potently facilitated accumulation of the tricarboxylic acid cycle metabolite itaconate at sites of infection and enhanced microbial clearance. Augmentation of itaconate accumulation and microbial clearance was ablated in Irg1-deficient mice. We further observed that monophosphoryl lipid A potently induces expression of Irg1 and accumulation of itaconate in macrophages. Compared to wild-type macrophages, the ability of Irg1-deficient macrophages to kill Pseudomonas aeruginosa was impaired. We further observed that itaconate is directly antimicrobial against P. aeruginosa at pH 5, which is characteristic of the phagolysosome, and is facilitated by reactive oxygen species. Monophosphoryl lipid A–induced augmentation of glycolysis, oxidative phosphorylation, and accumulation of the tricarboxylic acid cycle metabolites succinate and malate was decreased in Irg1 knockout macrophages compared to wild-type controls. RNA sequencing revealed suppressed transcription of genes associated with phagolysosome function and increased expression of genes associated with cytokine production and chemotaxis in Irg1-deficient macrophages. This study identifies a contribution of itaconate to monophosphoryl lipid A–induced augmentation of innate antimicrobial immunity via facilitation of microbial killing as well as impact on metabolic and transcriptional adaptations.
用TLR4激动剂单磷脂 A 处理先天性免疫细胞，使其对随后的感染做出强有力的反应，这种表型被称为先天性免疫记忆。我们已发表的研究表明，巨噬细胞的代谢重编程是记忆表型的一个显著特征。我们进行了研究，以确定三羧酸循环重编程对先天性免疫记忆的功能性贡献。我们观察到，用单磷酸脂质 A 给野生型小鼠打底，能有效地促进三羧酸循环代谢产物衣康酸在感染部位的积累，并增强微生物的清除能力。在 Irg1 缺乏的小鼠中，衣康酸积累和微生物清除的增强作用被削弱。我们进一步观察到，单磷脂 A 能有效诱导巨噬细胞中 Irg1 的表达和衣康酸的积累。与野生型巨噬细胞相比，Irg1缺陷型巨噬细胞杀死铜绿假单胞菌的能力受损。我们进一步观察到，衣康酸在吞噬溶酶体所特有的 pH 值为 5 时可直接对铜绿假单胞菌产生抗菌作用，并由活性氧促进。与野生型对照组相比，Irg1 基因敲除的巨噬细胞中单磷酸脂质 A 诱导的糖酵解、氧化磷酸化和三羧酸循环代谢产物琥珀酸盐和苹果酸盐的积累均有所下降。RNA 测序显示，在 Irg1 基因缺陷的巨噬细胞中，与吞噬溶酶体功能相关的基因转录受到抑制，而与细胞因子产生和趋化相关的基因表达增加。这项研究确定了衣康酸对单磷脂 A 诱导的先天性抗微生物免疫力增强的贡献，这种增强是通过促进微生物杀灭以及对代谢和转录适应性的影响实现的。
实验结果1
MPLA 诱导的衣康酸产生有助于体内微生物的清除
研究旨在评估衣康酸是否有助于增强MPLA在体内诱导的抗菌反应。WT 和 Irg1KO 小鼠在接受铜绿假单胞菌IP 挑战前 48 和 24 小时分别接受 MPLA 或载体的腹腔注射（IP）治疗（图 1A）。感染后 6 小时，在腹腔灌洗液中测量衣康酸浓度、铜绿假单胞菌 CFU 和先天性白细胞计数以及血浆 IL-6 浓度。在使用药物治疗的 WT 小鼠中，感染后 6 小时在腹腔中检测到衣康酸。用 MPLA 治疗后，感染后衣康酸的积累增加了 7 倍多（图 1B）。Irg1KO小鼠感染后的腹腔灌洗液中不存在衣康酸。
用 MPLA 处理的 WT 小鼠腹腔灌洗液中铜绿假单胞菌 CFU 比用药物处理的对照组低 3 个数量级（图 1C）。经 MPLA 处理的 Irg1KO 小鼠腹腔灌洗液中的铜绿假单胞菌CFU 与经对照处理的小鼠无显著差异，比经 MPLA 处理的 WT 小鼠高 2 个数量级。这些发现提供了证据，证明衣康酸有助于局部清除细菌，从而增强了经 MPLA 处理后诱导的抗菌表型。已发表的研究报告指出，衣康酸通过 Rab32/BLOC3 促进衣康酸转运到吞噬溶酶体，从而使吞噬细胞杀死沙门氏菌。为了评估这一机制在 MPLA 处理后是否活跃，作者评估了 WT 小鼠和 BLOC3 KO 小鼠在接受载体或 MPLA 处理后铜绿假单胞菌的清除率。作者观察到，经 MPLA 处理的 WT 和 BLOC3 KO 小鼠的铜绿假单胞菌 CFU 与经载体处理的对照组相比均有近 3 个数量级的下降，经 MPLA 处理的 WT 和 BLOC3 KO 小鼠之间无显著差异。其他已发表的研究表明，Nrf2 激活是介导衣康酸免疫效应的一种机制。作者进行了研究，以评估 Nrf2 消融是否会影响 MPLA 诱导的微生物清除增强作用。作者观察到，与对照组相比，用 MPLA 处理的 WT 和 Nrf2 KO 小鼠的铜绿假单胞菌CFU 下降了 3 到 4 个数量级，而比较 WT 和 Nrf2 KO 小鼠则无显著差异。总之，这些结果表明，衣康酸能促进MPLA处理小鼠体内铜绿假单胞菌的清除，但Rab32/BLOC3介导的转运机制和Nrf2的激活都不能促进这种效应。
作者已发表的研究表明，先天性白细胞向感染部位招募的增加与 MPLA 诱导的抗微生物免疫的增强有关。为了评估衣康酸是否会影响先天性白细胞向感染部位的招募，作者测量了腹腔中先天性髓系细胞的数量。腹腔灌洗液中中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞的总数量在接受 MPLA 治疗的小鼠中明显高于接受药物治疗的对照组，但在 WT 小鼠和 Irg1KO 小鼠中没有明显差异（图 1D）。
在作者的模型中还评估了Irg1消减对细胞因子产生的影响。经对照处理的 WT 和 Irg1KO 小鼠在感染后的血浆中测得了高浓度的 IL-6（图 1E）。经MPLA处理的小鼠感染后血浆中IL-6浓度明显降低，但WT和Irg1KO小鼠的血浆中IL-6浓度没有差异。许多其他细胞因子和趋化因子的变化规律与 IL-6 相同。
为了确定衣康酸是否会影响体内的吞噬作用，小鼠接受了载体或 MPLA 的治疗，并在 24 小时后接受 pHrodo 标记细菌的挑战（图 2A）。用 MPLA 处理小鼠不会提高中性粒细胞的吞噬能力，但会显著提高单核细胞和巨噬细胞的吞噬能力。与 WT 小鼠相比，经对照处理的 Irg1KO 小鼠的中性粒细胞的吞噬能力明显提高，但经 MPLA 处理的 WT 小鼠和 Irg1KO 小鼠的中性粒细胞的吞噬能力没有明显差异（图 2A）。在比较 WT 和 Irg1KO 小鼠的单核细胞和巨噬细胞时，吞噬作用没有明显差异。对照或 MPLA 处理 3 d 后，还评估了培养的 BMDMs 的吞噬作用，观察到相同的模式（图 2B）。用 MPLA 处理 BMDMs 可显著提高 BMDMs 的吞噬能力，而在比较 WT 和 Irg1KO BMDMs 时未观察到吞噬能力的差异。对体内先天性白细胞呼吸爆发活性的评估显示，与药物处理的对照组相比，MPLA 处理小鼠的中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞的呼吸爆发增强（图 2C）。WT 小鼠和 Irg1KO 小鼠的呼吸爆发活性没有差异。体外骨髓巨噬细胞的呼吸爆发也是在药物或 MPLA 处理 3 d 后进行评估的（图 2D）。MPLA 处理增加了骨髓衍生巨噬细胞的呼吸爆发活性，在 WT 和 Irg1KO BMDMs 之间未观察到显著差异。对总活性氧（ROS）产生量的评估显示，MPLA 诱导的总 ROS 产生量增加，而 fMLP 的挑战又进一步扩大了总 ROS 的产生量（图 2D）。在比较 WT 和 Irg1KO BMDMs 时，未观察到总 ROS 生成量有明显差异。总之，这些结果表明，MPLA 处理可增加衣康酸在感染部位的积累，并提高铜绿假单胞菌的清除率。消除衣康酸的产生可逆转 MPLA 处理小鼠增强的微生物清除能力，但不会影响先天性白细胞的招募、细胞因子的产生、吞噬作用或呼吸爆发活动。
实验结果2
MPLA 可诱导巨噬细胞中 Irg1 的表达和衣康酸的积累
鉴于MPLA处理在体内感染模型中增强了巨噬细胞的抗微生物功能，作者评估了MPLA处理对培养的BMDMs中Irg1表达和衣康酸产生的影响。在分离后的第 7 天，用 MPLA 或对照品处理 BMDMs 24 h，然后进行冲洗，分析前休息 3 d（称为处理后 3 d 或 3dp）。在分析前将 BMDM 暴露于 MPLA 4 小时和 24 小时，以评估 MPLA 的急性效应。在某些实验中，对照物处理和 3dp MPLA 巨噬细胞用 LPS 再刺激，如各图所示（图 3A）。经 MPLA 刺激后 4 小时，Irg1 mRNA 水平最高（图 3B）。Irg1 蛋白在 MPLA 处理后 24 小时达到峰值，并在处理后 3 d 保持升高（图 3C）。衣康酸在 MPLA 处理后 4 h 升高，并在 24 h 和 3 dp 持续升高（图 3D）。LPS 也能在 24 小时内有效诱导衣康酸在 BMDMs 中积累（图 3E）。LPS 诱导的衣康酸水平与 MPLA 诱导的水平相加。在受到 LPS 挑战的 BMDM 上清液中检测到了衣康酸（图 3F）。经 MPLA 处理的 BMDM 与经对照处理的 BMDM 释放到条件培养基中的衣康酸一样多（图 3F）。由于细胞培养基的变化，上清液中的水平仅反映了测量前 24 小时内产生的细胞外衣康酸。
作者已发表的研究表明，用 MPLA 处理可提高巨噬细胞的糖酵解能力和耗氧率。作者进行了研究，以评估 Irg1 敲除对对照和 MPLA 处理的 BMDMs 中糖酵解和氧化代谢的影响（图 4A）。与 Irg1KO BMDMs 相比，MPLA 有效地提高了 WT BMDMs 的糖酵解能力和最大呼吸量（图 4A）。作者进一步测量了经 MPLA 处理后 WT 和 Irg1KO BMDMs 中乳酸和 TCA 循环代谢产物的丰度（图 4B）。在 MPLA 处理后 24 小时，WT 和 Irg1 BMDMs 中的乳酸积累同样增加。与 WT BMDMs 相比，MPLA 处理后 Irg1KO BMDMs 中柠檬酸积累水平更高。在 WT BMDMs 中，MPLA 处理 24 小时后，衣康酸增加，并在 3dp 时保持升高。在 Irg1KO BMDMs 中测不到衣康酸。在 WT BMDMs 中，MPLA 诱导了琥珀酸盐、富马酸盐和苹果酸盐的积累（图 4B）。与 WT 相比，Irg1KO BMDMs 中琥珀酸盐和富马酸盐的积累较少。与 WT 相比，Irg1KO BMDMs 中苹果酸的积累更高（图 4B）。总之，这些研究结果表明，Irg1 基因缺失对 BMDMs 的整体代谢功能产生了微小但显著的负面影响，并影响了某些 TCA 循环代谢产物的积累。
在进一步研究中，作者测量了经 MPLA 处理后 TCA 代谢物中13C 标记葡萄糖的普遍掺入量（图 4C）。约 50%的衣康酸分子中掺入了标记的葡萄糖碳，而琥珀酸和苹果酸的标记率不到 10%。这些结果证明，在经 MPLA 处理的 BMDMs 中，衣康酸由葡萄糖和非葡萄糖碳源合成，而琥珀酸和苹果酸主要由非葡萄糖碳源合成。根据现有文献，非葡萄糖碳源很可能是谷氨酰胺，但要完全确定衣康酸、琥珀酸盐和苹果酸盐生物合成的非葡萄糖底物碳源还需要进一步研究（图 4D）。这一发现表明富马酸的生物合成机制被激活，而这些机制独立于传统的 TCA 循环生物合成途径。
实验结果3
Irg1敲除对巨噬细胞对MPLA的转录反应的影响
比较了经 MPLA 处理的 WT 和 Irg1KO BMDM 对 MPLA 的转录反应。主成分分析表明，基因型在每个时间点聚集在一起，对 MPLA 的转录反应随着时间的推移而演变，3dp MPLA 处理的 BMDMs 与对照组相似（图 5A）。与 Irg1KO BMDMs 相比，WT BMDMs 在 MPLA 处理后 4 和 24 h（而非 3dp）有更多基因上调和下调（图 5B）。在每个时间点，两种基因型上调和下调的基因本体（GO）通路有明显的重叠。在 MPLA 处理后的每个时间点，正向调节宿主对感染和炎症反应的通路在两种基因型中均上调（补充图 3）。与细胞分裂和 DNA 修复相关的通路下调。比较不同基因型（Irg1KO 与 WT）的 MPLA 诱导的 GO 通路发现，在 MPLA 处理后 4 小时内几乎没有差异，但在 MPLA 处理后 24 小时内，与 WT 相比，Irg1KO BMDMs 中与炎症、细胞因子产生和趋化相关的通路被上调（图 5C）。与 WT BMDMs 相比，在 MPLA 处理后 24 小时，Irg1KO BMDMs 中与溶酶体和吞噬体功能相关的通路相对抑制下调（图 5D）。KEGG 通路分析也显示，与 WT BMDMs 相比，Irg1KO BMDMs 经 MPLA 处理后，与吞噬体和溶酶体功能相关的通路下调。Irg1KO BMDMs中各通路下调的基因确定了与质子转运和吞噬溶酶体功能相关的功能。
在转录水平上，WT 和 Irg1KO BMDMs 对 LPS 处理的反应也相似（图 6）。PCA 显示不同基因型对 LPS 挑战的转录反应相似，但不完全重叠（图 6A）。PCA 还显示，MPLA 处理明显改变了两组对 LPS 的转录反应。DEGs 评估显示 LPS 在各基因型中诱导了相似的转录反应（图 6B）。与对照组 BMDMs 相比，用 MPLA 预处理 WT BMDMs 可减少 LPS 诱导的 DEGs 数量，而这种效应在 Irg1 BMDMs 中减弱（图 6B）。GO通路分析表明，在用LPS处理的WT和Irg1KO BMDMs中，类似的通路被激活和下调。调节先天免疫反应和宿主对感染的反应的通路在两种基因型中均上调，而调节细胞分裂的通路则下调。对MPLA处理的BMDMs中Irg1缺失所影响的GO通路的评估显示，与WT相比，Irg1KO BMDMs中与细胞对缺氧的反应和细胞因子活性相关的通路上调，而负向调节细胞因子产生和炎症的通路下调（图6）。
实验结果4
衣康酸有助于增强 MPLA 诱导的巨噬细胞对绿脓杆菌的杀伤力
通过检测 WT 和 Irg1KO BMDMs 吞噬和杀死绿脓杆菌的能力，评估了 Irg1 缺失对巨噬细胞杀死微生物的影响。细菌与 BMDMs 培养 15 分钟后，再与补充庆大霉素的培养基培养 15 分钟。清洗后，收获并裂解 BMDMs，将其内容物培养在胰蛋白酶大豆琼脂平板上，以测量细胞内存活的 CFU（图 7A）。将另一批洗净的巨噬细胞再培养 3 小时，然后收获、裂解并在琼脂平板上培养，以测量 CFU。15 分钟的时间点代表吞噬的细菌数量，3 小时的时间点提供杀死的细菌数量。对初始细菌量的评估显示，MPLA 显著增加了所有 3 种基因型的吞噬能力，不同基因型之间的吞噬能力没有明显差异（图 7B）。对最终 3 小时细菌负荷的评估显示，与最初的 15 分钟时间点相比，所有基因型的存活细菌数量都有所减少，这表明细菌被主动杀死，但与 WT 和 BLOC3 KO BMDMs 相比，Irg1KO BMDMs 中剩余的存活细菌数量明显更高（图 7C）。与用 MPLA 处理的 WT BMDMs 相比，用 MPLA 处理的 Irg1KO BMDMs 杀死的细菌数量明显少于用 MPLA 处理的 WT BMDMs（图 7D）。
为了确定杀灭能力的差异是否是由于溶酶体酸化造成的，用 1 μm 聚苯乙烯珠和 LPS 作为非感染性挑战来诱导吞噬溶酶体的形成。氯喹处理消除了LysoSensor检测到的酸化区，Irg1KO和WT BMDMs在MPLA处理和未处理的情况下溶酶体酸化没有差异。
实验结果5
衣康酸以 pH 依赖性方式抑制铜绿假单胞菌的生长，并通过 ROS 增强其抑制作用
研究旨在确定衣康酸是否会直接影响铜绿微囊藻的生长。在中性（pH 值为 7）和酸性（pH 值为 5）pH 值以及H2O2浓度递增的富培养基肉汤中培养铜绿假单胞菌（图 8）。衣康酸能抑制铜绿微囊藻在 pH 值为 5 的肉汤中的生长，但不能抑制 pH 值为 7 的肉汤中的生长，其抑制作用与浓度有关（图 8A）。衣康酸对铜绿假单胞菌生长的抑制作用因H2O2的浓度而增强（图 8B）。
