Chestnut Studying
摘要
Excessive DNA damage triggers various types of programmed cell death (PCD), yet the regulatory mechanism of DNA damage-induced cell death is not fully understood. Here, we report that PANoptosis, a coordinated PCD pathway, including pyroptosis, apoptosis and necroptosis, is activated by DNA damage. The Z-DNA binding protein 1 (ZBP1) is the apical sensor of PANoptosis and essential for PANoptosome assembly in response to DNA damage. We find endogenous retroviruses (ERVs) are activated by DNA damage and act as ligands for ZBP1 to trigger PANoptosis. By using ZBP1 knock-out and knock-in mice disrupting ZBP1 nucleic acid-binding activity, we demonstrate that ZBP1-mediated PANoptosis contributes to the toxic effects of chemotherapeutic drugs, which is dependent on ZBP1 nucleic acid-binding activity. We found that ZBP1 expression is downregulated in tumor tissue. Furthermore, in colorectal cancer patients, dsRNA is induced by chemotherapy and sensed by ZBP1 in normal colonic tissues, suggesting ZBP1-mediated PANoptosis is activated by chemotherapy in normal tissues. Our findings indicate that ZBP1-mediated PANoptosis is activated by DNA damage and contributes to the toxic side effects of DNA-damage-based chemotherapy. These data suggest that ZBP1 could be a promising therapeutic target to alleviate chemotherapy-related side effects.
过度的DNA损伤会引发各种类型的程序性细胞死亡（PCD），但DNA损伤诱导细胞死亡的调控机制尚未完全明了。在这里，我们报告了PANoptosis，一个协调的PCD途径，包括焦亡、凋亡和坏死性凋亡，被DNA损伤激活。Z-DNA 结合蛋白 1（ZBP1）是 PANoptosis 的顶端传感器，对 DNA 损伤时 PANoptosome 的组装至关重要。我们发现内源性逆转录病毒（ERV）会被DNA损伤激活，并作为ZBP1的配体触发PANoptosis。通过使用ZBP1基因敲除和基因敲入小鼠破坏ZBP1核酸结合活性，我们证明ZBP1介导的PANoptosis有助于化疗药物的毒性作用，而化疗药物的毒性作用依赖于ZBP1核酸结合活性。我们发现 ZBP1 在肿瘤组织中表达下调。此外，在结直肠癌患者中，dsRNA 被化疗诱导，并被正常结肠组织中的 ZBP1 感知，这表明 ZBP1 介导的 PANoptosis 在正常组织中被化疗激活。我们的研究结果表明，ZBP1 介导的 PANoptosis 被 DNA 损伤激活，并导致了基于 DNA 损伤的化疗的毒副作用。这些数据表明，ZBP1 可能是缓解化疗相关副作用的一个有前途的治疗靶点。
实验结果1
ZBP1 参与 DNA 损伤诱导的细胞死亡
众所周知，ZBP1 在感染和无菌条件下介导各种 PCD 途径。然而，ZBP1 是否参与 DNA 损伤诱导的细胞死亡尚不清楚。为了研究ZBP1在DNA损伤诱导的细胞死亡中的作用，作者首先使用野生型（WT）和ZBP1-null（ZBP1-/- ）小鼠真皮成纤维细胞（MDFs）来比较这些细胞对DNA损伤诱导的细胞死亡的敏感性。通过用不同的DNA损伤化合物处理细胞，包括拓扑异构酶抑制剂依托泊苷（ETO）、DNA烷化剂N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）、DNA交联剂顺铂（CDDP）和抗代谢抑制剂5-FU、 通过显微镜观察和碘化丙啶（PI）染色定量，作者发现与 WT MDFs 相比，ZBP1-/- MDFs 中 DNA 损伤诱导的细胞死亡明显减少（图 1a 和 b）。由于 ZBP1 控制多种类型 PCD 通路的激活，包括焦亡、坏死性凋亡和细胞凋亡，作者随后研究了这些类型的 PCD 是否在ZBP1-/- MDFs 中受到影响。通过检测 PCD 通路的常用标记物，包括代表细胞凋亡的 caspase-3 （Casp-3）裂解、代表坏死性凋亡的 MLKL 磷酸化和代表焦亡的 Gasdermin-D （GSDMD）或 E （GSDME）裂解、 作者发现在用 ETO、MNNG 和 CDDP 处理 WT MDFs 时，凋亡、坏死性凋亡和焦亡均被激活，而在ZBP1-/- MDFs 中，这些形式的 PCD 激活被抑制（图 1c-e）。此外，当在ZBP1-/- MDFs 中重建 ZBP1 表达时，这些细胞对 ETO 和 MNNG 诱导的细胞死亡的敏感性恢复得与 WT MDFs 相当（图1f）。此外，作者发现在 ZBP1 重组的 MDFs 中，Casp-3 的裂解、MLKL 的磷酸化和 GSDME 的裂解都在 ETO 和 MNNG 的处理下被重新激活（图1g 和 h）。因此，这些结果表明，ZBP1 在 DNA 损伤诱导的 PCD 途径（包括焦亡、凋亡和坏死性凋亡）中发挥着关键作用。
实验结果2
DNA 损伤通过促进 ZBP1-PANoptosome 组装诱导 PANoptosis
为了研究 ZBP1 在 DNA 损伤诱导的细胞死亡中的作用机制，作者首先通过检测 γH2AX 和 p53 的磷酸化测试了 ZBP1 是否参与了 DNA 损伤应答途径。作者发现，ZBP1 的缺失对 ETO 诱导的 γH2AX 和 p53 磷酸化没有影响，这表明 ZBP1 没有参与 DNA 损伤应答途径（图2a）。由于DNA损伤会诱导p53介导的细胞凋亡，作者接着检测了DNA损伤时ZBP1介导的细胞死亡是否依赖于p53信号。作者首先用 siRNA 敲除了 MDFs 中的 p53，发现敲除 p53 对 ETO 或 CDDP 诱导的细胞凋亡、坏死性凋亡和焦亡没有影响。为了进一步验证这些结果，作者用 p53 抑制剂 PFN-α 处理细胞，PFN-α 已被证明能保护大脑皮层神经元免受 ETO 诱导的凋亡。作者发现 p53 抑制剂 PFN-α 对 ETO 或 CDDP 诱导的 MDFs 细胞凋亡、坏死性凋亡和焦亡没有影响。因此，作作得出结论，在 MDFs 中，ZBP1 介导的细胞死亡与 p53 信号无关。
PANoptosis 是一种协调的细胞死亡途径，它整合了细胞凋亡、坏死性凋亡和焦亡的关键成分。由于作者发现 DNA 损伤诱导的焦亡、凋亡和坏死性凋亡都需要 ZBP1，因此作者接着研究了 DNA 损伤是否能够诱导 ZBP1 介导的 PANoptosis。在坏死性凋亡信号通路中，受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 3（RIPK3）是 MLKL 的关键上游激酶。作者发现 CRISPR/Cas9 介导的 RIPK3 基因敲除可部分保护 MDFs 免受 ETO 诱导的细胞死亡（图2b）。此外，RIPK3的敲除阻断了MLKL的磷酸化，但对ETO处理细胞中Casp-3和GSDME的裂解没有影响（图2c），这表明RIPK3对DNA损伤诱导的坏死性凋亡至关重要，但对细胞凋亡和焦亡并不重要。此外，与 WT MDFs 相比，ETO 诱导的 RIPK3 磷酸化在ZBP1-/-MDFs 中明显减弱（图2d ），表明 ZBP1 作用于 RIPK3 的上游以调控 DNA 损伤诱导的坏死性凋亡。之前有研究报道，Casp-6通过调节ZBP1-PANoptosome的组装，是病毒诱导的PANoptosis所必需的。为了检测 Casp-6 是否参与了 DNA 损伤诱导的细胞死亡，作者首先敲除了 MDFs 中的 Casp-6，结果发现 Casp-6 缺失可保护细胞免受 ETO 诱导的细胞死亡（图2e）。此外，与对照细胞相比，Casp-6敲除后，ETO诱导的Casp-3裂解、MLKL磷酸化和GSDME裂解均被抑制（图2f ），表明Casp-6是DNA损伤诱导的PANoptosis所必需的。
鉴于ZBP1在DNA损伤中调控RIPK3磷酸化，而Casp-6是DNA损伤诱导PANoptosis所必需的，作者接着检测了ZBP1是否能在DNA损伤时与RIPK3和Casp-6形成PANoptosome复合物。由于 ZBP1 抗体不利于免疫沉淀，作者使用 ZBP1 重组的 MDFs，在永生化的ZBP1-/-MDFs 中稳定表达 Flag 标记的 ZBP1 蛋白，并用抗 Flag 抗体进行免疫沉淀实验。如图2g 所示，ETO 处理后，RIPK3 和 Casp-6 蛋白均与 Flag 标记的 ZBP1 共沉淀，表明 DNA 损伤诱导 ZBP1-PANoptosome 组装。此外，尽管已有研究表明 RIPK1 对 DNA 损伤诱导的细胞凋亡和坏死性凋亡至关重要，但作者在 ZBP1-PANoptosome 复合物中检测不到 RIPK1 的存在，表明 RIPK1 并不参与 DNA 损伤诱导的 PANoptosis（图2g ）。此外，作者还发现 ZBP1 的表达在 ETO 或 CDDP 处理后下降，而其他蛋白包括 RIPK3、Casp-6 和 RIPK1 的表达在 ETO 或 CDDP 处理期间没有变化。综上所述，这些数据表明 DNA 损伤诱导 ZBP1-PANoptosome 组装以驱动 PANoptosis。
实验结果3
DNA损伤诱导的PANoptosome组装和PANoptosis需要ZBP1的Zα结构域
ZBP1 蛋白的 N 端含有两个 Zα 结构域（Zα1 和 Zα2），它们介导与左旋 Z-DNA 或 RNA 的相互作用。它的中心部分还含有两个受体相互作用蛋白同型相互作用结构域（RHIM），可介导与其他含 RHIM 结构域的蛋白如 RIPK1 和 RIPK3 的相互作用（图3a ）。为了研究 DNA 损伤时 ZBP1 如何感知信号触发 PANoptosis，作者产生了一种 ZBP1 的两个 Zα 结构域发生突变的基因敲入小鼠（ZBP1 mutZα1α2 ），从而表达了一种无法与 Z 型核酸相互作用的突变体 ZBP1。然后，作者从小鼠体内分离出 MDFs（MDF mutZα1α2），并比较了这些细胞与 WT MDFs 对 DNA 损伤诱导的细胞死亡的敏感性。通过显微镜观察和PI染色定量，作者发现与WT MDFs相比，DNA损伤诱导的细胞死亡在MDFs mutZα1α2中明显减少（图3b和c）。此外，MDF mutZα1α2细胞中ETO和MNNG诱导的Casp-3裂解、MLKL磷酸化和GSDME裂解均减弱（图3d和e），表明DNA损伤诱导的PANoptosis需要ZBP1的Zα结构域。
为了研究ZBP1的Zα结构域是否调控DNA损伤中PANoptosome的组装，作者用含有Zα结构域突变的Flag标记-ZBP1（Flag-ZBP1-mutZα1α2）重组了永生化的ZBP1-/-MDFs，并用抗Flag抗体进行了免疫沉淀实验。如图3f 所示，与 Flag-ZBP1 蛋白相比，Flag-ZBP1-mutZα1α2 蛋白在 ETO 处理后未能与 RIPK3 和 Casp-6 共沉淀，表明 DNA 损伤诱导的 PANoptosome 组装需要 ZBP1 的 Zα 结构域。因此，这些数据表明，DNA损伤诱导的PANoptosome组装和PANoptosis需要ZBP1的Zα结构域。
实验结果4
ZBP1 与 dsRNA 结合，促进 DNA 损伤中 PANoptosome 的组装
由于ZBP1的Zα结构域介导了Z型核酸与ZBP1的结合，作者随后研究了一些核酸信号是否由DNA损伤触发并为PANoptosome组装所必需。为了确定DNA损伤时ZBP1介导的PANoptosome组装需要DNA还是RNA，作者首先分别用DNase I降解DNA或RNase A降解RNA处理ZBP1重组的MDFs细胞裂解液，然后用抗Flag抗体进行免疫沉淀实验。作者发现只有 RNase A 处理会减弱 ZBP1 和 RIPK3 之间的相互作用（图4a ），这表明 DNA 损伤时 ZBP1-PANoptosome 组装需要 RNA。然后，作者用特异性抗dsRNA抗体J2进行免疫荧光染色，检测DNA损伤时是否会产生dsRNA。如图4b 所示，作者发现在 ETO 处理后，J2 抗体在细胞质中产生的信号明显增加。此外，该信号对 RNaseA 和 dsRNA 特异性 RNase III 处理敏感，而对 DNaseI 处理不敏感（图4b ），这表明 DNA 损伤诱导了 dsRNA 的产生。据报道，ZBP1 可通过其 Zα 结构域识别 Z 型核酸，因此作者用 Z 型 DNA 或 RNA 的特异性抗体（Z22）进行免疫荧光染色，以检测 ETO 诱导的 dsRNA 是否为 Z 型核酸。如图4c 所示，作者无法在 ETO 处理过的细胞中检测到 Z22 抗体产生的信号，尽管该抗体在用 CBL0137 处理过的细胞中能很好地检测到 Z 型 DNA，CBL0137 是哺乳动物细胞中 Z 型 DNA 的强效诱导剂。为了检测 DNA 损伤诱导的 dsRNA 是否能与 ZBP1 结合，作者在 ZBP1 重组的 MDFs 中进行了近接扩增试验（PLA）。使用针对dsRNA和Flag的抗体进行共焦成像显示，在Flag-ZBP1重组的MDFs中，dsRNA-Flag-ZBP1的结合明显增加，而在Flag-ZBP1-mutZα1α2重组的MDFs中，ETO处理后dsRNA-Flag-ZBP1的结合没有增加（图4d）。综上所述，这些数据表明，dsRNA 由 DNA 损伤诱导，可通过 ZBP1 的 Zα 结构域被 ZBP1 识别，从而触发 PANoptosome 组装。
实验结果5
ERV会因DNA损伤而转录上调，并成为ZBP1的配体
ERV 激活后，dsRNA 可通过 ERV RNA 与细胞反义转录本配对而形成。已经证实，ZBP1 可在无菌条件下识别来自 ERV 的 dsRNA，这对 ZBP1 的活化至关重要。为了检验ERV衍生的dsRNA是否参与了DNA损伤诱导的PANoptosis，作者首先考察了ERV元件是否被DNA损伤转录激活。通过检测未经处理的对照组和经ETO处理的MDFs的RNA-seq数据，作者发现了一组被ETO上调的逆转录转座子，其中大部分属于含长末端重复（LTR）的ERV（图5a）。重要的是，一些上调的ERV在有义和反义方向都有表达，且序列重叠，这提高了这些ERV配对并形成dsRNA的可能性（图5b）。然后，作者通过实时（RT）-RCR 分析进一步证实了 RNA-Seq 鉴定出的两个 ERV，即 RLTR45-int 和 RLTR1B-int，在 ETO 或 CDDP 处理后上调（图5c）。为了检测ERV衍生的dsRNA是否能与ZBP1结合，作者在ZBP1重组的MDFs中用Flag抗体进行了RNA免疫沉淀和RT-PCR实验。如图5d，作者发现在 ETO 或 CDDP 处理后，Flag-ZBP1 沉淀样品中的 RLTR1B-int 和 RLTR45-int 分别明显增加。这些数据共同表明，DNA损伤会使ERV转录上调，并能在DNA损伤时被ZBP1识别。
实验结果6
ZBP1 介导的 PANoptosis 促成了小鼠化疗引起的毒性
包括ETO、CDDP和5-FU在内的DNA损伤剂是癌症治疗中最有效的化疗药物之一，然而，这些有效化疗药物的临床应用却因其毒性不良反应而受到剂量的限制。由于作者发现了 DNA 损伤诱导的 ZBP1 介导的 PANoptosis，因此作者接着测试了 ZBP1 是否促成了化疗中使用的 DNA 损伤药物的不良反应。为此，作者通过向小鼠静脉注射 ETO 建立了化疗诱导毒性小鼠模型。作者发现 ETO 严重破坏了小肠的隐窝和绒毛，导致 WT 小鼠肺部血管严重损伤、中性粒细胞浸润和 IL-6 表达增加，而这些影响在ZBP1-/-和ZBP1 mutZα1α2小鼠中明显减弱（图6a-f）。此外，与ZBP1-/-和ZBP1 mutZα1α2小鼠相比，ETO 处理使 WT 小鼠的脾脏重量和脾脏淋巴细胞数量明显减少（图6g 和 h）。此外，腹腔注射 CDDP 还会导致 WT 小鼠小肠隐窝缺失、肺部血管损伤和中性粒细胞浸润增加以及脾脏淋巴细胞数量减少，而这些影响在ZBP1-/-和ZBP1 mutZα1α2小鼠中都得到了缓解。为了进一步证实 PANoptosis 参与了化疗诱导的毒性，作者接着检测了小鼠小肠中 Casp-3 的裂解、MLKL 的磷酸化和 GSDME 的裂解，结果发现在Zbp1-/-和ZBP1 mutZα1α2小鼠中，ETO 处理对这些 PANoptosis 标记的激活被阻断（图6i）。此外，作者还发现 ETO 和 CDDP 处理会诱导小鼠小肠产生 dsRNA（图6j）。然后，作者使用 J2 和 ZBP1 抗体进行了 PLA 检测，发现 ETO 或 CDDP 处理与对照处理相比，小鼠小肠中 PLA 的红色荧光信号明显增加，这表明化疗诱导的 dsRNA 可在体内被 ZBP1 识别（图6k）。综上所述，这些数据表明，ZBP1 缺失的 PANoptosis 是小鼠化疗诱导毒性和炎症的原因之一。
实验结果7
化疗诱导的dsRNA在结直肠癌（CRC）患者的非癌组织中被ZBP1感知
ZBP1 在肿瘤组织中的表达已被证明是下调的。与该研究一致，作者发现在所有检查过的人类癌细胞系中都没有 ZBP1 的表达（图7a）。此外，通过收集来自同一 CRC 患者的新鲜正常和肿瘤手术样本，作者发现与匹配的非癌结肠组织相比，ZBP1 在肿瘤中的表达显著降低或缺失，而 Casp-6、RIPK3 和 MLKL 在正常和肿瘤组织中的表达基本相当（图7b）。因此，这些数据表明，肿瘤可能通过下调 ZBP1 的表达来逃避 ZBP1 介导的细胞死亡，而 ZBP1 被剥夺的 PANoptosis 很可能被非癌组织中的化疗激活。
为了确定 ZBP1 衍生的 PANoptosis 是否被化疗激活，作者首先检测了 CRC 患者接受/未接受奥沙利铂化疗的正常结肠组织中 dsRNA 的表达，因为作者发现它可以被 ZBP1 识别以触发 PANoptosis。作者发现奥沙利铂化疗诱导了 dsRNA 的表达（图7c、d），而且 dsRNA 最有可能在肠隐窝细胞和免疫细胞中表达（图7c）。随后，作者使用dsRNA J2和白细胞共同抗原CD45抗体对这些样本进行了荧光免疫组化检测。作者发现部分dsRNA阳性细胞的CD45也呈阳性，这表明化疗诱导了免疫哨点细胞中的dsRNA。此外，在这些化疗后的正常结肠组织中，通过 PLA 检测发现了 dsRNA 与 ZBP1 的关联，表明化疗中 dsRNA 可被 ZBP1 感知（图7e）。为了确定癌症患者化疗是否会触发 ZBP1 衍生的 PANoptosome 组装，作者分别在结肠组织中进行了 PLA 检测，以考察 ZBP1 与 RIPK3 或 Casp-6 之间的关联。作者在化疗后的正常结肠组织中检测到了红色荧光聚乳酸信号，但在未化疗的正常结肠组织中却没有发现聚乳酸信号（图7f 和 g）。因此，这些数据表明化疗诱导的 dsRNA 可被 ZBP1 感知并触发 CRC 患者非癌组织中的 PANoptosis。
