Chestnut Studying
摘要
Background: Sepsis is often accompanied by lactic acidemia and acute lung injury (ALI). Clinical studies have established that high serum lactate levels are associated with increased mortality rates in septic patients. We further observed a significant correlation between the levels of cold-inducible RNA-binding protein (CIRP) in plasma and bronchoalveolar lavage fluid (BALF), as well as lactate levels, and the severity of post-sepsis ALI. The underlying mechanism, however, remains elusive.
Methods: C57BL/6 wild type (WT), Casp8−/−, Ripk3−/−, and Zbp1−/− mice were subjected to the cecal ligation and puncture (CLP) sepsis model. In this model, we measured intra-macrophage CIRP lactylation and the subsequent release of CIRP. We also tracked the internalization of extracellular CIRP (eCIRP) in pulmonary vascular endothelial cells (PVECs) and its interaction with Z-DNA binding protein 1 (ZBP1). Furthermore, we monitored changes in ZBP1 levels in PVECs and the consequent activation of cell death pathways.
Results: In the current study, we demonstrate that lactate, accumulating during sepsis, promotes the lactylation of CIRP in macrophages, leading to the release of CIRP. Once eCIRP is internalized by PVEC through a Toll-like receptor 4 (TLR4)-mediated endocytosis pathway, it competitively binds to ZBP1 and effectively blocks the interaction between ZBP1 and tripartite motif containing 32 (TRIM32), an E3 ubiquitin ligase targeting ZBP1 for proteasomal degradation. This interference mechanism stabilizes ZBP1, thereby enhancing ZBP1-receptor-interacting protein kinase 3 (RIPK3)-dependent PVEC PANoptosis, a form of cell death involving the simultaneous activation of multiple cell death pathways, thereby exacerbating ALI.
Conclusions: These findings unveil a novel pathway by which lactic acidemia promotes macrophage-derived eCIRP release, which, in turn, mediates ZBP1-dependent PVEC PANoptosis in sepsis-induced ALI. This finding offers new insights into the molecular mechanisms driving sepsis-related pulmonary complications and provides potential new therapeutic strategies.
背景：脓毒症通常伴有乳酸血症和急性肺损伤（ALI）。临床研究证实，高血清乳酸水平与脓毒症患者死亡率的增加有关。我们进一步观察到，血浆和支气管肺泡灌洗液（BALF）中冷诱导 RNA 结合蛋白（CIRP）的水平以及乳酸水平与脓毒症后 ALI 的严重程度之间存在明显的相关性。然而，其潜在的机制仍然难以捉摸。
研究方法：对 C57BL/6 野生型（WT）、Casp8-/-、Ripk3-/- 和Zbp1-/-小鼠进行盲肠结扎和穿刺（CLP）脓毒症模型试验。在该模型中，我们测量了巨噬细胞内 CIRP 的乳酸化和随后的 CIRP 释放。我们还追踪了肺血管内皮细胞（PVECs）细胞外 CIRP（eCIRP）的内化及其与 Z-DNA 结合蛋白 1（ZBP1）的相互作用。此外，我们还监测了肺血管内皮细胞中 ZBP1 水平的变化以及随之激活的细胞死亡途径。
结果：在目前的研究中，我们证明了脓毒症期间积累的乳酸会促进巨噬细胞中 CIRP 的乳酸化，从而导致 CIRP 的释放。一旦 eCIRP 通过 Toll 样受体 4 (TLR4) 介导的内吞途径被 PVEC 内化，它就会竞争性地与 ZBP1 结合，并有效地阻断 ZBP1 与含有三方基序 32 (TRIM32) 的 E3 泛素连接酶之间的相互作用，而 TRIM32 是一种靶向 ZBP1 进行蛋白酶体降解的 E3 泛素连接酶。这种干扰机制稳定了 ZBP1，从而增强了 ZBP1-受体相互作用蛋白激酶 3 (RIPK3) 依赖性 PVEC PANoptosis（一种涉及同时激活多种细胞死亡途径的细胞死亡形式），从而加剧了 ALI。
结论：这些发现揭示了乳酸血症促进巨噬细胞源性 eCIRP 释放，进而在脓毒症诱导的 ALI 中介导 ZBP1 依赖性 PVEC PANoptosis 的新途径。这一发现为脓毒症相关肺部并发症的分子机制提供了新的见解，并提供了潜在的新治疗策略。
实验结果1
血浆和 BALF 中外泌体 CIRP 的升高与脓毒症诱发的 ALI 的乳酸水平和严重程度有关
利用CLP脓毒症小鼠模型，作者观察到与假对照组相比，CLP小鼠血浆乳酸（图1a）和外泌体CIRP（图1b）显著增加。为了探索乳酸盐对外泌体 CIRP 生成的调控作用，作者在 CLP 后 6 小时向小鼠腹腔注射乳酸盐，以提高血清乳酸盐水平。如图1a、b 所示，与对照组相比，CLP 后 24 小时注射乳酸盐导致血浆乳酸盐和外泌体 CIRP 水平升高，肺损伤加重（图1c、d）。相反，草酸钠（OXA）是一种抑制乳酸生成的乳酸脱氢酶特异性抑制剂，它能显著减轻脓毒症引起的血浆乳酸（图1a）和外泌体 CIRP（图1b）的增加，同时还能改善脓毒症小鼠的肺损伤（图1c、d）。值得注意的是，假药组显示出正常的肺组织学，而用药物和乳酸盐处理的中电组则显示出明显的肺损伤，表现为炎症、水肿和组织损伤。OXA 治疗似乎减轻了这些病理变化（图1c、d）。进一步的相关性分析证实，在所有小鼠中，包括中毒性肺结核组和假肺结核组，外泌体 CIRP 与血浆乳酸水平之间存在正相关关系（图1e）。从小鼠BALF中提取外泌体并测量外泌体CIRP水平的其他实验进一步证实了抑制乳酸盐的产生可显著减少CLP诱导的外泌体CIRP的释放（图1f）。
在实际临床研究中也观察到了这些临床前发现。作者发现血浆和 BALF 中的外泌体 CIRP 水平与乳酸盐水平、脓毒症后 ALI 的严重程度之间存在明显的相关性。作者从脓毒症诱发 ALI 患者（n= 60）和健康对照组（n= 30）的血浆中分离出了外泌体。使用酶联免疫吸附试验（ELISA）对血浆外泌体 CIRP 的浓度进行了定量分析，结果显示，与健康对照组相比，脓毒症诱发的 ALI 患者组血浆外泌体 CIRP 的浓度明显升高（图1g）。接收者操作特征曲线（ROC）分析显示，外泌体 CIRP 的曲线下面积（AUC）为 0.832（图1h），这表明它有可能成为脓毒症诱发 ALI 的可靠诊断标志物。
作者进一步将患者分为存活组（n= 22）和非存活组（n= 16）。值得注意的是，非存活组的外泌体 CIRP 水平高于存活组（图1i）。外泌体 CIRP 的预后准确性体现在 ROC 曲线上的 AUC 为 0.734（图1j），显示了预测患者预后的灵敏度和特异性。因此，血浆外泌体 CIRP 水平的升高与脓毒症引起的 ALI 密切相关，并与患者的不良预后相关。
临床研究证实，血清乳酸水平高与脓毒症患者死亡率增加有关。作者的研究结果与此相吻合，表明在脓毒症患者中，与存活组相比，非存活组的乳酸水平明显升高（图1k）。此外，作者还发现血浆外泌体 CIRP 与乳酸盐水平呈显著正相关（图1l），这凸显了外泌体 CIRP 作为脓毒症严重程度生物标志物的潜力。
为了进一步研究外泌体 CIRP 与肺损伤之间的联系，作者从脓毒症诱发 ALI 患者的 BALF 中分离出了外泌体。与未接受脓毒症支气管镜检查的对照组患者（n= 3）相比，脓毒症诱发 ALI 组患者 BALF 中的外泌体 CIRP 水平明显更高（图1m）。作者扩大了分析范围，将脓毒症诱发的 ALI 患者（n= 12）与非脓毒症 ALI 对照组（n= 6）进行对比，观察到脓毒症诱发的 ALI 组 BALF 中外泌体 CIRP 水平升高（图1n）。这些数据表明，外泌体 CIRP 与脓毒症肺损伤之间存在重要联系。
为了阐明外泌体 CIRP 的来源，我们对脓毒症小鼠和假手术小鼠（n= 3）的肺组织进行了单细胞 RNA 测序。利用均匀流形近似和投影（UMAP），作者根据已建立的细胞类型特异性标记基因的表达谱确定了细胞簇（图1o）。单细胞 RNA 测序分析显示肺组织内存在明显的细胞集群，在 CLP 小鼠肺部的各种细胞中都能检测到Cirp和Ldha的表达上调（图1p、q），而巨噬细胞群则表现出 CIRP 的主要表达。
实验结果2
巨噬细胞中 ATF4 上调的 CIRP 的乳酸化促进脓毒症中 CIRP 的释放
脓毒症后肺组织的组织学分析显示肺泡巨噬细胞浸润明显增加，同时在 24 小时后观察到 CIRP 表达显著升高（图2a、b）。Western 印迹显示，与假组相比，CLP 后 BALF 中巨噬细胞的 CIRP 表达明显升高（图2c）。
接下来，作者观察到脓毒症小鼠肺部内质网（ER）应激相关蛋白明显上调，包括 p-PERK、p-eIF2α、ATF4 和 CHOP。这些发现与 LPS 挑战后巨噬细胞中出现的 ER 肿胀和空泡化一致。利用加州大学圣克鲁斯分校（UCSC）、PROMO和 JASPAR 的生物信息学工具，作者在Cirp启动子区域内发现了 3 个推定的 ATF4 结合基序，分别标记为位点 A、B 和 C（图2d）。通过荧光素酶报告实验，作者证实 ATF4 可直接与这些位点结合并增强Cirp启动子的活性。在这些位点上引入的单个突变的效果较弱，而三重突变（位点 A、B 和 C 合并）则会削弱 ATF4 介导的Cirp转录激活（图2e）。此外，作者通过染色质 IP 和 qPCR 监测 ATF4 与Cirp启动子的结合情况，揭示了 ATF4 在Cirp表达的转录调控中的作用。基因敲除实验进一步明确了 ATF4 在 LPS 刺激下调节 CIRP 水平的关键作用（图2f）。
此外，作者还发现 LPS 诱导巨噬细胞中的 CIRP 从细胞核转位到细胞质（图2g），用 10 mmol/L 乳酸盐处理巨噬细胞时也观察到这种效应（图2h），这表明细胞质中的 CIRP 被浓缩并进入外泌体途径以便随后释放。
最近的一项研究表明，乳酸可促进巨噬细胞中高迁移率基团框 1（HMGB1）的乳酸化及其随后通过外泌体分泌。作者在有或没有 OXA 的情况下用 LPS 处理巨噬细胞，并检测了细胞提取物中的乳酸化水平。结果表明，LPS 增加了乳酸的生成（图2i），并显著提高了巨噬细胞中泛乳酸化蛋白的水平（图2j）。
如图2k 所示，LPS 能显著提高细胞上清液中 eCIRP 的水平，而 OXA 能逆转这种效应。为了确定乳酸是否是 LPS 诱导 CIRP 乳酸化的介质，作者在 LPS 刺激前使用 OXA 抑制了内源性乳酸的产生。这一干预措施大大降低了 LPS 在巨噬细胞中诱导的 CIRP 乳酸化（图2k）。免疫荧光染色显示，LPS 促进了 Klac 和 CIRP 在肺泡巨噬细胞胞浆内的共定位（图2l）。为了验证 Klac 与 CIRP 的直接相互作用和乳酸化，作者进行了 PLA，只有当 Klac 靠近 CIRP 时才会产生阳性信号（红色免疫荧光点）。结果显示，Klac 与 CIRP 之间存在直接相互作用，而 OXA 则显著降低了巨噬细胞中 LPS 诱导的 CIRP 乳酸化（图2m）。IP 数据显示，LPS 能显著提高 CIRP 免疫复合物中 Klac 的水平（图2n），LPS 刺激后，在 Klac 免疫复合物中也能检测到高水平的 CIRP 表达（图2o）。
总之，脓毒症会诱导巨噬细胞内乳酸的积累，导致 CIRP 的乳酸化。这种翻译后修饰促进了 CIRP 从细胞核到细胞质的转运及其随后的释放。
实验结果3
TLR4 在 MPVEC 中介导 eCIRP 的内吞作用
CIRP 是一种内源性 DAMP 分子，主要通过受体结合激活信号通路而被认为是一种炎症放大器 。然而，作者观察到 MPVECs 在暴露于 LPS 后会迅速内吞 CIRP。用与绿色荧光蛋白（GFP，10 µg/ml）连接的 CIRP 处理 MPVEC，可在处理后短短 5 分钟内诱导 CIRP-GFP 内化。CIRP-GFP 的这种内化是由 CIRP 本身介导的一种特异性吞噬作用，因为 GFP 本身没有表现出任何内化（图3a）。值得注意的是，在浓度为 10 µg/ml 时，观察到 CIRP-GFP 有明显的内吞作用（图3b）。
先前的研究发现 TLR4 是 CIRP 的受体。LPS 可诱导 TLR4 内化。为了进一步阐明 CIRP 内化的机制，作者观察到 CIRP 的内吞是由 LPS 介导的。用dynamin抑制剂dynasore处理细胞可有效阻止CIRP内化，从而证实其转运需要依赖于dynamin的途径（图3c）。
为了确定 CIRP-GFP 内化是否是受体依赖过程，作者从Tlr2-/-和Tlr4-/-小鼠体内分离出 MPVECs，随后用 CIRP-GFP 处理。结果表明，缺乏Tlr4会阻止 CIRP 内化，而缺乏Tlr2则不会影响 CIRP 内化（图3d、e），这表明在 LPS 存在的情况下，CIRP 的内化依赖于 TLR4。LPS 结合蛋白和 CD14 可促进 LPS 与 TLR4 的识别和结合，形成 LPS-TLR4- 髓样分化因子 2（MD2）复合物，启动内吞。该复合物与 LPS 结合后，通过适配蛋白（如髓样分化初级反应 88（MyD88）和含 TIR 域的适配诱导干扰素-β（TRIF））触发细胞内信号通路，导致内吞。在内吞过程中，作者还观察到 CIRP-GFP 与 TLR4 显著共定位（图3f），进一步证明了 TLR4 在 CIRP 胞内转运中的重要作用。
为了追踪内化的 CIRP-GFP 在 MPVECs 内的转运情况，作者注意到 EEA1 与 CIRP 在 LPS 处理后 1 h 内显著共定位（图3g）。60 分钟后，CIRP 与 EEA1 之间的皮尔逊系数下降，表明随着时间的推移，CIRP 会从早期内体迁移到其他细胞内区室（图3g）。
总之，这些研究结果表明，在脓毒症期间，TLR4 介导了 CIRP 的内吞，从而通过 dynamin 依赖性途径启动了 MPVECs 中的这一过程。
实验结果4
LPS 和 eCIRP 诱导 MPVEC PANoptosis
为了研究 MPVEC 的死亡机制，我们评估了 LPS 和 CIRP 在激活 PANoptosis 通路中的作用，PANoptosis 通路是细胞死亡的综合程序，包括焦亡、凋亡和坏死性凋亡。
经 LPS 和 rmCIRP 处理的 MPVEC 表现出多种形式的细胞死亡，包括焦亡、凋亡和坏死性凋亡。焦亡表现为出现裂解的 GSDMD 片段 P30 和 P20，CASP1 的活化表现为其 P20 形式和 AIM2 水平的升高（图4a）。此外，IL-1β 的分泌和乳酸脱氢酶的释放也有所增加。细胞凋亡的特征是 CASP3 断裂为 P17 片段，CASP8 断裂为 P18 形式（图4a）。坏死性凋亡与 MLKL 以及 RIPK3 和 RIPK1 的磷酸化有关（图4a）。
对 LPS 和 rmCIRP 处理的单独效应和协同效应的对比分析表明，共同处理显著放大了焦亡和凋亡的激活（图4b），同时也增加了共同处理后 48 小时的 MLKL 磷酸化（图4b）。在 LPS 和 rmCIRP 共处理后 48 小时，作者注意到 ASC斑点与 CASP8 和 RIPK3 在同一细胞内共定位，形成一个称为 PANoptosome 的复合物（图4c）。这些结果支持了 eCIRP 在介导 PVEC PANoptosis 中的作用
实验结果5
ZBP1 调节 PVEC PANoptosis 对 LPS 和 rmCIRP 的反应
ZBP1 已被确定为细胞质双链 DNA 的关键传感器和炎性体激活的介质，导致 PANoptosis 的诱导。最近的研究强调了 ZBP1 参与介导细胞对各种应激信号（包括病毒感染和炎症刺激）的死亡反应。鉴于 ZBP1 在这些过程中的关键作用，作者推测在脓毒症诱导的炎症过程中，ZBP1 也可能在 PVECs 对 LPS 和 eCIRP 的 PANoptosis 反应中发挥重要作用。
如图5a 所示，WT MPVECs 暴露于 LPS 和 rmCIRP 挑战时 ZBP1 的诱导性得到了证实。我们使用 ZBP1 缺陷细胞在 LPS 和/或 rmCIRP 处理后评估了 ZBP1 在 eCIRP 介导的 PANoptosis 中的作用。基因消减 ZBP1 能显著减少 LPS 和 rmCIRP 诱导的细胞死亡（图5b）。
此外，作者还研究了 ZBP1 的缺乏如何影响细胞死亡途径。与 WT 细胞相比，经 LPS 和 rmCIRP 处理后，Zbp1-/-MPVEC 细胞中 GSDMD、CASP1、AIM2、CASP3 的 P17 亚基和 CASP8 的 P18 亚基的裂解减少，MLKL 的磷酸化也降低了（图5c）。先前有研究报道，ZBP1 可调控炎性体活化以应对病原体或热应激，炎性体可作为 PANoptosome 的组成成分驱动 PANoptosis。因此，作者研究了 WT 和Zbp1-/-MPVECs 经 LPS 和 rmCIRP 处理后炎性小体的活化情况。PANoptosome 复合物的形成由 ASC斑点与 CASP8 和 RIPK3 的共聚焦显示，在 ZBP1 缺失的情况下，PANoptosome 复合物的形成被明显破坏。WT 细胞表现出明显的共聚焦，而Zbp1-/-细胞则表现出 PANoptosome 复合物形成的明显减少（图5d）。总之，这些发现证实 ZBP1 是炎症细胞死亡的核心调节因子。
实验结果6
ZBP1 介导线粒体损伤和细胞死亡，导致脓毒症诱发的体内急性呼吸道感染死亡
最近的一项研究表明，线粒体损伤是细胞死亡的关键。为了阐明 ZBP1 在脓毒症诱导的 ALI 体内发病机制中的作用，作者在通过气管内灌注非致死剂量 LPS 的同时静脉注射了 rmCIRP。在 WT 小鼠中，LPS 和 rmCIRP 的联合治疗导致线粒体结构显著异常，主要表现为嵴破坏、肿胀和空泡化。此外，MPVECs 中线粒体活性氧（ROS）增加，表明线粒体受损。这种功能障碍在Zbp1-/-小鼠中明显减少，突显了 ZBP1 在脓毒症期间线粒体介导的细胞死亡进展中的关键作用（图6a-c）。
肺组织的组织学检查显示，WT 小鼠在接受 LPS 和 rmCIRP 联合治疗后肺损伤严重，而Zbp1-/-小鼠则表现出肺部结构的保留和较低的肺损伤评分（图6d）。脓毒症诱导的 ALI 的存活率分析表明，与 WT 小鼠相比，Zbp1-/-小鼠的存活率明显更高（图6e）。
图6f 说明Zbp1-/-抑制了 WT 小鼠脓毒症挑战时 BALF 中 IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和 IL-1β 浓度的增加，这表明 ZBP1 在加剧 ALI 相关炎症级联中的作用。免疫荧光染色显示，在 WT 小鼠中形成了与 EC 标记 CD31 共定位的 ASC斑点，而在Zbp1-/-小鼠中则明显缺失（图6g），这表明由于 ZBP1 的缺失，炎性体和 MPVECs 死亡反应减少。ASC 与 CD31 的共定位表明，炎性体的激活特异性地发生在 ECs 中，从而在脓毒症诱导的 ALI 期间对血管内皮的炎症过程和细胞死亡途径都有贡献。
综上所述，这些结果表明 ZBP1 介导的 PANoptosis 导致了脓毒症诱发的 ALI 的病理变化和死亡率，凸显了 ZBP1 在这种疾病的发病机制中的重要作用。
实验结果7
MPVEC PANoptosome 需要 ZBP1 激活的 RIPK3
据报道，ZBP1 是介导 PANoptosome 形成的上游效应物，而 PANoptosome 则执行 PANoptosis。在本研究中，作者发现 LPS 和 rmCIRP 在 MPVECs 中诱导 ZBP1 与 RIPK3 显著共定位（图7a、b），表明 ZBP1 PANoptosome 复合物组装的启动。图7c 进一步说明，Zbp1-/-阻止了 MPVECs 对 LPS 和 rmCIRP 的死亡，而RIPK3的缺失也导致细胞死亡的减少。
在 WT、Zbp1-/- 和Ripk3-/-基因型的原代 MPVEC 中进行的 IP 检测显示，在 ZBP1 存在的情况下，形成了由 RIPK3、ASC、AIM2、CASP8 和 CASP3 组成的多蛋白 PANoptosome 复合物。Zbp1或Ripk3的缺失会破坏这种复合体的形成（图7d），这表明炎症小体成分整合在多蛋白 PANoptosome 复合体中，并对 LPS 和 rmCIRP 的刺激做出反应，以驱动炎症细胞死亡。
利用体内 CLP 模型，作者发现Zbp1和Ripk3的缺乏减轻了脓毒症诱发的 ALI 的严重程度（图7e）。CLP后的存活率分析表明，与WT小鼠相比，Zbp1和Ripk3缺乏的小鼠存活率更高（图7f）。
总之，ZBP1 介导的信号诱导 RIPK3 和 CASP8 与 ASC 相互作用形成 ZBP1 PANoptosome，从而触发 PANoptosis 对 LPS 和 rmCIRP 作出反应。
实验结果8
TRIM32 是一种 ZBP1 E3 泛素 (Ub) 连接酶，可破坏 ZBP1 的稳定性
为了确定影响 ZBP1 功能的调控分子，我们采用了蛋白质组筛选方法来分离一批推定的 ZBP1 相互作用体。首先，用 Flag-ZBP1 质粒转染 MPVECs，建立过表达 ZBP1 的细胞系（图8a）。然后通过质谱分析这些细胞裂解物中 ZBP1 的免疫沉淀物，以确定相互作用的伙伴。京都基因与基因组百科全书》（KEGG）对这些蛋白的通路分析表明，泛素介导的蛋白水解等通路显著富集，促使我们关注泛素化相关的生物过程（图8b）。
为了验证免疫沉淀和质谱分析的结果，作者在一个同源系统中进行了共免疫沉淀分析，重点研究了 E3 Ub 连接酶 TRIM32。TRIM32 和 ZBP1 之间的直接相互作用通过这些实验得到了证实（图8c），相互 IP 进一步证实了这种相互作用的特异性（图8d）。此外，谷胱甘肽 S 转移酶（GST）亲和分离试验确定 ZBP1 直接与 TRIM32 相互作用，TRIM32 与 GST-ZBP1 的共纯化证明了这一点（图8e），从而确立了 ZBP1 与 TRIM32 之间的物理联系。
免疫荧光研究表明，TRIM32 与 ZBP1 在细胞内共定位，线扫描分析也证实了它们的接近性，这表明它们在细胞环境中发生了功能性相互作用（图8f）。用环己亚胺（CHX，100 μmol/L）药理抑制新蛋白质合成会导致 ZBP1 蛋白水平随时间下降，这在过表达 TRIM32 的细胞中更为明显（图8g）。相比之下，在敲除TRIM32的细胞中，ZBP1 蛋白水平明显保持稳定（图8h）。这表明 TRIM32 加速了 ZBP1 的泛素依赖性降解。此外，在 CHX 存在的情况下，蛋白酶体抑制剂 MG132 明显改善了 GST-TRIM32 过表达引起的 ZBP1 水平的下降，这表明蛋白酶体介导的降解在 ZBP1 泛素化中的作用（图8i）。此外，体外泛素化实验表明，GST-TRIM32 的过量表达显著扩大了 ZBP1 的多泛素化，从而证明 TRIM32 具有针对 ZBP1 的 E3 连接酶活性（图8j）。
这些结果加强了 TRIM32 作为 E3 Ub 连接酶促进 ZBP1 降解的功能，突出了它作为该蛋白翻译后调节剂的重要作用。
实验结果9
eCIRP 阻止 TRIM32 介导的 ZBP1 多泛素化和蛋白酶体降解
为了解决 rmCIRP 如何促进 ZBP1 信号转导的问题，作者旨在确定 CIRP 是否直接与 ZBP1 相互作用。Co-IP 分析显示，在 LPS 和 rmCIRP 的共同作用下，细胞沉淀物中形成了 CIRP 和 ZBP1 蛋白复合物（图9a）。PLA 和共聚焦免疫荧光显微镜进一步证实了这种相互作用。作者观察到，与仅用 LPS 处理的细胞相比，用 rmCIRP 和 LPS 处理的 MLVEC 细胞胞质中 ZBP1 与 eCIRP 的共聚焦明显增加（图9b、c）。
经 CHX 处理并通过 Western 印迹法测定的蛋白质稳定性检测结果显示，在 LPS 刺激 6 小时后，ZBP1 水平开始上升，随后随着时间的推移而下降。然而，eCIRP 的存在减缓了 ZBP1 的下降，这表明 eCIRP 可保护 ZBP1 免受 LPS 诱导的降解（图9d）。此外，蛋白酶体抑制剂 MG132 的存在显著增加了 CHX 介导的蛋白合成抑制后的 ZBP1 水平，表明 ZBP1 会被蛋白酶体降解（图9e）。在 LPS 刺激下，作者注意到 TRIM32 发生泛素化，而在正常情况下没有泛素化。IP 结果表明，LPS 刺激时 ZBP1 多泛素化水平增加，而加入 eCIRP 后，Ub-TRIM32 显著降低了 LPS 诱导的 ZBP1 多泛素化（图9f），强调了 eCIRP 在脓毒症期间对 ZBP1 泛素化的抑制作用。
重要的是，PLA 和共聚焦免疫荧光显微镜显示，在 LPS 诱导的条件下，有 eCIRP 存在时 ZBP1 与 TRIM32 的结合显著减少（图9g、h）。这些数据表明，eCIRP 保护了 ZBP1 免受 TRIM32 介导的泛素化和随后的蛋白酶体降解，从而促进了 ZBP1 介导的细胞死亡。
