Chestnut Studying
摘要
Myocardial ischemia-reperfusion injury (MIRI) significantly worsens the outcomes of patients with cardiovascular diseases. Dexmedetomidine (Dex) is recognized for its cardioprotective properties, but the related mechanisms, especially regarding metabolic reprogramming, have not been fully clarified. A total of 60 patients with heart valve disease are randomly assigned to Dex or control group. Blood samples are collected to analyze cardiac injury biomarkers and metabolomics. In vivo and vitro rat models of MIRI are utilized to assess the effects of Dex on cardiac function, lactate production, and mitochondrial function. It is found that postoperative CK-MB and cTNT levels are significantly lower in the Dex group. Metabolomics reveals that Dex regulates metabolic reprogramming and reduces lactate level. In Dex-treated rats, the myocardial infarction area is reduced, and myocardial contractility is improved. Dex inhibits glycolysis, reduces lactate, and improves mitochondrial function following MIRI. Lactylation proteomics identifies that Dex reduces the lactylation of Malate Dehydrogenase 2（MDH2), thus alleviating myocardial injury. Further studies reveal that MDH2 lactylation induces ferroptosis, leading to MIRI by impairing mitochondrial function. Mechanistic analyses reveal that Dex upregulates Nuclear Receptor Subfamily 3 Group C Member 1（NR3C1) phosphorylation, downregulates Pyruvate Dehydrogenase Kinase 4 (PDK4), and reduces lactate production and MDH2 lactylation. These findings provide new therapeutic targets and mechanisms for the treatment for MIRI.
心肌缺血再灌注损伤（MIRI）会严重恶化心血管疾病患者的预后。右美托咪定（Dex）被认为具有心脏保护作用，但其相关机制，尤其是代谢重编程机制尚未完全阐明。共有 60 名心脏瓣膜病患者被随机分配到右美托咪定或对照组。收集血液样本以分析心脏损伤生物标志物和代谢组学。利用体内和体外 MIRI 大鼠模型评估 Dex 对心脏功能、乳酸生成和线粒体功能的影响。研究发现，Dex 组术后 CK-MB 和 cTNT 水平明显降低。代谢组学显示，Dex 可调节代谢重构，降低乳酸水平。经 Dex 治疗的大鼠心肌梗死面积缩小，心肌收缩力提高。Dex 可抑制糖酵解，降低乳酸水平，并改善 MIRI 后的线粒体功能。乳酸化蛋白质组学发现，Dex可减少苹果酸脱氢酶2（MDH2）的乳酸化，从而减轻心肌损伤。进一步研究发现，MDH2乳酸化诱导铁死亡，通过损害线粒体功能导致MIRI。机理分析表明，Dex能上调核受体3亚族C群成员1（NR3C1）磷酸化，下调丙酮酸脱氢酶激酶4（PDK4），减少乳酸生成和MDH2泌乳化。这些发现为MIRI的治疗提供了新的治疗靶点和机制。
实验结果1
右美托咪定通过代谢重编程降低心肺旁路手术患者的乳酸水平
在心肺旁路（CPB）手术中，心脏供血暂时中断，可能导致潜在的心肌缺血再灌注损伤（MIRI）。因此，作者纳入了 60 名确诊患有心脏瓣膜病并在 CPB 下接受瓣膜置换手术的患者。这 60 名患者按 1:1 的比例随机分为右美托咪定组和 Con 组。作者分别在术前（pre）和术后（post）采集静脉血，测量心脏损伤生物标志物 CK-MB 和 C-TNT，以及代谢组学（图 1A）。结果显示，Con组和右美托咪定组的CK-MB和C-TNT水平在术前均较低（组间无统计学差异），但在术后显著升高（图1B,C）。然而，与 Con 组相比，右美托咪定组术后 CK-MB 和 C-TNT 水平明显降低（图1B，C），这表明右美托咪定能有效降低 MIRI。
代谢组学的研究旨在探讨右美托咪定是否通过调节代谢重编程赋予心脏保护作用。主成分分析（PCA）结果表明，Con组和右美托咪定组在手术前后存在显著的代谢差异（图1D,E）。作者在Con-pre组和Con-post组之间发现了232个差异表达（DE）代谢物，它们富集在糖酵解/葡萄糖生成、TCA循环、丙酮酸代谢、铁死亡和谷胱甘肽代谢途径中。同样，Con-post组和Dex-post组之间有247个DE-代谢物，富集于相同的代谢途径（筛选DE-代谢物的标准：VIP>1，P值<0.05）（图1F,G），提示糖酵解激活和铁死亡可能是导致MIRI的关键原因，而右美托咪定降低MIRI的机制可能与调节糖酵解和TCA循环重编程以及抑制铁死亡有关。代谢组学显示，术后第三天乳酸水平明显升高，而右美托咪定组术后乳酸水平明显低于 Con 组（图1H，M ）。这一发现表明，右美托咪定可能通过代谢重编程影响乳酸水平。此外，ROC 曲线结果显示，乳酸对术前和术后，以及对右美托咪定后和 Con 后都有很好的鉴别能力。这些结果表明，乳酸可能是 MIRI 的潜在生物标记物（图1N、O）。
实验结果2
右美托咪定通过下调乳酸盐水平改善线粒体功能并降低 MIRI
作者构建了大鼠 MIRI 模型，并观察了右美托咪定的保护作用。结果显示，与Con组相比，I/R损伤显著损害心功能，表现为心肌梗死面积显著增加（图 2A,B），心肌收缩力明显下降，LVEF降低（图2C-E）。然而，与 I/R 组相比，右美托咪定能有效缓解 MIRI，表现为心肌梗死面积缩小、心肌收缩力增强和 LVEF 升高（图2A-E）。此外，作者
还利用OGD/R在细胞水平建立了I/R模型，并分析了OGD/R和右美托咪定处理对心肌细胞代谢重编程的影响。结果显示，OGD/R 导致糖酵解率显著升高，线粒体耗氧率（OCR）降低，而右美托咪定处理均可缓解这些现象（图2F,G）。此外，作者还发现 MIRI 增加了心肌细胞中的乳酸水平，而右美托咪定则有效抑制了乳酸的产生（图2H）。
此外，作者还研究了 OGD/R 和 Dex 处理对心肌线粒体结构和功能的影响。透射电镜和共聚焦显微镜结果显示，与 Con（Nor）组相比，I/R（OGD/R）引起线粒体结构异常，其特征是线粒体空泡化增加、嵴破坏和线粒体破碎，而右美托咪定能有效改善线粒体形态并减少线粒体破碎（图2I,J ）。此外，OGD/R诱导心肌细胞线粒体功能障碍，表现为线粒体膜电位降低、活性氧（ROS）产生增加和ATP水平降低，而右美托咪定处理后这些问题都得到了改善（图2K-M）。这些结果表明，MIRI后右美托咪定的保护作用可能与调节代谢重编程、抑制乳酸生成和改善线粒体功能有关。
为了进一步验证乳酸在这一过程中的作用，作者通过添加外源乳酸（乳酸钠，Lac）对细胞和大鼠进行预处理，以直接上调乳酸水平。结果表明，乳酸浓度≥10 mm时会显著降低心肌细胞的存活率。此外，作者还发现，乳酸给药能有效抵消右美托咪定对 I/R 大鼠心肌损伤的保护作用。与右美托咪定组相比，右美托咪定 + Lac 组的心肌梗死面积显著增大，心肌收缩力下降，LVEF 降低（图2N-R）。同样，乳酸给药抵消了 Dex 对 OGD/R 处理细胞线粒体结构和功能的保护作用。与 Dex 组相比，Dex + Lac 增加了线粒体碎片，降低了线粒体膜电位，升高了 ROS 生成，抑制了线粒体 OCR，减少了 ATP 生成。这些结果表明，右美托咪定可通过下调乳酸水平改善线粒体功能并降低 MIRI。
实验结果3
右美托咪定下调了 MDH2 的乳酸化作用
乳酸通过影响蛋白质赖氨酸乳酸化来调控细胞功能（Kla）。因此，作者收集了 I/R 和右美托咪定大鼠的心肌组织，并进行了乳酸化蛋白质组学研究（图 3A）。共鉴定了 238 个蛋白质中的 1026 个乳酸化位点，其中对 167 个蛋白质中的 731 个乳酸化位点进行了量化。图3B 显示了每个蛋白质中 Kla 位点的数量。接下来，作者使用 iceLogo 工具分析了已鉴定的 Kla 位点周围的氨基酸与所有人类背景序列的对比情况。在 Kla 位点的 -1 和 +1 位置发现了显著富集的丙氨酸和天冬氨酸（图3C）。差异分析的火山图显示，与 I/R 组相比，446 个乳酸化修饰的肽段显著上调，但右美托咪定组中 554 个乳酸化修饰的肽段显著下调（图3D ）。对差异蛋白进行GSEA通路富集分析发现，TCA循环通路被显著富集（图3E ），表明右美托咪定可能调控TCA循环相关蛋白的乳酸化。利用蛋白-蛋白相互作用（PPI）分析对关键蛋白进行评分和筛选，作者发现苹果酸脱氢酶 2（MDH2）是已鉴定的 Kla 蛋白中的枢纽蛋白（图3F）。MDH2是位于线粒体基质中的一种关键酶，在TCA循环中起着至关重要的作用。免疫荧光和WB分析证实MDH2定位于线粒体中。乳酸化蛋白质组学分析发现，与 I/R 组相比，右美托咪定组 MDH2 的 Lys241（K241）位点显著下调（图3G-I ）。MDH2 K241在不同物种中高度保守（图3J）。这些结果表明，右美托咪定可以下调 MIRI 中 MDH2 的乳酸化。
实验结果4
右美托咪定通过下调 MDH2 K241 乳酸化改善线粒体功能从而减轻 MIRI
作者通过采集心肌组织并使用泛抗体检测总蛋白乳酸化水平，验证了乳酸化蛋白质组学的结果。结果表明，MIRI 会导致心肌细胞中乳酸化的上调，而右美托咪定会下调这种上调（图 4A ）。此外，作者利用免疫沉淀法评估了 MDH2 的乳酸化水平，发现 MIRI 显著增加了 MDH2 的乳酸化，而 Dex 处理则抑制了 MDH2 的乳酸化，这与乳酸化蛋白质组学的结果一致（图4B）。由于 MDH2 主要定位于线粒体，作者采用线粒体乳酸探针 Fila-Mit来评估不同条件下线粒体乳酸水平的变化。结果表明，OGD/R 能显著提高 H9c2 细胞线粒体乳酸水平，而右美托咪定能有效降低线粒体乳酸水平。此外，在右美托咪定组中加入乳酸可增加线粒体乳酸水平，而敲除 MCT1 可有效降低线粒体乳酸水平。为了明确 MDH2 K241 位点的乳酸化功能，作者分别利用腺相关病毒和慢病毒在体内和体外构建了 MDH2 点突变大鼠和细胞。先前的研究表明，将赖氨酸（K）突变为苏氨酸（T）可用于模拟乳酸化，而将赖氨酸（K）突变为精氨酸（R）可用于模拟脱乳酸化。因此，作者利用MDH2K241T和MDH2K241R 模拟了 MDH2 K241 的乳酸化和脱乳酸化。结果显示，模拟 MDH2 K241 乳酸化会导致心肌损伤，表现为 LVEF 下降、心肌收缩力降低和心肌梗死面积增加（图4C-H）。相反，模拟 K241 脱乳可改善 I/R 大鼠的心功能，表现为 LVEF 改善、心肌收缩力增强和心肌梗死面积缩小（图4C-H）。
此外，作者还研究了 MDH2 K241 乳酸化对心肌线粒体结构和功能的影响。模拟 MDH2 K241 乳酸化导致线粒体损伤，表现为线粒体碎片增加、线粒体膜电位降低、ROS 生成增加以及线粒体 OCR 和 ATP 水平降低（图4I-P）。与此相反，模拟 MDH2 K241 脱乳酸化能改善 OGD/R 处理的心肌细胞中线粒体的结构和功能，因为它能增强线粒体形态、提高膜电位、抑制 ROS 生成、提高线粒体 OCR 和 ATP 水平（图4I-P）。此外，模拟 MDH2 K241 乳酸化会阻碍右美托咪定对 OGD/R 细胞线粒体 OCR 和 ATP 生成的保护作用（图4Q，R）。这些发现表明，右美托咪定通过下调 MDH2 K241 乳酸化来改善线粒体功能，从而减轻了 MIRI。
实验结果5
右美托咪定通过调节 MDH2 K241 乳酸化抑制铁死亡改善线粒体功能
基于线粒体功能与细胞死亡之间的密切关系，作者进一步研究了右美托咪定是否通过改善线粒体功能抑制心肌细胞死亡来减轻I/R损伤。通过对接受心肺旁路手术的患者进行代谢通路富集分析，作者发现铁死亡和谷胱甘肽通路显著富集，提示右美托咪定可能在改善心肌I/R损伤中发挥了重要作用（图1F,G）。CCK8 结果显示，Fer-1（一种铁死亡抑制剂）和 Emr（一种细胞凋亡抑制剂），而不是 Nec-1（一种坏死性凋亡抑制剂）或 3-MA（一种自噬抑制剂）能明显改善 OGD/R 处理后的心肌细胞活力，其中 Fer-1 的效果更为显著（图 5A ），这表明铁死亡可能是心肌 I/R 损伤的一个关键原因。鉴于铁死亡与脂质过氧化之间的密切关系，作者采用脂质组学检测了经 OGD/R 处理的心肌细胞中氧脂蛋白的变化。结果显示，OGD/R 处理后心肌细胞中各种氧脂素明显增加，进一步证实了铁死亡的重要作用（图5B）。同时，作者发现与 OGD/R 组相比，右美托咪定能显著提高心肌细胞的存活率，而右美托咪定 + Fer-1 对细胞存活率的联合作用与右美托咪定组无显著差异（图5C ），这表明右美托咪定可能主要是通过减少心肌细胞中的铁死亡来提供抗 MIRI 的保护作用。
随后，作者检测了多个铁死亡相关指标，发现OGD/R显著降低了GSH和GPX4水平，明显增加了线粒体亚铁离子和MDA水平。右美托咪定明显缓解了铁死亡，因为它提高了 GSH 和 GPX4 水平，降低了线粒体亚铁离子和 MDA 水平（图5D-G）。此外，铁死亡诱导剂 Erastin 和 RSL3 能有效抵消右美托咪定对 OGD/R 后细胞活力的益处（图5H）。这些结果表明，右美托咪定可能主要通过改善线粒体功能和减少心肌细胞中的铁死亡来发挥对I/R损伤的保护作用。此外，作者还研究了 MDH2 K241T 突变对右美托咪定降低心肌铁死亡的影响。结果显示，MDH2 K241T突变有效抵消了Dex对OGD/R处理细胞铁死亡的抑制作用，导致MDH2 K241T突变组细胞活力下降、GSH水平降低、MDA水平升高、GPX4水平降低和线粒体亚铁离子水平升高（图5I-M）。这些发现表明，右美托咪定可能通过调节 MDH2 乳酸化来改善线粒体功能，从而缓解铁死亡。
实验结果6
右美托咪定下调 PDK4 以抑制乳酸生成并缓解铁死亡
作者进一步研究了右美托咪定调节乳酸水平的机制。PCA显示了Dex组和I/R组蛋白质表达的显著差异，确定了177个差异表达的蛋白质--98个上调，79个下调（Dex vs I/R）。差异蛋白筛选的标准包括独特肽≥1、折叠变化≥1.5或≤0.67、P值＜0.05（图 6A,B）。利用 KEGG 数据库进行的通路富集分析表明，这些蛋白质主要富集在 TCA 循环和氧化磷酸化等通路中，这与作者之前的结果一致（图6C）。值得注意的是，与乳酸代谢密切相关的蛋白丙酮酸脱氢酶激酶 4（PDK4）在右美托咪定组中显著下调（图6D）。
先前的研究表明，PDK4 通过抑制丙酮酸脱氢酶复合物（PDC）的活性促进乳酸的产生。[30]Western 印迹分析表明，与正常组相比，OGD/R 显著上调 PDK4 水平，而右美托咪定有效抑制了 PDK4 的表达（图6E ），这与作者的蛋白质组学结果一致。为了确定右美托定咪是否通过下调 PDK4 来抑制乳酸生成和铁死亡，作者利用腺病毒过表达 PDK4（图6F ），并考察 PDK4 过表达（PDK4 OE）是否能抵消右美托定咪在 OGD/R 下对乳酸生成和铁死亡的抑制作用。结果显示，与右美托咪定组相比，PDK4 OE 能显著提高 H9c2 细胞线粒体亚铁离子水平，促进脂质过氧化（图6G-I ）。此外，PDK4 OE 下调了 GPX4 和降低了 GSH 水平，并上调了右美托咪定处理的 H9c2 细胞中的 MDA 水平（图6J-L ）。PDK4 OE 还抵消了右美托咪定对乳酸生成和 MDH2 乳酸化的抑制作用（图6M）。此外，作者还探讨了 PDK4 OE 能否否定右美托咪定对 H9c2 细胞线粒体功能的保护作用。研究结果表明，PDK4 OE 显著损害了右美托咪定处理的 H9c2 细胞的线粒体功能，其特征是抑制 ATP 生成、降低 OCR 和线粒体膜电位以及增加 ROS 生成（图6N-S）。
实验结果7
右美托咪定通过上调 NR3C1 磷酸化下调 PDK4
为了研究右美托咪定下调PDK4的机制，作者利用hTFtarget数据库（https://guolab.wchscu.cn/GuoLab/ ）鉴定了86个调控PDK4的转录因子。随后，作者对从瑞士靶标预测数据库（http://swisstargetprediction.ch/ ）中获得的 100 个右美托咪定的靶标进行了 VENN 分析，发现了三个交叉基因：核受体亚家族 3 C 组 1（NR3C1）、雄激素受体（AR）和孕酮受体（PGR）（图 7A ）。Western印迹结果显示，OGD/R组与正常组之间NR3C1、AR和PGR的表达没有明显变化，但OGD/R组NR3C1的磷酸化水平显著降低（图7B）。右美托咪定能明显上调 NR3C1 的磷酸化水平（图7C ）。分子对接结果还显示，右美托咪定直接与 NR3C1 的 Ser226 位点相互作用，形成氢键（图7D ）。
NR3C1 通常位于细胞质中，处于非活性状态。激活后，NR3C1 从其伴侣蛋白复合物中解离并转运至细胞核，从而调控靶基因的转录。磷酸化水平显著影响 NR3C1 的转录活性和亚细胞定位。为了验证右美托咪定通过改变 NR3C1 的磷酸化和核定位来影响 PDK4 表达的假设，作者分离了核蛋白和胞质蛋白，并使用 Western 印迹法检测相关蛋白的表达。结果显示，OGD/R能显著上调NR3C1在细胞核中的表达，但下调其在细胞质中的表达。右美托咪定处理增加了细胞质中 NR3C1 的水平，降低了细胞核中 NR3C1 的表达（图7E）。模拟去磷酸化的 Ser226 位点突变（S226A）抵消了右美托咪定对 NR3C1 核定位的调控作用（图7F）。免疫荧光共定位结果证实了 Western 印迹的发现（图7G）。NR3C1 S226A 突变有效抵消了右美托咪定对 PDK4 表达的抑制作用（图7H）。作者进一步研究了抑制 NR3C1 磷酸化是否能抵消 Dex 对 I/R 诱导的心肌细胞铁死亡和乳酸生成的影响。结果显示，通过 S226A 突变抑制 NR3C1 磷酸化会增加 Dex 处理的心肌细胞线粒体亚铁离子和脂质过氧化反应、MDA、细胞内乳酸水平和 MDH2 乳酸化，但会降低 GPX4 和 GSH 水平（图7I-O ）。同时，利用 AAV 抑制大鼠 NR3C1 的磷酸化会削弱右美托咪定对 I/R 大鼠心肌细胞的保护作用（图7P,Q）。
