EMBO丨亲环素 D （CypD）在衰老细胞的存活过程中发挥关键作用

鉴定作为衰老存活基因的亲环素 D

    作为鉴定新型基因衰老靶点的一种策略，作者在小鼠胚胎干细胞（ES）中采用了之前描述的聚类正则间隔短回文重复/CRISPR相关蛋白9（CRISPR/Cas9）系统。简而言之，这些细胞带有强力霉素诱导的Cas9转基因，并用慢病毒sgRNA文库转导，该文库旨在靶向18424个基因，每个基因约有5个独立的sgRNA（共90230个sgRNA）。作者首先设计了一个系统，在分化的小鼠 ES 细胞（mESCs）培养物中诱导细胞衰老（图1A）。特别是，在 5 天内同时撤除白血病抑制因子（LIF）和添加维甲酸（RA），诱导 mESCs 分化成混合细胞系。多能基因Oct4的表达消失，代表胚胎三个胚层的基因，即外胚层（Pax6、Nestin）、中胚层（Meox1、Snai1、Fgf5）和内胚层（Sox7、Gata4）的基因上调，证实了分化。然后，分化的 mESCs 被两种独立的诱导剂诱导衰老：CDK4/6 抑制剂 palbociclib（通过在功能上模拟 p16 的 CDK 抑制活性诱导衰老）和 X 射线照射（图1A）。衰老相关基因Cdkn2a、Cdkn1a 和Il6的表达以及衰老相关 β-半乳糖苷酶活性的检测证实了衰老的开始。最后，作者想评估由此产生的代表三个胚层的衰老分化-mESCs 细胞群是否对两种广谱衰老溶解疗法--纳维替尼（navitoclax）和达沙替尼（dasatinib）--敏感。重要的是，纳维替尼（navitoclax）和达沙替尼（dasatinib）对帕博西利（palbociclib）衰老分化和辐照衰老分化的mESCs细胞都显示出溶解活性。因此，作者在代表所有三种发育系细胞类型的衰老细胞混合物中进行了筛选，以期发现广谱的衰老靶点。

    在衰老的分化-ES 细胞以及未暴露于衰老诱因的对照分化-ES 细胞中添加强力霉素 10 天，诱导 Cas9 激活（图1A）。从不同的细胞群中获取基因组 DNA，比较每种条件（即分化、衰老帕博西尼和衰老辐照）下强力霉素处理前后 sgRNA 读数的丰度。由于所有三个实验组（包括分化-ES）都是以非分裂细胞为主，因此作者推断，那些在添加多西环素后sgRNA丰度降低的基因将对应于生存所必需的基因。此外，那些只在衰老细胞中而不在分化细胞中被消耗的基因是候选的衰老目标。作者优先选择 sgRNA 丰度减少约三分之一的基因（即氧后与氧前相比，Log2FC ≤-1.5）；为了确定广泛适用的衰老靶标，作者重点研究了在两种衰老条件下都被耗竭的基因。值得注意的是，Na+/K+-ATP酶的主要亚基（ATP1A1）是一个众所周知的衰老靶点，它是在帕博西尼衰老细胞中被强烈消耗的sgRNA之一（Log2FC ≤-1.5），尽管它在辐照衰老细胞中没有达到这个阈值。只有 13 个基因的 sgRNA 在 palbociblib 和辐照衰老细胞中被普遍删除（图1B、C）。考虑到线粒体对细胞衰老的重要性以及迄今为止报道的线粒体衰老靶点的稀缺性，作者决定寻找候选名单中唯一的线粒体靶点。具体来说，作者重点研究了编码亲环素 D（CypD）的PPIF，这是一种线粒体肽基-脯氨酰顺反异构酶（PPIase）（图1B、C）。

抑制亲环素 D 的衰老作用

    在确定CypD是分化小鼠胚胎干细胞中潜在的衰老靶点后，作者转而研究不同来源的人类细胞。作者在正常人肺成纤维细胞IMR90（使用X射线照射）和人肺腺癌A549细胞（使用博莱霉素）中诱导衰老，并在首次照射7天后对它们进行分析。与增殖细胞相比，作者在这两种类型的衰老细胞中观察到了更高的 CypD 蛋白稳态水平（图2A）。为了测试抑制 CypD 的衰老效力，作者使用了之前提到的辐照-IMR90 和博来霉素-A549 细胞，以及用 palbociclib 处理的人黑色素瘤 SK-MEL-103 细胞（简称 SK-MEL）。诱导衰老 7 天后，用siPPIF转染衰老细胞（用 30 种 siRNA 的商业混合物进行单轮转染，每种 siRNA 针对同一 mRNA 中的不同序列，以下简称为 siCypD），再过 7 天后分析转染的细胞。在所有三种细胞衰老模型中，CypD mRNA 和蛋白水平都显著降低（图2B），细胞活力下降了约 40%，而增殖细胞不受影响，尽管 CypD 被有效下调（图2B）。为了确保 siCypD 的细胞毒性作用是特异性的衰老作用，而不是一般地与细胞周期停滞有关，作者用 mTOR 的选择性抑制剂 sapanisertib（又称 INK128）处理 IMR90 和 A549 细胞 7 天，诱导细胞进入静止状态。作者证实 siCypD 对 mTORi-quiescent 细胞的存活没有影响（图2C）。最后，作者评估了环孢素 A（CSA）的衰老活性，环孢素 A 是一种特征明确且常用的泛亲环素抑制剂，包括 CypD 在内，它还能抑制磷酸酶钙调磷酸酶（PPP3CC）。除了之前描述的细胞模型外，作者还测试了用阿柏西尼（abemaciclib）处理的 LNCaP 前列腺癌细胞，阿柏西尼是另一种 CDK4/6 抑制剂，与 palbociclib 相似。用 CSA 处理增殖细胞和衰老细胞（触发后 7 天）6 天后发现，CSA 在所有四种测试的人类衰老细胞模型中都具有衰老活性，衰老指数（SI，衰老细胞与增殖细胞 IC50 值之比）从 1.59 倍到 3.21 倍不等（图2D）。为了评估钙调磷酸酶抑制作用对 CSA 的衰老作用的潜在贡献，作者使用了 NIM811，这是一种 CSA 衍生物，缺乏对钙调磷酸酶的抑制活性，但保留了抑制亲环素的能力。有趣的是，NIM811 也具有衰老作用，其 SI 指数从 1.87 到 3.75 不等（图2E），这表明这些药物衰老的主要机制是通过抑制亲环素。

    然后，作者转向细胞衰老的体内模型。已经证实，一些化疗药物能有效诱导一部分癌细胞衰老，与衰老药物联合治疗能更有效地消退肿瘤。为了研究抑制 CypD 是否能消除体内衰老的癌细胞并表现出抗肿瘤活性，作者在黑色素瘤异种移植模型中测试了 CSA 的衰老活性。通过皮下注射 SK-MEL 细胞诱导异种移植，在肿瘤建立后（当肿瘤达到 100立方毫米时，视为第 1 天），用 palbociclib（从第 1 天开始）和/或 CSA（从第 3 天开始）治疗小鼠，CSA 的剂量是之前在小鼠实验中报道过的。有趣的是，palbociclib 和 CSA 的联合治疗显示出强大的抗肿瘤效果，优于单独使用 palbociclib（图2F）。值得注意的是，单独使用 CSA 对肿瘤生长没有任何影响，这表明 CSA 治疗的积极效果取决于 palbociclib 诱导的衰老细胞的存在。支持这一解释的是，对使用 palbociclib 治疗的肿瘤进行的免疫组化分析表明，细胞周期抑制剂 p21（衰老的一般标志物）的表达量大幅增加，而同时使用 palbociclib 和 CSA 治疗的动物的肿瘤显示 p21 水平显著下降（图2G）。作者的结论是，与增殖或静止细胞相比，衰老细胞的存活对抑制 CypD 的作用不敏感。

BNIP3 可增加嵴的数量

    BNIP3 发现之初被认为是一种促凋亡的 BCL2 家族蛋白。最近，它被认为是一种与 LC3 家族蛋白相互作用的有丝分裂受体。然而，在衰老过程中，也许是通过线粒体的伸长，有丝分裂受到了损害。用巴佛洛霉素 A1 抑制自噬降解并不会显著影响衰老细胞中 BNIP3 的水平。相反，蛋白酶体抑制剂 MG-132 会增加 BNIP3 的水平。为了探索 BNIP3 的功能，作者对 BNIP3 相互作用的蛋白进行了 GO 分析。该分析表明，“线粒体内膜组织 ”蛋白的富集程度最高，包括 MICOS 复合物亚基 MIC60、MIC19、MIC13 和 MIC27 及其相互作用蛋白 TMEM11、SAM50 和 DNAJC11（图 3，A 和 B）。MICOS 是线粒体内膜复合体，具有双重功能：形成与外膜的接触位点和维护称为嵴的内膜内陷结构。尽管最近的一项研究发现 BNIP3 是与 TMEM11 相互作用的蛋白，但 BNIP3 与 MICOS 之间的关系尚未得到检验。作者通过免疫印迹证实 MIC60 与 FLAG-BNIP3 共沉淀。FLAG-BNIP3 和 MIC60 之间的相互作用在阿霉素处理后略有增加。S70A 突变消除了这种增加。MIC60 是一个核心亚基，它的缺失会破坏其他亚基和 MICOS 相互作用蛋白的稳定性。敲除 MIC60 会降低 IMR-90 细胞中 BNIP3 和 MIC19 的水平。相比之下，敲除 BNIP3 并没有明显影响 MIC60 或 MIC19 的水平。

    作者研究了 BNIP3 是否会在 DNA 损伤诱导的衰老过程中改变线粒体的结构和动力学。利用电子显微镜，作者发现阿霉素处理增加了 IMR-90 细胞中每个线粒体区域的嵴数量（图 3，C 和 D）。这种增加被 BNIP3 敲除后线粒体部分变性所抑制。聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）显示，变性区域往往毗邻内质网（ER）-线粒体接触点（图 3F），MICOS 被认为可促进该处的脂质运输。阿霉素处理也诱导线粒体伸长（图 3，C 和 E），正如在复制衰老中所报道的那样。这种伸长不受 BNIP3 敲除的影响。敲除 NDUFA8 并未抑制嵴数量或线粒体长度的增加。与 IMR-90 细胞一样，阿霉素处理也增加了 HUVECs 中嵴的数量。这也被 BNIP3 敲除所抑制。接下来，作者使用活细胞成像技术检测了线粒体的动态变化。在对照组 IMR-90 细胞中，线粒体被证实经历了裂变和融合的循环。在阿霉素诱导的衰老细胞中，线粒体形成了网状网络，这些网络也通过裂变和融合不断重组。线粒体动力学似乎不受 BNIP3 敲除的影响。这些结果表明，BNIP3 是一种与 MICOS 相互作用的蛋白，它能在 DNA 损伤诱导的衰老过程中增加嵴的数量。

衰老细胞中依赖于亲环素 D 的 mPTP “闪烁”

    众所周知，CypD 可促进线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放。mPTP 的瞬时开放被称为 “闪烁”，它是维持线粒体健康的重要机制，因此也是维持细胞健康的重要机制。考虑到作者的数据表明 CypD 升高与衰老细胞的存活有关，作者想知道这是否与 mPTP 闪烁水平升高有关。为了观察 mPTP 闪烁，作者使用四甲基罗丹明（TMRM）记录了线粒体膜电位（ΔΨm），记录时间约为 8 分钟（350 个连续帧），并使用 Mitotracker Green（MtG）观察线粒体（图3A）。闪烁是通过 TMRM 信号的瞬时损失检测到的，这种损失持续数秒并影响线粒体网络的局部子集。在单次转染 siScrbl 或 siCypD 5 天后，在增殖和衰老的 A549 和 IMR90 细胞中对瞬时 mPTP 开放进行量化。衰老的诱导方法如前所述（触发后 7 天），对 IMR90 细胞使用辐照，对 A549 细胞使用博莱霉素。有趣的是，衰老细胞发生闪烁的频率是增殖细胞的三倍，而 siCypD 则大大降低了闪烁的频率（图3B）。

    作者还使用 Calcein-AM 和CoCl2流式细胞术监测 mPTP 的开放。钙黄绿素-AM可穿透活细胞的细胞膜和线粒体，CoCl2则可选择性地淬灭细胞膜信号。在 mPTP 开放过程中，钴进入线粒体并淬灭基质 Calcein-AM 荧光，从而使作者能够评估 mPTP 开放情况。动力学分析表明，帕博西尼诱导的衰老 SK-MEL 细胞在孵育 1 小时后线粒体荧光减少，而增殖细胞则无差异（图3C）。不出所料，同时暴露于 CSA 会阻断 mPTP 的开放并阻止衰老细胞中 Calcein-AM 的淬灭（图3C）。因此，通过使用两种不同的测量方法，作者得出结论：衰老细胞具有升高的依赖 CypD 的 mPTP 闪烁。

抑制衰老细胞中的亲环素 D 会导致线粒体Ca2+积累

    先前的研究将 mPTP 闪烁描述为基质Ca2+积累期间的 Ca2+ “紧急出口”。鉴于衰老细胞会持续经历内质网线粒体Ca2+流入的加剧，这种故障安全活动可能与衰老细胞特别相关。在此基础上，作者假设依赖 CypD 的 mPTP 闪烁可能是衰老细胞的一种关键适应，它允许线粒体Ca2+的释放，从而避免有毒Ca2+的积累。为了验证这一点，作者使用Ca2+ 指示剂 Rhod-2/AM（简称 Rhod-2），通过荧光显微镜分析了单个细胞水平的静止线粒体Ca2+水平。为确保该探针的特异性和数据的正确解释，作者验证了 Rhod-2 信号与 Mitotracker Green 的共定位，并测量了线粒体膜电位（ΔΨm），这可能会影响 Rhod-2 的荧光强度。虽然博莱霉素诱导的衰老 A549 细胞的膜电位低于增殖细胞，但 CypD 下调不会影响ΔΨm，这保证了 siCypD 和 siScrbl 处理的细胞之间的直接比较不会受到线粒体电位不同的影响。与增殖细胞相比，去除了 CypD 的 IMR90 和 A549 衰老细胞在 siRNA 处理 4 天后出现线粒体Ca2+积累（图4A,B）。这一结果在稳定表达基因Ca2+传感器 CEPIA-2mt 的 A549 衰老细胞中得到了复制。增殖细胞和 mTORi-quiescent 细胞中均未观察到Ca2+积累，这进一步证实了这一现象是衰老细胞特有的（图4C）。作者的结论是，下调 CypD 后，衰老细胞的线粒体Ca2+ 积累，而非衰老细胞的线粒体Ca2+ 能维持正常水平。

    作者还在用 Rhod-2 染色的 A549 衰老细胞中进行了Ca2+通量分析，并用 10 µM ATP 激发 ER 钙释放（图4D）。不出所料，CypD 下调的衰老细胞（siCypD 处理后 4 天）的 Rhod-2 基线信号高于 siScrbl 衰老细胞。有趣的是，与 siScrbl-senescent 细胞相比，siCypD-senescent 细胞在 ATP 刺激后的 Rhod-2 信号峰值大大减弱，这表明 CypD 下调的衰老细胞可能已达到线粒体Ca2+ 的最大允许水平。通过操纵主要的线粒体Ca2+转运体 MCU（线粒体钙离子转运体）和最重要的线粒体Ca2+外流通道之一 NCLX（线粒体钠/钙离子抗转运体），证实了 Rhod-2 在这一设置中的特异性。用靶向 MCU 的 siRNAs 或 MCU 抑制剂 Ruthenium 360（Ru360）预处理衰老的 A549 细胞，可显著降低 ATP 触发的 Rhod-2 信号峰值。相反，用 NCLX 抑制剂 CGP-37157 处理会导致 ATP 后Ca2+水平持续升高，而未处理的衰老细胞中的信号则逐渐降低。这些观察结果证实，CypD 以及 NCLX 是衰老细胞中线粒体Ca2+被挤出的重要机制。

    为了探索衰老细胞线粒体中Ca2+水平的升高是否可归因于最重要的Ca2+转运体稳态水平的变化，作者对增殖细胞和博莱霉素诱导的衰老 A549 中的几个 MCU 复合物亚基（MCU、MICU1、MICU2 和 MCUb）和 TMBIM5 进行了 Western 印迹分析。有趣的是，作者观察到衰老细胞中 MCUb 的水平降低，MICU2 的水平也略有下降，而衰老细胞和增殖细胞中其他转运体的水平相似。考虑到 MCUb 是 MCU 的显性阴性亚基，作者推测 MCUb 水平的降低可能是导致衰老细胞线粒体Ca2+流入失调的原因。作者无法通过免疫印迹可靠地检测到 NCLX 和 LETM1，但 RT-qPCR 分析并未发现衰老细胞和增殖细胞在 CypD 下调或未下调的情况下存在显著差异。用 siCypD 或 siScrbl 处理的细胞在上述蛋白和 mRNAs 方面没有明显差异，这加强了观察到的Ca2+改变主要是由于 mPTP 开放抑制所致的观点。

    正如之前所报道的，作者发现与非衰老细胞相比，衰老细胞具有更高的细胞膜Ca2+（用 Fluo-4 测量）和更低的细胞膜 pH（用 BCECF 测量）。重要的是，抑制 CypD 不会影响细胞膜Ca2+或 pH。通过使用 Fura-2 对细胞膜Ca2+通量进行动力学分析，作者观察到衰老细胞在 ATP 刺激后显示出更高的峰值，并在更长时间内维持更高的细胞膜Ca2+水平，且与 CypD 无关。这些观察结果与衰老细胞不仅在线粒体，而且在细胞质和 ER 中普遍积累Ca2+，但抑制 CypD 会选择性地影响线粒体Ca2+水平的观点一致。

抑制亲环素 D 会影响衰老细胞的线粒体形态

    线粒体Ca2+的变化可导致线粒体功能障碍和重塑。尤其是线粒体Ca2+的升高会引发线粒体破碎和肿胀。基于这一点，作者决定在通过 siRNA 处理下调 CypD 5 天后，进一步表征 CypD 缺失对衰老癌细胞和成纤维细胞线粒体结构和功能的影响，在这个时间点可以检测到基质Ca2+积累，但衰老程度仍然较低。作者观察到，siCypD 能明显改变衰老细胞的线粒体形态，而不能改变增殖细胞的线粒体形态。具体来说，衰老细胞中的线粒体体积和长度在 siCypD 的作用下明显减少（图5A-D），这表明线粒体发生了破碎。因此，衰老细胞中的CypD抑制再现了Ca2+超载的形态学特征，进一步证实了CypD通过缓冲线粒体Ca2+水平促进衰老细胞存活的观点。

抑制环素 D 后的线粒体呼吸、ROS 和蛋白质折叠

    考虑到 mPTP 的瞬时开放会在局部消散线粒体的 H+梯度，而且基质Ca2+会影响细胞的新陈代谢，作者想知道在衰老细胞中抑制 CypD 是否会对电子传递链的整体功能产生可检测到的影响。作者在与之前实验相同的条件下，通过测量增殖细胞和衰老细胞（IMR90 和 A549）的耗氧量来评估线粒体呼吸。虽然与增殖细胞相比，衰老细胞的最大呼吸率和剩余呼吸率更高，但抑制 CypD 并不影响这些值（图5E）。

    与增殖细胞相比，衰老细胞中的活性氧（ROS）水平要高得多，而 ROS 是 mPTP 开放的主要激活剂。作者想知道在衰老细胞中抑制 CypD 是否会影响线粒体 ROS 水平（使用 MitoSox 测量）。作者发现，衰老细胞中的线粒体 ROS 水平并未受到 CypD 消耗的显著影响（图5F）。

    除了调节 mPTP 的功能外，CypD 的另一个重要功能是促进线粒体蛋白质的折叠。在这方面，抑制 CypD 可能会促进线粒体中未折叠蛋白质的积累，并激活线粒体未折叠蛋白质反应（UPRmt ）。为了评估 CypD 的线粒体伴侣功能，作者测量了已知在UPRmt期间转录上调的标记物的 mRNA 水平。作者观察到，在增殖或衰老的 IMR90 和 A549 细胞中，所测试的标记物（HSP60、DNAJA3、CLPP、TXN2、mtHSP70、LONP1）均未受到 siCypD 的显著影响。总之，这些数据表明，在衰老细胞中减少 CypD 的影响主要是由于其对线粒体钙水平的影响，而不是反映在 CypD 的其他已知功能上。

衰老细胞中的亲环素 D 抑制导致焦亡

    作者想知道在衰老细胞中抑制CypD引起细胞死亡的机制。Ca2+过载导致的线粒体失稳是 NLPR3 炎症小体和 Caspase 1 依赖性细胞死亡（也称为焦亡）的典型触发因素。基于上述观察，作者假设 CypD 的耗竭会引发 Caspase-1 依赖性细胞死亡。为了检验这种可能性，作者用已知能防止焦亡的不同浓度的 Caspase-1 和 -4 抑制剂（VX-765）孵育 CypD 贫化的增殖和衰老的 IMR90 和 A549 细胞（生成方式与之前的实验相同）。作者观察到，VX-765 以浓度依赖的方式显著抑制了 CypD 缺失的衰老效应，表明焦亡细胞死亡程序在 CypD 介导的衰老中发挥作用（图5G ）。

抑制 NCLX 可重现抑制亲环素 D 的衰老效应

    接下来，作者试图进一步探索Ca2+积累对衰老细胞活力的影响。作者采用了两种相反的药理学方法，即使用线粒体主要 Ca2+ 转运体 MCU 的抑制剂减少Ca2+进入线粒体；以及阻断 NCLX 转运体，它是线粒体Ca2+的主要外流途径（图6A）。

    之前的研究人员已经发现 MCU 对衰老的建立至关重要。作者想知道用 Ruthenium 360 (Ru360) 抑制 MCU 是否会阻止 siCypD 在衰老细胞中诱导的细胞死亡（图6A）。文献已广泛报道 Ru360 能显著降低线粒体Ca2+摄取和基础水平。在使用 Rhod-2 测量线粒体Ca2+水平之前，将衰老细胞（使用衰老触发剂处理 7 天后）暴露于 Ru360 4 天。与之前的研究一致，Ru360 显著降低了衰老 A549 细胞的基础Ca2+水平，并大大挽救了去掉 CypD 的衰老细胞的Ca2+积累（图6B）。此外，转染了 siCypD 的衰老 A549 和 SK-MEL 细胞同时用 Ru360 处理 6 天后，CypD 缺失的衰老细胞的活力得到了部分挽救（图6C）。

    最后，为了模拟 CypD 抑制引起的Ca2+积累（见上文），用 NCLX 抑制剂 CGP-37157（缩写 CGP）处理细胞（图6A）。将衰老的 A549 细胞暴露于 CGP 4 天后，线粒体Ca2+的增加与 CSA 诱导的增加相当（图6B）。重要的是，用 CGP 处理 6 天的衰老 A549 和 IMR90 细胞表现出与用 siCypD 处理 7 天的细胞相似的活力丧失（图6C）。此外，与单独处理相比，CSA 和 CGP 的组合具有更强的衰老作用（图6D）。为了进一步证实 CSA 和 CGP 具有衰老特异性毒性的共同机制，我们询问 CGP 是否会在衰老细胞的线粒体中产生与抑制 CypD 时观察到的相同的形态学变化。有趣的是，用 CGP 处理衰老的 IMR90 和 A549 细胞也会导致线粒体体积和长度的减少，而增殖细胞的线粒体则不受影响（图6E、F）。为了证实和加强这些观察结果，作者用特定的 siRNA 转染衰老细胞和增殖细胞 7 天，从而基因下调 NCLX 和 MCU。活力测定表明，siNCLX 会导致衰老细胞丧失存活能力，而增殖细胞则不会（图6G）。在衰老的 A549 细胞中，siNCLX 造成的存活率下降与 siCypD 造成的存活率下降没有区别。此外，siMCU 也部分缓解了 siCypD 引起的活力丧失（图6G）。用 siNCLX 处理衰老线粒体的形态学分析再现了药理抑制 NCLX 或 siCypD 的结果，即线粒体体积和长度的减少（图6H-J）。总之，这些结果有力地证实了衰老细胞线粒体Ca2+的异常流入需要通过 CypD/mPTP 和 NCLX 的外流来抵消。由于这种脆弱性，单独或联合抑制 mPTP 和 NCLX 对衰老细胞都是有毒的。