Molecular Cell丨VPS4A 是小鼠和人类脂噬的选择性受体

人类肝脏转录组学揭示了hVPS4与脂肪肝的反相关性

    在小鼠肝脏磷酸蛋白组学中搜索溶酶体/内体候选蛋白发现，禁食诱导的磷酸化位点富集趋势是内体分拣运输（ESCRT）途径所需的VPS4旁系物VPS4AS95,S97（logFC = 0.5,0.4）和VPS4BS102（logFC = 0.7）（图1A和1B）。对上调磷酸位点的激酶预测发现了由禁食诱导并影响自噬的保守信号模块（图 1C），如 Ser/Thr 激酶 CASEIN KINASE 2 (CK2)，它分别通过ATG3215和 TEX264 磷酸化、刺激饥饿诱导的线粒体自噬和 ERphagy。为了研究 VPS4 旁系亲属参与 MASLD 的情况，作者分析了来自健康、MASLD 和代谢功能障碍相关性脂肪性肝炎（MASH）受试者的肝脏转录组数据集（GEO：GSE135251）（图 1D）用不同（0-8）的人类 MASLD 活性评分（NAS）分析VPS4A和VPS4B，发现VPS4A在早期 MASLD 中显著下调（图 1E）。根据组织病理学/纤维化评分对受试者进行分层（图 1F），与对照组相比，发现了几个表达不同的 ESCRT 基因（pAdj< 0.05）（图 1F）。VPS4A是下调幅度第二大的基因，与早期 MASLD 的相关性最强，并与 MASH 基因表达成反比，而VPS4B则在疾病晚期显著下调（图 1F、1G）。有趣的是，相应的基因组富集分析（GSEA）和《京都基因与基因组百科全书》（KEGG）通路分析显示，溶酶体/自噬通路在所有 MASLD 阶段的显著（pAdj< 0.05）上调基因（1,365 个）和下调基因（1,013 个）中都有富集。同样，VPS4A的表达与 LD 组织基因（GO:0034389）（图 1H）和嗜脂相关基因（Reactome_Lipophagy; R-HSA-9613354）显著相关（pAdj< 0.05），表明hVPS4A的表达、嗜脂和肝脏脂质代谢改变之间存在联系（图 1I）。

VPS4A 和 VPS4B 在 LD 中富集并促进 LD 更替

    由于哺乳动物的 VPS4 旁系亲属与 ESCRT 通路有关，作者推测人类 MASLD 中VPS4A和VPS4B表达的减少反映了内质体 LD 翻转的缺陷。事实上，单独沉默Hgs（ESCRT 0）、Vps28（ESCRT I）、Vps25（ESCRT II）、Vps2（ESCRT III）、Vps4A、Vps4B 、 或巨自噬基因Atg7处理的 AML12 肝细胞，发现siVps4a、siVps4b 和siAtg7细胞有大量 LD 积累，而siVps28和siVps2细胞则有少量脂质积累（图 2A）。通过免疫荧光在 AML12 细胞中证实了Vps4a或Vps4b的缺失，并在转染了三种不同的针对小鼠 VPS4A 的单导 RNA（sgRNA）的 NIH/3T3 Cas9 稳定株中独立测试了Vps4a缺失（Vps4aKO ）对 LD 积累的影响。与空腹诱导的自噬体标志物 LC3-II 在 LD 产物中的富集（代表噬脂作用）相一致，作者观察到与喂养对照组相比，LD 中 LC3-II、VPS4A 和 VPS4B 的水平显著增加，而 HGS、VPS28 和 VPS25 的水平不受影响（图 2B）。同样，在经 OA 处理的 AML12 肝细胞中，VPS4A 和 VPS4B 与 LDs（BODIPY493/503）共定位。

VPS4A（而非 VPS4B）与低密度脂蛋白上的 LC3 结合以调节脂吞噬作用

    为了区分 VPS4A 和/或 VPS4B 是否调控噬脂作用，作者使用超分辨率显微镜追踪了它们在 OA 处理的 AML12 肝细胞中与 LC3 和 LD 的共聚焦（图 2C）。耐人寻味的是，VPS4A 和 VPS4B 在与 LC3-LD 复合物的关联方面表现出差异：VPS4A 表现出与 LC3 和 LDs 的大量共定位，LDs 上的三重共定位VPS4A-LC3-BODIPY493/503像素反映了这一点（图 2C 顶部的白色箭头）。相比之下，VPS4B 只与与 LD 无关的 LC3 池共定位（图 2C，底部）。由此作者推测，VPS4A 与 LD 上的 LC3 结合反映了其对脂噬的调控，而 VPS4B 则通过一种独立于 LC3/自噬体的机制调节 LD 的含量。

    有趣的是，结构照明/三维（3D）重建显示，VPS4A似乎将LC3/自噬体与LD拴在一起（图2D；白色箭头表示VPS4A-LD关联；黄色箭头表示VPS4A-LC3关联），而VPS4B仅与LC3关联（图2D；黄色箭头表示VPS4B-LC3关联）。同样，沉默Vps4a或Atg7会大大减少 LC3 与BODIPY493/503的共定位，并增加 LD 的含量，这反映了噬脂性阻断（图 2E），而Vps4b的缺失会导致 LD 的积累，但不会影响 LC3 对其的封存（图 2E）。透射电子显微镜（TEM）进一步证实了这一点，TEM 显示，与 siCon 控制（siCon）的 AML12 肝细胞相比，siVps4a细胞完全不能将 LD 封存在双膜自噬体中，这表明脂噬失败。因此，尽管 VPS4A 和 VPS4B 都会影响 LD 的水平，但 VPS4A 而不是 VPS4B 会调节 LC3/自噬体对 LD 的封存。因此，与 siCon 细胞相比，在溶酶体抑制剂（Lys Inh）存在/不存在的情况下，沉默Vps4a或Atg7（而非Vps4b）可阻断溶酶体 LD 通量，表现为BODIPY493/503与溶酶体标志物溶酶体相关膜蛋白 2（LAMP2）的共定位减少。

VPS4A 和 LDs 同时被自噬降解

    为了探究 VPS4A 如何调控脂肪吞噬，作者思考 VPS4A 是否与溶酶体中的 LDs 同时降解，这是自噬受体的一个关键特征。有趣的是，VPS4A 或 VPS4B 与 LDs（BODIPY493/503）和溶酶体（LAMP2）的相应相互作用的三维建模显示，VPS4A 和 LDs 一起被送入溶酶体腔（图 2F，顶部），而 VPS4B 与溶酶体没有关联（图 2F，底部）。事实上，免疫荧光显示 VPS4A 和 VPS4B 通过不同的途径降解 LDs，因为 VPS4A 缺失（如 ATG7 缺失）而非 VPS4B 缺失会阻断 BODIPY/LAMP2 共定位，但不会影响 BODIPY 与晚期内质体标记物 RAB7 的共定位。相比之下，无论是否存在 Lys Inh，去除了 VPS4B 都会特异性地阻断 BODIPY/RAB7 共定位，而不影响 BODIPY/LAMP2 共定位。因此，LAMP2+溶酶体中LD的自噬需要VPS4A，而VPS4B可能调节RAB7+内体中的内体脂质吞噬。

    为了从生化角度证实 VPS4A 是通过自噬降解的，作者分析了喂食或禁食 12 小时的对照组小鼠和肝脏特异性Atg7KO小鼠的肝脏（图 2G）。Atg7的缺失、LC3-II的缺失、自噬受体P6224和线粒体自噬受体OPTINEURIN的积累以及LD蛋白PLIN33的积累证实了自噬的阻断（图2G）。最近的一篇论文提出SPARTIN是一种脂肪吞噬受体25；然而，SPARTIN未能在Atg7KO肝脏中积累，这表明SPARTIN不是一种自噬受体（图2G）。相比之下，VPS4A（而非 VPS4B）在Atg7KO 的肝脏中积累，证实 VPS4A 和 P62 一样是一种自噬受体（图 2G）。

脉冲追逐实验证实了 VPS4A 在溶酶体脂肪分解中的作用

    为了证实溶酶体 LD 分解需要 VPS4A，作者使用了一种基于 C12 脂肪酸的代谢示踪剂 LipiDye-M，它可以对脂肪分解进行时间定量。LipiDye-M含有对极性敏感的溶变色3a-氮杂吡喃-4-酮染料，其荧光取决于溶剂/环境的极性（例如，亲水性细胞膜发出绿色荧光，两性膜/细胞器发出黄色荧光，疏水性LD发出红色荧光）（图3A）。用 OA 给 AML12 肝细胞脉冲 5 小时，然后进行 1 小时 LipiDye-M 染色，然后在无 OA 的情况下追逐 12 小时（图 3B），作者观察到，虽然对照细胞在 12 小时内完全耗尽了红色荧光 LD、 但siVps4a细胞能抵抗脂肪分解，红色荧光得以保留（图3A-3C）。siVps4a肝细胞中的 LD 积累是由于溶酶体周转受阻造成的，因为当在无 OA 的情况下追逐时，OA 推动的 siCon 肝细胞（而非siVps4a肝细胞）在 8 小时和 12 小时以溶酶体敏感的方式显示出明显的 LD 消耗（图 3D）。与低密度脂蛋白分解减少相一致的是，如先前所报道的，siVps4a和siAtg7细胞明显降低了细胞呼吸，表现为最大耗氧率（OCR）、剩余呼吸能力和非线粒体 OCR 的降低，且有降低基础 OCR 的趋势，而Vps4b的缺失仅影响最大 OCR。

去除了 VPS4A 的肝细胞在内膜功能或自噬体封闭方面没有缺陷

    因此，ESCRT-III 介导的膜裂解的缺失已被证明会阻碍 MVB/ILV 的生物生成和异常 E 类区隔的产生。研究还表明，VPS4B/SKD1（VPS4B E235Q）突变体的内体分选功能有缺陷，而 VPS4A 突变体则无此缺陷。同样，表达不与 ATP 结合的VPS4A K173QAAA+ ATPase 突变体35对 AML12 细胞和 NIH/3T3 细胞中的 DPH（LD）/LC3 共定位没有影响。此外，VPS4 A K173QAAA+ ATPase 突变体细胞保持了 DPH/LAMP2 共定位，表明 VPS4A 对噬脂的调控不需要其 ATPase 活性。重要的是，缺乏典型 ILV 的 “E 类 ”异常结构只在siChmp1bESCRT-III 缺陷细胞中出现，而不在siVps4a细胞中出现（图 3E）。因此，siVps4a细胞中的 LD 积累并非由于 MVB 生物发生/ILV 形成受损所致。

    尽管 ATPase 缺失的 VPS4A（VPS4A E228Q ）具有显性阴性的吞噬体封闭缺陷，但沉默Vps4a本身并不影响自噬体的封闭。由于 SYNTAXIN17（STX17）与完全形成的 LC3/自噬体的外膜结合，而不与未闭合的中间体结合，因此作者在共表达 EGFP-LC3B 和 mCherry-STX17 的 AML12 细胞中使用延时成像来确定 VPS4A 缺失对自噬体闭合的影响（以 EGFP-LC3B/mCherry-STX17 共定位表示）（图 3G）。事实上，跟踪 15 分钟（从 EGFP-LC3B+隔离膜过渡到 EGFP-LC3B+ mCherry-STX17+自噬体并与 LysoTracker blue+酸性细胞器融合所需的时间）发现，只有siChmp1b细胞存在自噬体闭合缺陷（20% 的过渡），而 siCon（93. 8%过渡）或siVps4a细胞（83.3%过渡）显示出完整的自噬体闭合（图 3G）。同样，与相应的对照组相比，Vps4a KONIH/3T3 细胞或与VPS4A K173QATPase 突变体重组的Vps4aKO细胞显示出相同的自噬体关闭率和与溶酶体融合率（自溶酶体形成）。此外，在使用串联 ssRFP-GFP-LC3 报告时，Vps4a缺失并没有减少每个细胞中 LC3-II 或 LAMP2 点的数量，也没有影响大量自噬通量，这表明自噬体闭合或自噬体与溶酶体融合完好无损。

计算建模和模拟预测了 VPS4A 的脂质膜结合区

    为了确定 VPS4A 如何调节 LDs 的自噬封存，作者探索了 VPS4A 是否以及如何将 LDs 与 LC3 连接（图 4A）。Alphafold2、粗粒度分子动力学模拟（图 4B）和基于 AI 的建模揭示了 VPS4A 的三个结构域：一个三螺旋 N 端 MIT 结构域（1-80 氨基酸[aa]）、一个连接域（81-106 aa）和一个保守的 AAA+ ATPases 盒（107-437 aa）12（图 4B）。作者使用 CHARMM-GUI Martinimaker将 VPS4A 的全原子结构转换为粗粒度模型，并根据 VPS4A 与膜的不同结构域方向以及 VPS4A 与膜之间的不同距离，将 VPS4A 定位在模型脂膜上，从而破译了蛋白质与膜的相对方向（图 4B）。对 VPS4A 与膜进行了六次无偏粗粒度模拟，每次模拟 3 μs，发现有三个轨迹显示 VPS4A 与膜脂质自发且相对稳定的相互作用。在每次模拟过程中计算每个 VPS4A 残基与膜脂头基团的距离和接触占据率，结果显示 VPS4A N 端 MIT 结构域的两个区域（Met1至Thr14和Tyr32至Leu64）始终与膜脂形成接触，其次是 AAA+ ATPase 盒内的低占据率区域（图 4C）。对 VPS4A 与膜相互作用残基侧链方向的研究，以及将具有代表性的粗粒度结构反映射到全原子构型，揭示了占据率超过 20% 的预测脂质相互作用区域的原子侧链细节（图 4C）。N 端 MIT 结构域第一区（Met1至Thr14）残基Met1、Thr3、Ser4、Thr5、Leu6 和Ala9 大部分具有极性，显示出较高的脂质膜占有率，而与膜相互作用的第二区残基（Tyr32至Leu64）包括Glu37、Tyr38、Phe39、Leu40、His41、Ala42、Ile43、Lys44、Tyr45、Glu46 和Ala47，代表带电和疏水残基。这些结果揭示了 VPS4A 在模型脂膜上的可能构象，并表明 VPS4A N 端 MIT 结构域有助于脂膜结合。

VPS4A MIT 结构域残基Thr3-Thr5-Lys6调节 LD 的结合和含量

    为了确定 VPS4A MIT 结构域的两个已识别区域是否调控 LD 结合，作者生成了 4 个 N 末端 mCherry 标记的 VPS4A 突变体，这些突变体的残基跨越这两个 MIT 结构域区域，即 VPS4A T3E-T5A-L6A，靶向 MIT 结构域区域 1（Met1-Thr14 ）；VPS4A E37R-Y38A、VPS4A L40S-H41A-E46R 和VPS4A K44A-Y45A-E46D ，靶向 MIT 结构域区域 2（Tyr32-Leu64 ）。如前所述，在 AML12 肝细胞中表达 mCherry-野生型（WT）-VPS4A 或单个 VPS4A 突变体，会发现当暴露于 OA 时，WT-VPS4A 与 LD 的共定位增加（图 4D）。相比之下，在所有突变体中，只有VPS4AT3E-T5A-L6A突变体显示出明显减少的 LD 定位，这与 OA 反应中增加的 LD 含量相关（图 4D）。作者通过无细胞蛋白脂质叠加（PLO）试验证实了 WT-VPS4A 直接与膜脂质相互作用。简而言之，作者利用 TnT 快速偶联转录-翻译系统在体外表达了 mCherry 或 mCherry-WT-VPS4A 或突变体 mCherry-VPS4A T3E-T5A-L6A，然后将其暴露于含有各种脂质的 PLO 检测膜条（图 4E）。有趣的是，与空对照组相比，WT-VPS4A 与膜脂质 PtdIns(4)P、PtdIns(4,5)P2 和 PtdIns(3,4,5)P3 的亲和力最强，这些脂质是 LD 磷脂单层的组成成分，与磷脂酸（PA）和磷脂酰丝氨酸（PS）的结合力一般。相比之下，突变体VPS4AT3E-T5A-L6A与 PtdIns(4)P、PtdIns(4,5)P2、PtdIns(3,4,5)P3、PA 和 PS 的结合亲和力明显降低（图 4E），这表明 VPS4A MIT 结构域Thr3-Thr5-Lys6残基调节了与 LD 的结合，从而可能调节了脂吞噬作用。

VPS4A LIR 结构域允许 LC3 结合和 LD 转换

    为了确定 VPS4A 是否以及如何与 LC3 结合，作者使用了 iLIR 数据库，该数据库显示 VPS4A 有 7 个 LIR。LC3 与自噬受体（如 OPTONEURIN）的 LIR 基团的相互作用通常受基团近端磷酸化的调控，磷酸化可增强结合能力。由于空腹诱导 VPS4A S95,S97磷酸化（图 1B），作者考察了 VPS4 LIR124IRWNDV129或147IKFPHL152（Ser95,Ser97 的远端）（图 4F）是否支持 LC3 结合。有趣的是，147IKFPHL152LIR 包含一个重叠的、内在无序的 “锚 ”区域，这预示着 LC3 结合后会更加稳定。此外，基于人工智能算法的 DeepREx-WS 根据表面暴露区域、保守残基、二级结构、疏水指数和内在无序区域，指出 VPS4A 124IRWNDV129或147IKFPHL152是潜在的 LIR。

    同样，在无细胞系统中进行的 MagneGST 拉取实验表明，WT-VPS4A 与谷胱甘肽 S 转移酶（GST）-LC3B 直接相互作用，而突变体 mLIR1-VPS4A (124IRANDA129) 或 mLIR2-VPS4A (147IKAPHA152) 未能与 GST-LC3B 结合（图 4G）。此外，当在 AML12 细胞中表达时，发现 EGFP 标记的 WT-VPS4A 与 mCherry-LC3 相互作用，而不是 VPS4A mLIR1 或 mLIR2 突变体（图 4H）。因此，与 WT-VPS4A 细胞相比，VPS4A-mLIR1 或 VPS4A-mLIR2 与 mCherry-LC3 的共定位较差，并显示出更大的 LD 数量（图 4I）。加入可阻断自噬体-溶酶体融合的长春新碱可清楚地观察到积累的自噬体，使用长春新碱可发现 WT-VPS4A 与 LC3 大量共定位，并吞噬 LD（Lipi-Blue）（图 4I，顶部，三维重建）。相比之下，VPS4A-mLIR1 或 mLIR2 未能与 LC3 共定位，这与 LD 封存减少有关（图 4I，中间和底部，三维重建）。综上所述，由于 VPS4A 同时与 LC3 和 LD 结合并调节自噬性 LD 降解，作者认为 VPS4A 是一种噬脂受体。

VPS4A S95、S97磷酸化调节 LC3 结合和脂噬作用

    由于禁食诱导的 VPS4A S95,S97磷酸化预计是由 CK2 介导的（图 1B 和 1C），而 CK2 可刺激自噬，因此作者假设 VPS4A S95,S97磷酸化可协调脂噬（图 5A）。因此，作者生成了磷酸化特异性抗体，以确定空腹时肝脏低密度脂蛋白中磷酸化-VPS4A S95,S97的富集情况（图5B）。对 EGFP-WT-VPS4A 或突变体 EGFP-VPS4A S95A,S97A进行免疫印迹证实了 VPS4A S95,S97 磷酸化特异性，结果显示 VPS4A S95,S97 磷酸化特异性 VPS4A 抗体能识别 WT-VPS4A，但不能识别突变体 VPS4A S95A,S97A（图 5C）。

    由于 LIR 动点之前的磷酸化有利于 LC3 与受体的相互作用，作者思考 VPS4A S95,S97磷酸化是否是 LC3 结合所必需的。事实上，在无细胞系统中，虽然 EGFP-WT-VPS4A 直接与 GST-LC3B 相互作用（图 4G），但磷酸化缺陷的 VPS4A S95A,S97A突变体与 GST-LC3B 的结合减少。一致的是，当在 AML12 肝细胞中表达时，EGFP-WT-VPS4A 与 mCherry-LC3 结合，而磷酸化缺陷的 VPS4A S95A,S97A 则不结合（图 5D），这表明 VPS4A S95,S97磷酸化在 LC3 结合中的作用。表达 VPS4A S95A,S97A突变体的 AML12 细胞显示出明显的 LD 累积（图 5E），与 LC3/VPS4A 和 LC3/LD （Lipi-Blue）共定位减少相关，反映出脂噬失败（图5F）。用阻断自噬体清除的长春新碱处理后，WT-VPS4A/LC3/Lipi-Blue共定位（白色像素）清晰可见，反映了LD的自噬吞噬（图5F，顶部插图，三维重建）。与此相反，尽管进行了长春新碱处理，VPS4AS95A,S97A突变体仍未能与LC3共定位并封存LDs（图5F，底部插图，三维重建）。同样，WT-VPS4A（受体）和 LDs（DPH）与 LAMP2 共定位（图 5G 和 5H），反映了它们在溶酶体中的降解；然而，VPS4A S95A,S97A突变体未能与 LAMP2 溶酶体共定位（图 5G）或支持 LD 在溶酶体中的周转（图5H）。事实上，正如预期的那样，向 WT-VPS4A 表达细胞而非VPS4A S95A,S97A 突变体表达细胞中添加 Lys Inh 增加了通过 LAMP2 溶酶体的 LDs 通量（DPH 染色）（图 5I），这表明 VPS4A S95,S97磷酸化是脂噬的必要条件。

VPS4A 可调节脂噬，但不会影响线粒体自噬或内质网自噬

    为了确定 VPS4A 是否选择性地调节脂噬，作者将 VPS4A 与线粒体、内质网（ER）或 LD 标记（即 MitoTracker、ER-tracker 或 BODIPY）共定位。有趣的是，暴露于 OA 会增加 VPS4A 与 BODIPY 的共定位，而没有观察到与线粒体或 ER 的关联（图 6A）。然后，作者分别使用（1）mKeima-red mito7、（2）ssRFP-GFP-KDEL 和（3）ssRFP-GFP-PLIN3 报告来确定 VPS4A 缺失对线粒体、ER 和 LD 标记以及 PLIN3 的溶酶体周转的影响（图 6B）。激活自噬（去除血清后）并将报告物输送到溶酶体可淬灭酸性溶酶体中的 GFP 信号，进而解除对 ssRFP/ 红色荧光的掩蔽。血清剥夺后，siCon 细胞中红色信号的出现表明线粒体自噬、内质网自噬或 PLIN3 翻转被激活（图 6C）。siCon 和siVps4a细胞中同等的红色线粒体自噬或内质网自噬报告信号表明 VPS4A 在这些途径中没有作用（图 6C）。相反，沉默Vps4a阻断了 PLIN3 的周转（由维持的 dual/ssRFP-GFP 信号表明）（图 6C），表明 VPS4A 在脂噬中的选择性作用。为了进一步证实这一点，作者生成了串联的 ssRFP-GFP-VPS4A 报告物及其磷酸化缺陷的 VPS4AS95A,S97A形式（图 6D），不出所料，血清剥夺后红色信号的出现表明诱导了脂噬（图 6E）。当使用突变体 VPS4AS95A,S97A报告时，ssRFP/红色荧光的增加被阻断（图 6E）。这些结果证实，VPS4AS95,S97磷酸化对其溶酶体降解至关重要，基于 VPS4A 的工具可以选择性地报告脂噬的变化。

    为了确定ssRFP-GFP-VPS4A报告基因在肝脏中是否起作用，作者使用肝脏限制性侵袭病毒抑制剂将WT-VPS4A报告基因质粒注射到C57BL/6J小鼠体内，然后禁食12小时（图6F）。正如预期的那样，禁食明显增加了 RFP+GFP- 红色点（而在进食状态下 RFP+GFP+ 共定位点较高），表明 VPS4A 在酸性细胞器中的周转增加（图 6F）。此外，禁食增加了ssRFP+GFP-/Lipi-Blue（LD）共定位信号（品红色），表明VPS4A标记的LD被固着在溶酶体中（图6G）。由于 VPS4A 的耗竭并不影响 LC3 点或 LAMP2 囊泡的数量、大量自噬通量或线粒体自噬或内质网自噬（图 6C），但却单一地影响了脂噬，因此作者提出 VPS4A 是脂噬的选择性受体。

缺失 VPS4A 或阻断 VPS4AS95,S97磷酸化可抑制小鼠肝脏的脂噬作用

    然后，作者试图检验沉默Vps4a是否会导致小鼠肝脏脂噬功能失效。事实上，与 siCon 相比，沉默Vps4a或Vps4b或Atg7会增加油红 O（ORO）染色和肝脏甘油三酯（TG）水平，并同时降低肝脏呼吸（图 7A-7D）。脂质积累是由于 LD 降解受损，而不是由于肝脏脂质从头合成或分泌的变化，这一点可从途径受限基因的等效表达看出。此外，沉默Vps4a或Atg7 而非Vps4b 可阻断 BODIPY/LAMP2 的共定位，表明向溶酶体输送 LD 的能力受损，并导致 P62 标记的 LD 累积，反映了脂噬失败。

    为了确定肝脏脂噬是否需要 VPS4A S95,S97磷酸化，作者给小鼠注射了肝脏定向 siCon 或siVps4a小干扰 RNA（siRNA）。然后，作者用 EGFP 标记的对照质粒注射 siCon 肝脏，并用 EGFP 标记的对照质粒或 EGFP-WT-VPS4A 或 EGFP 突变的 VPS4A S95A,S97A质粒重组siVps4a肝脏（图 7E）。通过免疫荧光确定 EGFP 的等效表达。与 siCon 相比，禁食siVps4a的肝脏显示出明显的 LD 累积（ORO 染色和 TGs 增加）（图 7F-7H）。用 WT-VPS4A 而非磷酸化缺陷的 VPS4A S95A,S97A突变体重组siVps4a肝脏，可使肝脏 LD 含量/TGs 恢复到基线水平（图 7F-7H）。siVps4a或 VPS4A S95A,S97A 表达肝脏中肝脏 LD 的积累是由于脂噬功能降低（BODIPY/LAMP2 共定位减少）所致。同样，siVps4a肝脏显示 P62/BODIPY 共定位增加（反映了 P62 标记的 LDs 的积累），通过重组 WT-VPS4A 而非突变体 VPS4A S95A,S97A逆转了这一现象。沉默Vps4a或Atg7的小鼠在基础喂养状态下肝脏 LDs 和 TGs 也升高，证实 VPS4A 调节体内基础和禁食状态下的脂噬。

Vps4a下调与人类脂肪性肝病中的脂噬受阻有关

    为了确定这些发现是否与人类脂肪性肝病有关，作者对人类对照组、酒精性脂肪性肝炎（ASH）和 MASH 肝脏中的 VPS4A、PLIN3、LAMP2 和 P62 进行了免疫染色（图 7I 和 7J）。根据作者在肝细胞/小鼠肝脏中的发现，作者将 VPS4A/PLIN3 和 PLIN3/LAMP2 共定位分别作为受体-LD 结合和溶酶体 LD 降解的标记。作者还将疾病相关的 P62/PLIN3 共定位增加作为脂噬失败的标志。其原理是，由于清除能力受损，脂噬功能丧失会导致 P62 标记的 LD 累积。

    有趣的是，与对照组相比，ASH 和 MASH 肝脏都显示出 VPS4A 的显著耗竭（图 7J 和 7K），同时 PLIN3 和 P62 水平升高（图 7J、7L 和 7M），分别表明脂肪变性和自噬功能丧失。ASH 和 MASH 肝脏中的 LAMP2 点也减少了，反映了溶酶体体积的损失（图 7J 和 7N）。同样，ASH 和 MASH 肝脏显示出 VPS4A/LAMP2 共定位减少（图 7J 和 7O）和 P62 标记的 PLIN3+LDs 增加（图7 J 和 7P），但不影响 VPS4A/PLIN3 关联（图 7J 和 7Q），反映出溶酶体 LD 的周转受损。事实上，VPS4A 蛋白表达与大骨质疏松（大脂肪百分比）（图 7R）、PLIN3 水平（R2= 0.7155；p≤ 0.0001）（图 7S）和 P62 水平（R2= 0.6031；p≤ 0. 0001）（图 7T），而 P62 的增加与 PLIN3 水平正相关（R2= 0.8139;p≤ 0.0001）（图 7U），表明 VPS4A 水平降低与人肝脏脂肪变性和脂噬缺陷有关。相反，PLIN3 的水平与 P62 呈正相关，强调了人类肝脏中脂质积累与自噬失败之间的联系（图 7V）。综上所述，作者认为 VPS4A 是小鼠和人类肝脏中的选择性脂噬受体。