新辅助卡瑞利珠单抗(抗PD-1抗体)联合化疗或阿帕替尼(VEGFR-2抑制剂)治疗初始不能切除的II-III期非小细胞肺癌

发表日期：2024.6.14

这项多中心、双臂、2期研究的目的是探索新辅助剂卡瑞利珠单抗加化疗或阿帕替尼在最初无法切除的II-III期非小细胞肺癌(NSCLC)患者中的有效性和安全性。符合条件的患者无论PD-L1表达如何，均接受新辅助卡瑞利珠单抗200 mg加铂双联化疗，每3周一次(A组)或PD-L1阳性肿瘤患者接受新辅助卡卡瑞利珠单抗和阿帕替尼250 mg每日1次(B组)，疗程2~4个周期，然后手术。主要终点为主要病理反应率(MPR)。A组30例，B组21例。A组和B组的手术率分别为50.0%(15/30)和42.9%(9/21)，均获R0切除。这些患者的MPR和病理完全缓解率在A组均为20.0%，在B组分别为55.6%(95%CI 21.2~86.3)和11.1%(95%CI 0.3~48.2)。客观缓解率分别为33.3%(95%可信区间11.8~61.6)和55.6%(95%可信区间21.2~86.3)。中位随访期为22.4个月(95%可信区间19.0~26.0)，中位无事件生存期在A组未达到（NR；95%CI 13.6-NR），在B组16.8个月（95%CI 8.6-NR）。A组8例(26.7%)和B组3例(14.3%)发生3级及以上治疗相关不良事件。生物标记物分析显示，基线TYROBP的表达可以预测B组的治疗反应。新辅助剂卡瑞利珠单抗加化疗或阿帕替尼对最初无法切除的II-III期非小细胞肺癌患者显示出初步疗效和可控的毒性。

肺癌是第二大常见恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的首要原因。2020年全球约有220万起新病例和180万人死亡^[1]。在中国，根据中国国家癌症中心的最新统计，2022年肺癌仍是最常见的恶性肿瘤，发病率(106万例)和死亡率(73万例死亡)都是最高的^[2]。非小细胞肺癌(NSCLC)是肺癌的主要病理亚型，占所有病例的85%至90%^[3]。近一半的患者最初被诊断为早期、局限性或区域性非小细胞肺癌，根据肿瘤和淋巴结的状况，可进一步将其分为可切除、潜在可切除或最初不可切除的疾病^[4,5]。对于这三种疾病分类，治疗选择各不相同。

在过去的十年中，抗程序性细胞死亡配体1(PD-[L]1)抗体的免疫治疗取得了突破性进展，改变了晚期驱动基因阴性非小细胞肺癌的综合治疗模式。鉴于免疫治疗在晚期疾病中的突出疗效，以及高肿瘤负担和有限的抗原异质性与抗PD-(L)1抗体疗效的改善之间的关联，这表明在新辅助环境下可能是免疫治疗的最佳时机^[6]，基于免疫治疗的新辅助策略已被研究用于可切除或潜在可切除的非小细胞肺癌。三个随机的第三阶段试验评估了抗PD-1抗体nivolumab(Checkmate 816)^[7]、pembrolizumab(Keynote-671)^[8]和toripalimab(Neotorch)^[9]，以及第四个试验评估了抗PD-L1抗体duvalumab(Aegean)^[10]与化疗相结合作为可切除或潜在可切除的NSCLC的新辅助治疗，与单纯新辅助化疗相比，无事件生存期(EFS)和病理完全缓解(PCR)均有显著改善。目前，这种免疫治疗结合化疗的新辅助策略已被推荐用于无驱动基因改变的可切除或潜在可切除的肿瘤。除了这一策略外，免疫治疗和抗血管生成治疗在这一人群中也在探索，前提是重塑免疫抑制的肿瘤微环境，并用抗血管生成药物增强抗肿瘤免疫，反映出与免疫治疗的协同抗肿瘤作用^[11、12]。EAST Energy研究评估了新辅助剂Pembrolizumab联合ramucirumab(一种抗血管内皮生长因子受体-2[VEGFR-2]单抗)治疗可切除PD-L1阳性IB-IIIA期NSCLC的效果，结果显示病理结果令人鼓舞，主要病理反应(MPR)率为50.0%，PCR率为25.0%^[13]。值得注意的是，尽管这些试验表明包括“可切除的肿瘤”，但可切除的定义并不明确。在几项研究中，如Nadim II和AEGEAN，也招募了患有多站N2病的患者，^[10,14]而这一亚群传统上被认为是不可切除的。

2017年，PACIFIC研究开启了巩固免疫治疗的新纪元，在最初不能切除的NSCLC患者中明确地同时进行放化疗后，显示放化疗后的durvalumab显著改善了无进展生存(PFS)，将进展或死亡的风险降低了48%^[15]。根据令人印象深刻的数据，它还将同步放化疗后的巩固免疫疗法确立为最初无法切除的II/III期非小细胞肺癌的治疗标准。然而，对于这种患者亚群的最佳方式一直存在争议，特别是关于不能切除的II/III期NSCLC在新辅助免疫疗法降级后是否可以转变为可切除疾病的问题。到目前为止，只有少数来自回顾性研究的数据表明，在最初不能切除的非小细胞肺癌中，新辅助免疫治疗后再手术可能是安全和可行的^[16-18]。例如，Deng和他的同事评估了51名最初无法切除的IIIB期NSCLC患者，这些患者接受了抗PD-1抗体联合铂类化疗，发现在化学免疫治疗后接受手术的患者的中位无病生存期(DFS)或PFS为27.5个月，这相对长于那些没有接受化学免疫治疗的患者(无反应者为4.7个月，有反应者为16.7个月)^[18]。然而，在这种情况下，预期的证据仍然很少。

人源化高亲和力IgG4-kappa抗PD-1单抗Camrelzumab已被批准作为中国治疗晚期非小细胞肺癌的一线联合化疗方案^[19-20]。据报道，当联合化疗或抗血管生成药物阿帕替尼(一种针对VEGFR-2的酪氨酸激酶抑制剂)作为可切除非小细胞肺癌的新辅助治疗时，也有良好的病理结果^[21-22]。TD-FOREKNOWN试验显示，与仅使用单纯新辅助化疗相比，在以铂为基础的新辅助化疗中加入camrelizumab显著提高了可切除III期非小细胞肺癌患者的PCR率(32.6%比8.9%；优势比4.95；95%可信区间[CI]1.35-22.37)^[21]。同时，Zhao等人进行的一项2期研究报告称，在可切除的IIA-IIIB期(仅T3N2)非小细胞肺癌患者中，新辅助剂camrelizumab联合阿帕替尼的MPR率为57%，PCR率为23%^[22]。在这种背景下，不能切除的非小细胞肺癌患者是否也能从基于camrelizumab的新辅助治疗中受益值得探讨。在此，我们报告了一项多中心、双臂、2期研究的结果，该研究评估了卡米珠单抗联合铂双联化疗(arm A)或联合阿帕替尼(arm B)作为新辅助治疗对最初不能切除的II-III期非小细胞肺癌患者的有效性和安全性。

患者和治疗方法

在2020年9月29日至2022年6月29日期间，纳入了30名A组和21名B组的符合条件的中国患者(图1)。所有这些患者都接受了预先指定的新辅助方案的治疗，并纳入了全面分析的人群。患者的基线特征如表1所示。大多数患者为男性，A组为93.3%(28/30)，B组为81.0%(17/21)。在A组中，23例(76.7%)患者的ECOG PS为0，在B组中，而半数患者(52.4%)的ECOG PS为1。此外，在A组，26例(86.7%)患者为IIIA期，14例(46.7%)为N2；B组18例(85.7%)，12例(57.1%)。

在30名患者中，4名(13.3%)在A组只接受了一个周期的新辅助治疗，包括两个由于COVID19大流行，以及两个由于患者的决定和不良事件；而在B组，所有(100%)患者都按计划完成了新辅助治疗周期。两组新辅助治疗周期的中位数均为3个。最后一次新辅助治疗与手术之间的中位间隔，A组为47天(32-113)，B组为42天(30-139)。在A组和B组，分别有10名和7名患者可使用辅助方案。在A组，8名患者(80.0%)接受了铂双联辅助化疗，1名患者(10.0%)接受了随后的草药治疗和一名是Camrelzumab单药治疗；而在B组，4名患者(57.1%)接受了铂双联化疗，2名患者(28.6%)接受了辅助化学免疫治疗疗，1名患者(14.3%)接受了Sintilimab单药治疗。

手术

在A组，30例患者中有15例(50.0%)接受了手术，R0切除率为100.0(95%可信区间78.2-100.0；补充表1)。B组手术切除9例(42.9%)，均为R0切除(95%可信区间66.4~100.0)。所有这些接受手术的患者(A组15例，B组9例)都包括在疗效分析人群中。手术失败的最常见原因是不完全切除(A组66.7%^[10/15]，B组50.0%^[6/12])。每个患者潜在无法切除的详细原因见补充信息。A组延迟手术3例(20.0%)，B组延迟手术2例(22.2%)，未发生新辅助治疗相关手术延迟。

在两组患者中，视频辅助胸腔镜术的使用更为普遍(A组60.0%，B组77.8%)。最常见的手术方式是肺叶切除术(分别为46.7%和44.4%；补充表1和补充图1)。手术并发症在A组3例(20.0%)，术后感染2例，肺栓塞1例；B组无一例发生手术并发症，本研究中无患者在术后90天内死亡。

有效性

在A组，接受手术的15名患者中有3名(20.0%，95%可信区间4.3-48.1)有MPR，所有这些患者都PCR(表2和补充图2)。根据实体瘤反应评估标准(RECIST)1.1版，5例(33.3%)患者部分缓解(PR)，8例(53.3%)患者病情稳定(SD)，放射学客观有效率(ORR)为33.3%(95%可信区间11.8~61.6)。在B组，在9名接受手术的患者中，5名患者(55.6%，95%可信区间21.2-86.3)有MPR，其中1名患者(11.1%，95%可信区间0.3-48.2)PCR（表2）。根据术前放射学评价，5例(55.6%)获得PR，相应的ORR为55.6%(95%可信区间为21.2~86.3)。4例(44.4%)患者出现SD。

对于无论手术与否都有治疗意向的患者，在A组，MPR和PCR率均为10%(3/30，95%CI为2.1~26.5)，ORR为26.7%(8/30，95%CI为12.3~45.9)；B组的MPR率、PCR率和ORR分别为23.8%(5/21，95%CI 8.2~47.2)、4.8%(1/21，95%CI 0.1~23.8)和33.3%(7/21，95%CI 14.6~57.0)(补充表2)。

截至2023年6月1日，中位随访期为22.4个月(95%可信区间19.0~26.0)。如图2a，b所示，中位EFS未达到(NR)(95%可信区间13.6-NR)，A组6个月和12个月生存率分别为80.0%(95%可信区间60.8~90.5)和76.7%(95%可信区间57.2~88.1)；B组相应的值为16.8个月(95%可信区间8.6-NR)、85.7%(95%可信区间62.0-95.2)和60.7%(95%可信区间36.5-78.1)。在数据截止日，中位总存活率(OS)是不成熟的，A组和B组分别有10和7例死亡(图2C，d)。A组12个月和24个月OS率分别为80.0%(95%CI 60.8~90.5)和65.2%(95%CI 44.7~79.7)，B组分别为71.1%(95%CI 46.6~85.9)和65.2%(95%CI 40.2~81.8)。此外，术后分析显示，在两组中，与非手术人群相比，在手术人群中观察到了改善EFS和OS的趋势(补充图3和4)。

安全性

新辅助治疗相关不良事件(TRAE)如表3所示。A组30例患者中，24例(80.0%)出现至少1次任意等级的TRAEs，其中8例(26.7%)出现3级或以上TRAEs，主要为中性粒细胞减少(5例[16.7%])、血小板减少(3例[10.0%])、贫血和白细胞减少(各2例[6.7%])。B组21例中18例(85.7%)出现TRAE，3例(14.3%)TRAE3级或以上，其中丙氨酸氨基转移酶升高2例(9.5%)，天冬氨酸转氨酶升高1例(4.8%)，血胆红素升高1例(4.8%)。免疫相关不良反应(IrAEs)A组8例(26.7%)，B组7例(33.3%)，其中1~2级和3级以上分别为1例(3.3%)和2例(9.5%)(补充表3)。A组1例(3.3%)和B组5例(23.8%)出现反应性皮肤毛细血管内皮细胞增生，这是与Camrelzumab相关的常见IRAE，均为1/2级。

A组中有2名患者(6.7%)因不良反应而停用任何治疗成分：1名患者因4级自身免疫性肝炎而停用camrelizumab，1名患者因4级血小板计数下降而停用吉西他滨。在B组，由于担心出血风险增加，1例再次发生咯血(1级)的患者停止了新辅助治疗。两个组均未发生与治疗相关的死亡。

探索性生物标志物分析

B组有13例患者有基线肿瘤标本。我们在组B进行了差异表达基因分析，发现2250个基因在应答者(n=2)和无应答者(n=11)之间差异表达(1103个高表达在应答者，1147个高表达在无应答者高1147)(图3a)。其中，TYROBP和PILRA在应答者(图3a)中显著过度表达(P<0.001)，与PD-1和PD-L1(图3C)相比，对治疗反应的预测能力较好(曲线下面积分别为0.909和0.818)。

根据AUC值，选择TYROBP进行进一步分析，发现TYROBP表达较高的患者在B组(图3d，e)的OS(P=0.11)和EFS(P=0.0099)也较好。此外，当在其他肺癌免疫治疗数据集中验证时，基线TYROBP在应答者中的表达更高，并可以预测GSE207422(补充图5A，b)、GSE111414(补充图5C，d)、GSE126044(补充图5e，f)和GSE135222(补充图5G，h)的免疫治疗效率[23-26]。此外，在GSE135222(补充图5I)中，TYROBP高表达的患者显示出更好的PFS(P=0.0085)。在最近接受免疫检查点阻断的NSCLC的大型队列中^[27]，在应答者中也观察到更高的TYROBP表达趋势(补充图5J)。同时，在Patil‘s队列中，TYROBP高表达的患者也有较好的OS(P=0.0016)和PFS(P=0.00076)(补充图5K，L)。

基因集富集分析(GSEA)发现了几个与免疫相关的过程，包括“干扰素伽玛应答”、“NK细胞介导的细胞毒性”和“抗原处理和递呈”，这些过程在组B的应答者中显著富集(图3B)。此外，免疫评分也很高，CD8+T细胞在应答者的肿瘤标本中显示出越来越多的渗透(图3F，g)。至于多个T细胞相关基因，我们发现CCL5和NKG7在应答者中高表达(图3H)。在对免疫谱系的分析中，我们发现TCR读数的一部分，以及唯一的TCR互补决定区3(CDR3)在应答者中较高(图3i，j)。

目前，潜在的可切除和不可切除的非小细胞肺癌没有统一的界限，诊断往往高度依赖于影像和当地胸科医生的经验，结果可能是不同医院的治疗建议不同^[28-29]。新辅助化疗免疫疗法对可切除的III期非小细胞肺癌的显著益处促使临床医生考虑新辅助联合免疫疗法是否能将最初不能切除的非小细胞肺癌转变为可切除的非小细胞肺癌，从而为患者提供进一步的益处^[14,30,31]。在这项研究中，camrelizumab联合铂双联化疗导致50.0%的初始无法切除的II-III期非小细胞肺癌患者变得可以接受手术切除，无论PD-L1表达如何。MPR和PCR率为20.0%(95%可信区间4.3-48.1)。此外，camrelizumab联合阿帕替尼导致42.9%的PD-L1阳性的患者接受手术，MPR和PCR率分别为55.6%(95%CI 21.2~86.3)和11.1%(95%CI 0.3~48.2)。据我们所知，这是第一个旨在评估化疗或抗血管生成药物联合免疫疗法的新辅助治疗作为初始无法切除的II-III期非小细胞肺癌患者的前瞻性试验，并为新辅助药物camzumab联合铂双联化疗或阿帕替尼在该人群中的应用提供初步证据。

以前基于新辅助免疫治疗的试验主要针对可切除的非小细胞肺癌，也改变了可切除疾病的新辅助治疗范例，在此背景下，Liang等人建议，可以考虑对最初不能切除的局部晚期非小细胞肺癌进行新辅助免疫治疗，并在肿瘤分期降低后重新评估手术的可能性^[32]。然而，支持这一点的现有证据极其稀缺。Deng等人回顾报道，31例最初不能切除的非小细胞肺癌患者通过新辅助化疗免疫治疗成功地实现了肿瘤降期，并接受了随后的手术，其中67.7%的患者实现了MPR^[18]。在LungMate 002的研究中，最初不可切除的分期2-3期非小细胞肺癌的38名患者中，在经过新辅助toripalimab加化疗治疗后24名（63.2%）患者成功地传化为可切除，并最终接受了手术，所有患者均达到R0切除^[33]。不幸的是，这项研究没有报告这一人群的病理结果。在我们的研究中，A组50.0%的最初不可切除的患者和B组42.9%的患者成功地完成了手术，并且都进行了R0切除。此外，我们针对这一人群的新辅助联合治疗在A组获得了20.0%的MPR和PCR率，在B组分别达到了55.6%和11.1%。这些发现初步证明了在最初不能切除的人群中使用新辅助的Camrelizumab加化疗或阿帕替尼的可行性，但我们应该承认，患者群体太小，不能保证发现的准确性。

在最初的治疗后降级的不能切除的III期NSCLC，手术是否应该作为的一种治疗方式，一直存在争议。PACIFIC 研究报告称，对于不能切除的II/III期非小细胞肺癌患者，在明确的同步放化疗后使用Durvalumab作为标准的巩固治疗产生了令人满意的疗效，中位PFS为16.8个月，12个月PFS率为55.9%^[15]。基于这些结果，Moghanaki等人认为，在非手术治疗效果良好的情况下，出于安全考虑，不应建议不能切除的NSCLC患者在手术后进行新辅助免疫治疗^[30]。由于不可切除疾病的负担较高，即使新辅助免疫疗法可以减轻肿瘤负担，但它通常不会减少对激进手术(例如，右全肺切除术)的需求，并可能导致更高的手术并发症风险^[30]。相反，Dickhoff和他的同事认为，不能切除的III期NSCLC在局部复发的情况下往往难以治疗，而通过有效的初始(新辅助)治疗，转化为可切除的疾病是可能的，手术可能通过增加局部控制率进一步提高患者的存活率^[31]。在我们的研究中，在最初不能切除的II-III期患者中观察到了良好的生存结果，中位EFS在A组是NR，B组为16.8个月，12个月的EFS率分别为76.7%和60.7%。此外，只有2名患者在A组和1名在B组患者行全肺切除术，术后并发症的发生率也很低(分别为20.0%和0%)，没有患者在手术后90天内死亡。这些结果表明，最初无法切除的II-III期非小细胞肺癌患者在接受新辅助camrelizumab加化疗或阿帕替尼治疗后，似乎可以安全地接受手术治疗。

关于Camrelizumab加阿帕替尼疗效的潜在预测标记物，我们认为TYROBP是一个有希望的预测治疗反应的标记物。目前，TYROBP，也被称为DAP12，已经在各种癌症中进行了研究^[34-36]。在功能上，TYROBP在多种免疫细胞表面编码一种跨膜信号多肽，在其胞浆结构域中含有一个基于免疫受体酪氨酸的激活基序，并介导信号转导^[37,38]。已有报道TYROBP的表达与胃癌和肾透明细胞癌中CD8 T细胞的浸润有关^[34-35]。以往的研究也揭示了TYROBP在NK效应反应中的关键作用，其失调可能严重影响NK细胞的功能^[38,39]。TYROBP在应答者的肿瘤样本中显著过表达，它的表达为我们的发现和另外五个免疫疗法治疗肺癌的队列提供了预测免疫疗法疗效的潜力。总体而言，TYROBP可能是免疫治疗效率的一个有前途的预测标志。

在这项研究中，Camrelizumab与化疗或与阿帕替尼的组合是安全和耐受性良好的，安全性概况与之前报道的单一药物在非小细胞肺癌和其他实体肿瘤中的数据基本一致^[21,22,40]。与 camrelizumab相关的大多数不良反应在两个组中都是1级或2级，其常见的AE反应性皮肤毛细血管内皮细胞增殖的发生率与其他基于 camrelizumab的新辅助研究相似^[40,41]。没有发现新的安全信号。

这项研究有几个局限性。首先，由于这项研究的探索性性质，纳入的患者数量很少，特别是在B组，而且缺乏对照组，这可能会降低观察到的效果的确定性。其次，按性别、吸烟和组织类型划分的纳入人口的不平衡可能会带来偏见。第三，可用的治疗前和治疗后的肿瘤样本不足以分析潜在的预测生物标志物。在未来的更大样本的研究中，有必要对分子特征进行进一步的全面探索

综上所述，新辅助剂camrelizumab加铂双联化疗或阿帕替尼对初始不能切除的II-III期非小细胞肺癌患者显示出初步疗效和可控的毒性，这一策略可能代表着将最初不能切除的疾病转变为可切除疾病的新机会。未来还需要更大的样本研究来证实我们的发现。

研究设计和参与者

这是一项前瞻性、多中心、双臂、非随机、2期的探索性研究，在中国的6个地点进行(NCT04379739)。这项研究是根据赫尔辛基宣言和良好临床实践进行的，并得到了每个地点的伦理委员会的批准。在研究开始前，从每个患者那里获得书面知情同意。

符合以下条件的患者符合条件：年龄18-75岁；接受过组织学或细胞学证实的最初治疗无法切除的II-III期NSCLC(根据美国癌症TNM分期系统第八版)；ECOG PS为0或1；有RECIST标准1.1版可测量的疾病，以及有足够的器官功能。最初不能切除的疾病由多学科临床小组(MDT)评估，定义为(1)肿瘤侵犯重要结构，如大血管、气管或主支气管，但根据术前评估，经新辅助治疗后肿瘤分级降低可根治性切除；(2)临床证实有多站转移或大融合的淋巴结，术前评估新辅助治疗肿瘤分级降低后能耐受肺门和纵隔淋巴结清扫，或(3)根据术前评估，即使行全肺切除，尤其是右全肺切除，R0切除也可能达不到。无论PD-L1表达如何，患者都加入arm A，基线PD-L1表达为1%或更高，没有未控制的高血压，没有血栓事件，没有明显的出血倾向的患者加入arm B。两个组的主要排除标准包括已知的EGFR突变或ALK融合，自身免疫性疾病病史，过去5年内有其他恶性肿瘤病史，以及在研究治疗前2周内接受皮质类固醇(>10毫克/天相当于泼尼松)或其他免疫抑制药的系统治疗。

进程

A组患者接受2~4个周期的新辅助化疗：camrelizumab(200 mg，第1天)和铂双联化疗(鳞状NSCLC：卡铂AUC 5，第1天，吉西他滨1000 mg/m₂，第1天和第8天[或紫杉醇135~175 mg/m₂，第1天，或多西紫杉醇60~75 mg/m₂，或nab-紫杉醇260 mg/m2，第1天]；非鳞状NSCLC：卡铂AUC 5，第1天，培美曲塞500 mg/m₂，第1天)静脉注射每三周一次。在B组，患者每3周接受2-4个周期的新辅助治疗，camrelizumab和阿帕替尼(250 mg，每天一次)口服。

在前两个治疗周期后，进行了胸部增强CT扫描。如果根据RECIST 1.1版获得肿瘤缓解(完全缓解[CR]或PR)，并且MDT评估手术是安全和可行的，则在肿瘤评估后30天内计划手术；否则，继续新辅助治疗周期3。关于是否继续第4周期治疗的决定与前一个周期类似。如果患者不能耐受所有四个周期的新辅助治疗，他们也可以提前接受手术。在最后一次治疗3~4周后进行增强CT和磁共振成像的放射学评估，然后MTD根据肿瘤的位置、肿瘤的侵犯程度、淋巴结状况和身体状况进行综合评估，以确定肿瘤的可切除性。病理反应按照前面的描述进行评估^[42]。患者术后30d行胸部CT扫描，术后2年每3个月复查一次，第3~5年每6个月复查一次。在整个试验过程中，对AES进行了持续监测，并根据国家癌症研究所不良事件通用术语标准5.0版对其进行分级。基线时的PD-L1肿瘤比例评分通过22C3药物Dx分析(美国加利福尼亚州安捷伦技术公司)进行测量。

终点

主要终点是MPR率，定义为在切除的原发肿瘤中残留的存活肿瘤细胞不超过10%。次级终点包括PCR率(定义为在切除的原发肿瘤处没有残留存活肿瘤细胞)、ORR(定义为根据RECIST版本1.1的CR或PR)、EFS(定义为从开始新辅助治疗到第一次发生疾病进展、排除手术疾病、局部或远处复发或任何原因死亡的时间)、1年和2年EFS率、DFS(定义为从手术到疾病复发或任何原因死亡的时间)、1年和2年DFS率，OS(定义为从开始新辅助治疗到死于任何原因的时间)、R0切除率(定义为切缘阴性切除患者的比例)和安全性。

RNA测序

用TRIzol试剂盒提取新鲜冰冻组织总RNA。使用用于Illumina的NEBNext Ultra RNA文库制备试剂盒产生测序文库，并将索引代码添加到每个样品的属性序列。将文库汇集，并使用Illumina NovaSeq 6000进行配对末端测序(2×150个碱基对读数)。在RNAseq测序后，通过FAST P修剪原始FASTQ，并通过剪接的转录本与具有默认设置的参考(STAR)的比对来与GRCh38参考基因组比对。在获得BAM后，按FeatureCounts汇总读取计数，并使用Salmon生成TPM(每百万次传输。使用SVA包中的“combat”功能调整批处理效果。

差异表达基因分析

我们使用DESeq2来计算样本组之间的差异基因表达。DESeq2根据模型基因计数表达数据分析基因，并计算log2倍变化，这估计了效应大小，并代表了对照组之间的基因变化。计算双侧Wald检验统计量，以检验比较组之间的差异表达。将|log2倍变化|>1和Wald检验P<0.05的基因定义为差异表达基因。我们使用火山图来可视化差异基因表达的结果。

生物标志物选择

我们通过deseq2分析了应答组中上调的基因(log2FC>1，P<0.05)和发现数据集中有预后价值的基因(HR<1，对数列P<0.05)。然后应用多种免疫疗法治疗的肺癌数据集来辅助分析，重点放在GSE207422、GSE126044和GSE135222中应答组上调的基因。将发现数据集和已发表数据集的结果结合起来，选择了两个基因“TYROBP”和“PILRA”。计算发现数据集中这两个基因的AUC值，并基于最高AUC值选择用于分析的最终生物标志物。

基因集富集分析

对于GSEA，所有蛋白质编码基因的结果以log2倍变化进行排序，并使用“GSEA”算法进行评估。“Hallmark”和“KEGG”基因集来自MSigDb。我们根据P<0.05的标准对GSEA结果进行过滤，并基于归一化富集分数可视化候选路径。

肿瘤微环境评价

每个样本的免疫分数是通过使用表达数据估计恶性肿瘤的间质和免疫细胞的R包来计算的。用“微环境细胞群计数器(MCP-Counter)”评价免疫细胞的渗入情况。对于免疫谱系分析，应用TRUST4算法对免疫谱系进行评估，并提取T和B细胞受体(分别为TCR和BCR)CDR3序列。

统计分析

由于最初无法切除的非小细胞肺癌患者的病理反应尚不清楚，因此在我们的研究中没有进行正式的样本量计算。对于这项研究的探索性，确定了每个组最小样本量为20名患者。

在疗效分析人群中评估与反应相关的终点，该人群包括接受至少一剂新辅助治疗并接受手术的所有患者。生存和安全性分析是在全分析人群中进行的，包括所有接受过至少一剂新辅助治疗的患者。用Clopper-Pearson方法估计MPR率、PCR率、ORR和R0切除率的95%CIs。无事件时间分析采用Kaplan-Meier方法，中位生存时间按Brookmeyer-Crowley方法显示95%CIs，生存率与95%CIs采用互补对数-对数变换法。用频数(百分比)对TRAE进行汇总。此外，通过手术后分析，对EFS和OS进行了分层。用Wilcoxon秩和检验比较各样本组间的表达差异。为了将患者分为低TYROBP组或高TYROBP组，使用Survminer软件包根据TYROBP表达与生存数据之间的关联生成截止值。所有报告的P值都是双侧的，P<0.05被认为具有统计学意义。使用SAS软件(版本9.4；SAS Institute，Inc.，Cary，North Carolina)和R 4.1.0进行统计分析。