“形形色色”——细胞染液简史篇
文摘
科学
2023-10-10 16:50
上海
文案 | 孙晓冰
审核 | 吴 炯
19世纪中叶，欧洲流行疟疾，每天要死亡数以百计的人。许多科学家日以继夜在寻觅治疗疟疾的良药，以对付这种可怕的疾病。1856年英国化学家W.H.帕金（William
Henry Perkin）在用化学合成的方法制造奎宁时，意外发现一种紫色物质-“苯胺紫”，首先发明了染料的人工合成方法。不久，德国化学家A.W.霍夫曼相继合成了染料碱性品红和苯胺蓝。在应用染料过程中发现其不仅可以染色布料、毛皮，而且还可以使动物组织着色。更有趣的是，有些染料能使某些特定的细胞而不是所有的细胞着色，还有一些染料能使一种细胞的某一部分而不是整个细胞着色。于是，染料成了科学家观察有机体结构的一种非常有用的工具。这其中不得不提的就是著名的组织学家、免疫学家、化学疗法的先驱、科学史上罕见的奇才——保罗·埃里希（Paul Ehrlich）。William
Henry Perkin
Paul Ehrlich
保罗·埃里希1854年出生在位于柏林东南240公里的一个小村庄(这个村庄现在是波兰的一部分)，犹太人。埃里希六七岁时，就在表哥卡尔·维格特（Carl Weigert）关注的目光下开始追寻他所热爱的科学了。维格特年长保罗9岁，是德国著名的病理学家和组织学家，也是细菌和组织染色方法的创立者。他发明的许多人体组织和细胞的染色方法，有些一直尚用至今，他于1860年前后发现，在德国用于纺织业的合成染料苯胺染色剂在标记人和动物组织时有意想不到的良好效果，它不会使组织周围的细节变得模糊不清。这种着色能力很强的染料不但使组织变亮，而且明显暴露了他们的差异与结构，从而使显微标本的观察分析变得更加容易。维格特将这一重要发现介绍给了他的表弟，埃里希从此开始了他自己的实验。1872年，埃里希离开家乡进入布雷斯劳大学学习医学。在斯特拉斯堡大学，埃里希在19世纪最伟大的解剖学家之一威尔海姆·冯·瓦尔代尔（Wilhelm von Waldeyer）的指导下，发明了一种技术：“选择性染色技术”，将表哥维格特的发现向前推进了一步。使用自己配置的染料，他发现每个组织标本中的细胞成分会对染料作出不同的反应，并且展现出不同的颜色深浅，其形态非同寻常地清晰。1873年德国医生和细胞学家吉姆萨（Gustay Giemsa）提出了伊红染色技术，他将伊红染料与水合氧化亚铁一起使用，发现染色效果非常好，能够清晰的显示出细胞核、染色体和其他细胞结构的形态。这种方法就是后来的Giemsa染色，也成为伊红-氧化亚铁染色。1876年德国化学家海因里希·卡罗（Heinrich Caro）制备了亚甲蓝。1891年保罗·古特曼（Paul Guttmann）和埃里希发现亚甲蓝会对疟原虫染色，因此推断其有可能治疗疟疾。在太平洋战争中，日军与美军都使用亚甲蓝作为抗疟药。但因为其暂时性副作用--服药者会出现尿液与巩膜（即眼白）变蓝色或绿色（低剂量时）--不受士兵们喜欢而在战后淡出舞台。同年，埃里希在一本关于有机体组织对染料的不同反应的著作中，介绍了血细胞的染色方法。1898年，埃里希与同事Lazarus及Orange G，甲基绿和酸性品红的混合物——三酸混合染色液，应用于外周血染色，又合作出版了一本论贫血的著作，总结了正常和病理情况下对血液的观察，内容包括血液观察的方法学、正常和病理情况下的红细胞、各种白细胞、淋巴细胞以及白血病的细胞特点等。埃里希并不只是满足简单地观察人体内大量吸引着他而且令他印象深刻的细胞，而且试图找到那些使染色剂能够固定在标本上的原因。在研究过程中，埃里希发现染料分为酸性、碱性和中性三类，不同的染料对于白细胞内的颗粒染色结果不同，由此他第一次提出了白细胞的分类方法。埃里希因为这些著名的观察和方法学的建立，被誉为现代血液学的奠基人。![]()
1891年俄罗斯学者罗曼诺夫斯基（D.L.Romanowaky）发现亚甲蓝可以连续脱甲基并形成所有的三甲基、二甲基、单甲基和非甲基中间体，分别对应天青A、天青B、天青C及硫堇。这是罗曼诺夫斯基-吉姆萨效应光谱中嗜碱性部分的基础。如果只使用合成的天青B和曙红Y，它可以作为标准的吉姆萨染色剂；但是，如果没有亚甲蓝，正常的中性粒细胞粒往往会过度染色，看起来像有毒细胞粒。另一方面，如果使用亚甲蓝，可能有助于呈现中性粒细胞颗粒的正常外观，也能增强核仁和多色性红细胞（网织红细胞）的染色，在此理论基础上，首创了含有亚甲蓝和伊红的罗氏染色法。罗氏染色法在血细胞染色技术中的应用和普及推动了血细胞形态学的前进步伐。1901年威廉姆·利什曼（William Leishman，英国人，于1900年于一个死于黑热病的印度兵士的脾髓涂抹标本上，发见杜氏利什曼病原体，发明了现在广泛应用的利什曼氏染色）、1902年Wrfeht和Giemsa分别根据罗氏染色剂用伊红和亚甲蓝混合而成的原理，在制备多色性亚甲蓝（主要指天青B）方面做了改进设计了3种不同特点的染色剂（利什曼染色剂、瑞氏染色剂、姬姆萨染色剂），使血细胞和疟原虫着色较好，操作简便。并成批生产出染色粉剂，从而建立了经典染色法，并一直使用至今。1941年Field（Field法原来是用于疟原虫染色的, 守屋(1947年)对此法做了改进, 可用于血液标本染色）提出了两色分染法，即在不用甲醇作为溶剂的前提下，先用一种染色液染色，后用另一种染色液染色。两色分染法的染色时间可缩短，且价格低廉，但手续繁杂，且需经常更换染色液。因此，国内外学者均着手研究促染技术。Mcdonald在染液中加入Na2HPO4 和KH2PO4以控制其pH值, 可缩短染色时间，亦可以通过加入表面活性剂促染。经典染色法和快速染色法用于临床以后, 由于每个实验工作者只习惯于本实验室的染色方法, 实验室之间用不同的染色方法进行会诊时, 常引起争论甚至作出不同的形态学诊断。为了克服不同种类染色的效果差异以及实验室间不同的染色标准, 1976年，ICSH成立了血和骨髓片染色和染色方法小组, 在罗氏染色的基础上确立了一套标准的血涂片染色方法。但由于推荐方法中的天青B提纯费用较高，因此标准染色法在国内推广缓慢。瑞氏染色对细胞质成分及中性颗粒着色好, 而对细胞核的染色不如姬姆萨染色, 采用瑞氏-姬姆萨复合染色液染色, 兼取两者之长,可使血细胞的胞质、颗粒及胞核等获得较为满意的染色效果。因此, 复合染色法引起了国内外实验室的高度重视。为了提高血片、骨髓片染色效果, 国内外仍不断对染色技术加以改进：有的在染色液快速溶解方面进行了改良；有的在分化剂使用方面进行了改良；有的在血膜外形成一层液态膜方面进行了改良；也有的在微波快速染色方面进行了改良。瑞氏-姬姆萨染色法60年的实践经验提示我们，作为经典染色技术，瑞-姬染色法通过进一步改进仍然是理想的染色法。May-Grunwald染色和May-Grunwald-Giemsa染色也可用于血和骨髓涂片染色，并能获得比较理想的染色效果。这些均是今后血细胞染色重要的染色技术。![]()
[1] 血涂片常规染色的历史变迁与发展前景
