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题目：
肝脏BMAL1和HIF1α调节时间依赖性的缺氧反应并防止类似肝肺综合症的发生
研究亮点
肝脏对缺氧的转录反应在很大程度上依赖于Bmal1或Hif1α。
缺乏肝脏Bmal1-Hif1α的小鼠在缺氧条件下表现出与昼夜节律相关的死亡率。
缺乏肝脏Bmal1-Hif1α的小鼠表现出类似肝肺综合症的特征。
缺乏肝脏Bmal1-Hif1α的小鼠肺部一氧化氮（NO）增加并导致血管扩张。
摘要
缺氧的转录反应受到时间的调控，但其分子基础和生理意义仍不清楚。我们在小鼠中研究了肝脏Bmal1和Hif1α在昼夜节律性缺氧反应中的作用。研究发现，肝脏对缺氧的主要转录反应依赖于Bmal1或Hif1α，二者通过共同和独特的作用来调控，并受到昼夜时间的影响。进一步的研究显示，缺氧诱导因子（HIF）1α的累积在缺氧状态下受到时间的调控，且依赖于Bmal1。令人意外的是，缺乏肝脏Bmal1和Hif1α的小鼠在缺氧暴露时表现出低氧血症，并且其死亡率在昼夜节律上有所不同。这些小鼠显示出轻度肝功能障碍，并伴有肺血管扩张，可能是由于细胞外信号调节激酶（ERK）激活、内皮型一氧化氮合酶和肺部一氧化氮的积累，这表明其具有肝肺综合症的表现。我们的研究表明，肝脏BMAL1和HIF1α是缺氧反应的关键时间依赖性调节因子，并且可为肝肺综合症的病理生理学提供分子层面的见解。引言
昼夜节律调控哺乳动物的多种生理和代谢过程，帮助其适应和同步每日的节律性环境变化。昼夜节律的分子机制依赖于转录-翻译的反馈回路，其中转录因子CLOCK和BMAL1（brain and muscle Arnt-like 1）作为正调控因子，而PERIODs和CRYPTOCHROMES作为抑制因子，辅助反馈回路则包括REV-ERBs（NR1D1/2）和与维甲酸相关的孤儿受体（RORs）。近年来，越来越多的证据支持昼夜节律和氧气信号之间的分子和功能性相互作用，尤其是BMAL1和HIF（缺氧诱导因子）。昼夜节律通过休息-活动和进食-禁食周期，主要调节氧气消耗和组织氧合的日常波动。同时，节律性氧水平作为时间信号，通过HIF1α依赖的方式同步生物钟。此外，缺氧的转录反应，尤其是分子钟的反应，具有组织特异性和昼夜依赖性。因此，像阻塞性睡眠呼吸暂停这样的缺氧会导致体内昼夜节律失调。在分子层面，BMAL1和HIF1α的相互作用最早被报道。最近的研究还表明，其他生物钟蛋白也能结合HIFs，并且主要在培养细胞中参与了对缺氧的响应。尽管关于昼夜节律与氧气信号之间相互作用的证据不断增多，但其中一些方面尚未被充分探讨，尤其是在体内的分子和生理学影响。为了回答这些问题，我们利用了肝脏特异性Bmal1和Hif1α的单敲除和双敲除小鼠，研究其对缺氧的昼夜依赖性反应。我们发现，在肝脏中，对缺氧的转录反应很大程度上依赖于Bmal1或Hif1α，通过共同和独特的昼夜依赖性作用。此外，Bmal1对缺氧条件下HIF1α的时间依赖性累积至关重要。令人意外的是，缺乏肝脏Bmal1-Hif1α的小鼠在缺氧时表现出昼夜依赖性的高死亡率，并且展现出提示肝肺综合症（HPS）的生理和分子表现。结果
BMAL1和HIF1α对钟基因和经典HIF1α靶基因的缺氧反应具有时间依赖性的调控作用
我们之前报道过，在肝脏中，多个昼夜节律基因和经典的HIF1α靶基因在缺氧时表现出昼夜依赖性的反应【图1A】。此处，我们研究了这些基因在体内对缺氧的转录反应是否由昼夜节律系统中的关键转录因子BMAL1或缺氧反应的主要调控因子HIF1α进行时间依赖性的调控。为此，我们使用了肝脏特异性Bmal1敲除小鼠（BLKO，AlbCre+ Bmal1fl/fl）和Hif1a敲除小鼠（HLKO，AlbCre+ Hif1afl/fl），并与AlbCRE对照小鼠进行了比较。小鼠暴露于常氧（21%氧气）或缺氧（6%氧气）环境中4小时，分别在主观光周期（昼夜节律时间[CT] 4–8）或主观暗周期（CT16–20）内进行实验【图1A】。通过qPCR分析对照小鼠中钟基因和经典HIF1α靶基因的表达【图1B–1D和图S1】，结果与我们之前的研究一致，显示某些基因在缺氧时表现出昼夜依赖性的反应。Per1和Cry2在CT4–8和CT16–20都对缺氧表现出类似的反应【图1B和图S1B】。然而，这种反应仅在CT16–20时依赖于Bmal1和Hif1α。经典的HIF1α靶基因，如Egln3、Glut1以及Pdk1，在CT16–20时也表现出类似的趋势，其对缺氧的反应在Bmal1和Hif1α缺失的情况下减弱【图1C和图S1C】。因此，Bmal1和Hif1α似乎在昼夜依赖性地调控这些基因对缺氧的反应。对于那些对缺氧具有昼夜依赖性反应的钟基因，如Dbp和Chrono，我们发现它们的基础表达水平和对缺氧的反应在BLKO小鼠的肝脏中都明显降低【图1B和图S1B】，这与BMAL1已知的调控这些基因表达的作用相符。最后，Clock和Cry1对缺氧的反应不依赖于Bmal1和Hif1α【图S1A和S1D】。正如预期的那样，在相应的肝脏特异性敲除小鼠中，Bmal1和Hif1α的表达明显降低【图1D和图S1E】。综合来看，这些结果揭示了Bmal1和Hif1α在缺氧转录反应中的复杂时间依赖性作用。HIF1α主要在主观暗周期控制钟基因和经典HIF1α靶基因的缺氧反应，而BMAL1则既参与基础表达的调控，也参与对缺氧的反应。![]()
图1. BMAL1和HIF1a对钟基因和经典HIF1a靶基因的缺氧反应进行时间依赖性调控
(A) 实验设计示意图。
(B–D) 对照小鼠（AlbCRE）、肝脏特异性Hif1a敲除小鼠（HLKO）和肝脏特异性Bmal1敲除小鼠（BLKO）分别暴露于4小时的常氧（21%氧气）或缺氧（6%氧气）环境中，时间为主观光周期（CT4–8）或主观暗周期（CT16–20）。实验结束后，小鼠被处死，收集肝脏，提取RNA，并通过qPCR分析(B) 钟基因、(C) HIF1a经典靶基因和(D) 对照基因的转录水平。
数据以均值 ± SEM表示，标准化至每个时间和每个基因的AlbCRE常氧条件；每个条件每种基因型n = 3。使用双因素方差分析（ANOVA）和Sidák多重比较事后检验；****p < 0.0001，***p < 0.001，**p < 0.01，*p < 0.05。图形说明由BioRender.com生成。
BMAL1和HIF1α时间依赖性地调控全局缺氧转录反应
在肝脏中，缺氧的整体转录反应具有昼夜依赖性。为了探究BMAL1和HIF1α在缺氧反应中的一般作用，我们进行了全基因组的转录组分析（RNA测序），分析了在CT4–8或CT16–20暴露于常氧或缺氧4小时后的AlbCRE对照、BLKO和HLKO小鼠的肝脏【图1A】。主成分分析（PCA）显示出缺氧和常氧条件之间的显著差异，并在不同基因型和昼夜时间之间存在较小的差异【图2A】。在常氧条件下，BLKO和HLKO小鼠的基因表达与对照小鼠相比存在差异。这些差异在CT4–8时比CT16–20更为显著【图S2A】，主要与脂质代谢相关【图S2B】。与对照小鼠类似，缺氧在BLKO和HLKO小鼠中引发了昼夜依赖性的基因表达变化【图S2C–S2E】。BLKO小鼠对缺氧的整体反应减少，在CT16–20时的反应较CT4–8更强烈【图S2C和S2D】，而HLKO小鼠则表现出相反的趋势，CT16–20时的反应较CT4–8更弱【图S2C和S2E】。这些结果提示了BMAL1和HIF1α在缺氧转录反应中的时间依赖性作用。为了进一步研究基因型和昼夜时间对缺氧转录反应的依赖性，我们根据缺氧基因的表达谱进行了聚类分析【图2B】。我们确定了以下几组基因：（1）敲除小鼠对缺氧的反应与对照相似的基因；（2）对照小鼠对缺氧有反应，但在BLKO或HLKO中失去反应的基因；（3）在BLKO或HLKO中获得对缺氧反应的基因【图2B】。进一步的分析表明，无论是在CT4–8还是CT16–20，大部分的缺氧转录反应依赖于Bmal1或Hif1α【图2C和图2D】。总体来说，BMAL1和HIF1α在缺氧全局转录反应中起到了关键作用，二者在调控缺氧反应中有着共同和独特的时间依赖性作用。BMAL1在主观光周期中起主导作用，而HIF1α在主观暗周期中更为重要。![]()
图2. BMAL1和HIF1a以昼夜依赖的方式调控对缺氧的整体转录反应
(A) 在CT4–8或CT16–20时，分别在常氧（21%氧气）或缺氧（6%氧气）条件下，不同小鼠基因型（AlbCRE、HLKO和BLKO）的PCA图，每种基因型每个条件n = 3只小鼠。
(B) 热图表示在缺氧条件下基因表达显著变化的小鼠基因型，按其表达模式聚类（配对分析，调整后的p < 0.05且|log fold change| > 1），具体基因列表见【数据S2A】，聚类基因见【数据S2B】。
(C 和 D) 饼图表示在AlbCRE小鼠中对缺氧有反应的基因，并在HLKO、BLKO或两者中失去其缺氧反应的基因，分别称为依赖Bmal1、Hif1a或同时依赖Bmal1和Hif1a的基因，(C) 为CT4–8，(D) 为CT16–20（基因列表见【数据S2C】）。
(E–G) 通过EnrichR对基因进行富集分析（通路列表见【数据S2D和S2E】），其中(E) 为同时依赖Bmal1和Hif1a的基因，(F) 为仅依赖Hif1a的基因，(G) 为仅依赖Bmal1的基因，不论昼夜时间。
肝脏HIF1α在缺氧条件下的积累具有时间和Bmal1依赖性
BMAL1和HIF1α都是含有基本螺旋-环-螺旋（bHLH）和Per-Arnt-Sim（bHLH-PAS）结构域的转录因子。BMAL1和HIF1α之前被报道有物理相互作用，最近研究表明，BMAL1在细胞培养中支持肌管在缺氧条件下的HIF1α积累。基于我们发现的在小鼠肝脏中，缺氧的转录反应在很大程度上依赖于Bmal1和Hif1α的昼夜依赖性特征，我们进一步探讨了在缺氧反应中它们的蛋白水平。我们首先检测了对照小鼠在CT4–8或CT16–20暴露于4小时缺氧条件下，肝脏中BMAL1和HIF1α的核积累情况。HIF1α的积累呈昼夜依赖性，在CT16–20时的积累水平高于CT4–8【图3A】。由于缺氧时Hif1α的转录水平在CT16–20相比CT4–8仅有轻微差异【图S1E】，因此这种现象可能是通过转录后机制介导的。在两个时间点，BMAL1的核蛋白水平在缺氧时都发生了变化，尤其是高磷酸化形式的BMAL1积累【图3A】。
为了阐明BMAL1和HIF1α在缺氧条件下的潜在相互依赖性，我们利用了遗传小鼠模型，研究了HIF1α积累对Bmal1的依赖性以及BMAL1高磷酸化对Hif1a的依赖性。为此，我们检测了对照、HLKO和BLKO小鼠在CT4–8或CT16–20暴露于缺氧条件下的核蛋白提取物。在Bmal1缺失的情况下，HIF1α的积累无论在何时均被消除【图3B和3C】。由于BLKO小鼠中Hif1α的转录水平未受影响【图1D】，可以推测BMAL1支持了HIF1α的稳定性。值得注意的是，我们不能排除在Bmal1缺失的情况下，仍存在一定程度的HIF1α积累，只是由于抗体检测能力较低而未能检测到，这可能解释了部分由HIF1α单独介导的缺氧转录反应。下来我们测试了Hif1a是否在缺氧条件下参与了BMAL1的磷酸化。与HIF1α不同，HLKO小鼠中的BMAL1表现模式相似，且其高磷酸化形式在缺氧时无论何时都积累在总肝脏和核提取物中【图3B、3C和图S3A】。正如预期的那样，在BLKO小鼠中未检测到BMAL1，而HIF1α在总肝脏提取物中也未被发现，可能是由于其丰度较低【图3B、3C和图S3B】。我们得出结论，HIF1α在小鼠肝脏中对缺氧的积累是时间依赖性和Bmal1依赖性的，而BMAL1在缺氧条件下的磷酸化不依赖于Hif1a。由于高达50%的缺氧转录反应依赖于Bmal1和Hif1a，因此它们的功能性相互作用可能源于HIF1α在缺氧条件下对Bmal1的依赖性积累。![]()
图3. HIF1α在缺氧条件下的积累依赖于时间和Bmal1
(A) 对暴露于常氧（21%氧气）或缺氧（6%氧气）4小时的对照小鼠（AlbCRE）肝脏核提取物中的BMAL1和HIF1α进行免疫印迹分析，分别在CT4–8或CT16–20进行实验。(B 和 C) 对暴露于常氧（21%氧气）或缺氧（6%氧气）4小时的对照小鼠（AlbCRE）、肝脏特异性Hif1a敲除小鼠（HLKO）和肝脏特异性Bmal1敲除小鼠（BLKO）肝脏核提取物中的BMAL1和HIF1α进行免疫印迹分析，分别在(B) CT4–8和(C) CT16–20进行实验。每种基因型每个条件使用了n = 3只动物的混合样品。(B) 和(C)中的AlbCRE样本与(A)中的相同。
缺乏肝脏Bmal1和Hif1α的小鼠在缺氧反应中表现出昼夜依赖性的死亡率
我们的研究发现，Bmal1和Hif1α在肝脏中控制了大部分对缺氧的转录反应，因此我们进一步研究了它们对缺氧反应的共同影响。为此，我们建立了肝脏特异性Bmal1和Hif1α双敲除小鼠模型（BHLKO; AlbCre+ Bmal1fl/fl Hif1afl/fl）【图S4A】。BHLKO和HLKO小鼠的体重较年龄匹配的AlbCRE和BLKO小鼠更高【图S4B】。身体成分分析未发现它们的相对脂肪质量、瘦体质量或游离液体有显著变化【图S4B】。如上所述，动物分别在CT4–8或CT16–20暴露于缺氧环境中【图1A】。令人意外的是，在CT16时，所有BHLKO小鼠都未能存活4小时的缺氧环境【图4A】。在缺氧暴露的前30分钟内，BHLKO小鼠在CT16时的死亡率达到50%，而在CT4时未观察到死亡【图4B】。HLKO小鼠也出现了一定的死亡率，但程度较轻，而对照组或BLKO小鼠未见死亡。因此，我们得出结论，缺乏肝脏Bmal1和Hif1α的小鼠在昼夜依赖性上对缺氧暴露的应对能力降低。为了确定BHLKO小鼠在缺氧条件下死亡率增加的潜在原因，我们首先关注了Bmal1和Hif1α被敲除的肝脏【图S4A】。由于在CT16时，缺氧暴露的前30分钟内观察到了死亡，我们推测这些小鼠可能在CT16时表现出一种病理倾向，甚至在常氧条件下也可以检测到。然而，我们没有检测到敲除小鼠与对照小鼠在肝脏组织学上的明显差异【图S4C】。接下来，我们在CT4和CT16下进行了一系列测试，以评估常氧条件下肝功能【图4C、4D、S4D和S4E】。SGOT、SGPT、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶和肝脏甘油三酯水平在任何敲除小鼠中均未受到影响【图S4D和S4E】。我们确实发现BHLKO小鼠的总胆红素、总蛋白、白蛋白和球蛋白水平发生了一些显著变化，尤其是在CT16时的白蛋白水平超出正常生理范围【图4C和4D】。此外，BHLKO小鼠在钾、氯和磷等关键血液电解质上与对照小鼠相比也表现出一些轻微的差异，主要在CT16时观察到【图4E和4F】。这些变化不太可能由于肾功能不全引起，因为尿素和肌酐水平是正常的【图S4F和S4G】。血液中的胆固醇和甘油三酯水平没有显著变化【图S4H和S4I】，而血糖水平在BHLKO小鼠中仅在CT16时升高【图S4J和S4K】。总体来说，我们发现缺乏肝脏Bmal1和Hif1α的小鼠在CT16时暴露于缺氧环境下的死亡率明显高于CT4。然而，这些小鼠仅表现出非常轻微的肝功能障碍，包括低白蛋白血症和CT16时的少量电解质失衡。![]()
图4. 肝脏特异性Bmal1和Hif1a敲除小鼠在缺氧反应中表现出昼夜依赖性死亡率
(A 和 B) 条形图显示对照小鼠（AlbCRE）、肝脏特异性Hif1a敲除小鼠（HLKO）、肝脏特异性Bmal1敲除小鼠（BLKO）和肝脏特异性Bmal1和Hif1a双敲除小鼠（BHLKO）在(A) 4小时（p < 0.001）和(B) 30分钟（p < 0.001）缺氧（6%氧气）条件下，CT4或CT16时的生存率（每种基因型每个CT组n = 10–15只小鼠）；卡方检验。
(C 和 D) 在常氧条件下，(C) CT4和(D) CT16时AlbCRE、HLKO、BLKO和BHLKO小鼠的血清肝功能检测结果。
(E 和 F) 在常氧条件下，(E) CT4和(F) CT16时AlbCRE、HLKO、BLKO和BHLKO小鼠的血清电解质测量结果。
在(C)–(F)中，数据以均值 ± SEM表示，每种基因型n = 5–6只小鼠；单因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验，****p < 0.0001，***p < 0.001，**p < 0.01，*p < 0.05。
缺乏肝脏Bmal1和Hif1α的小鼠表现出肝肺综合征的特征
缺乏肝脏Bmal1和Hif1α的小鼠在缺氧暴露下的死亡率增加，提示其氧代谢受损。由于肺在通过呼吸吸收氧气方面起到了至关重要的作用，我们推测BHLKO小鼠可能患有肝肺综合征（HPS）。HPS的特征是肝功能障碍、动脉低氧血症和肺内血管扩张，这在不同程度的肝病患者中较为普遍。首先，我们通过组织学检查了肺部，未发现BHLKO或单基因敲除模型中的明显差异【图S5A】。混合血气分析显示，BHLKO小鼠的血氧饱和度严重下降【图5A】。BHLKO小鼠的部分二氧化碳压力相比对照组和单敲小鼠有所升高，但仍在正常生理范围内【图5A】。碳酸氢盐水平略有升高，可能是作为一种代偿机制来维持正常的pH值【图5A】。血红蛋白浓度或红细胞压积没有显著差异【图S5B】。我们得出结论，缺乏肝脏Bmal1和Hif1α的小鼠即使在常氧条件下也表现出严重的低氧血症。接下来，我们检测了这些小鼠是否表现出肺内血管扩张。检测人类肺内血管扩张的金标准方法是超声心动图结合外周静脉微气泡注射。通常，微气泡会被肺循环捕获并被肺泡吸收。然而，在肺内血管扩张的情况下，微气泡会逃避肺捕获并更快地到达心脏，这可以通过超声心动图检测到【图5B】。我们建立了类似的小鼠实验，并通过超声心动图监测注射的微气泡到达左心室的时间。我们发现，BHLKO小鼠的微气泡到达心脏的速度比对照小鼠更快【图5C; 视频S1】，支持了这些小鼠存在肺内血管扩张的假设。尽管我们的超声心动图显示BHLKO小鼠的左心室容量增加，但我们未检测到明显的功能性后果，因其收缩和舒张功能相似【图S5C; 表S1】。值得注意的是，BHLKO和AlbCRE对照小鼠之间的肺血流量（Qp）与体循环血流量（Qs）比值无显著差异，排除了心内分流，支持了肺内血管扩张的存在。我们得出结论，缺乏肝脏Bmal1和Hif1α的小鼠表现出与HPS一致的特征，包括轻微的肝功能障碍、低氧血症和肺内血管扩张。![]()
图5. 肝脏特异性Bmal1和Hif1a敲除小鼠表现出肝肺综合征的特征
(A) 在对照小鼠（AlbCRE）、肝脏特异性Hif1a敲除小鼠（HLKO）、肝脏特异性Bmal1敲除小鼠（BLKO）和肝脏特异性Bmal1和Hif1a双敲除小鼠（BHLKO）中测量的混合血氧饱和度、二氧化碳分压、pH值和碳酸氢盐（HCO3）水平。血液测量在常氧CT16条件下进行（均值 ± SEM，n = 5–7只小鼠）；单因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验，***p < 0.001，**p < 0.01，*p < 0.05。(B) 正常与血管扩张的肺血管中造影剂流动的图示表示，以及造影剂（微气泡）到达心脏左心室所需时间的表示。(C) AlbCRE与BHLKO小鼠在CT16左右注射后，微气泡到达心脏左心室所需时间的超声心动图测量，结果根据心率进行标准化（均值 ± SEM，n = 6–8只小鼠）；学生t检验，****p < 0.0001。图形说明由BioRender.com生成。肝脏缺乏Bmal1和Hif1α的小鼠肺部的ERK激活、eNOS和NO积累
我们的研究发现，缺乏肝脏Bmal1和Hif1α的小鼠表现出肝肺综合征（HPS）的标志，这促使我们进一步研究这些小鼠肺部的分子变化。我们首先检测了BHLKO小鼠肺部Bmal1和Hif1α的表达，未发现显著差异【图S6A】。HPS与内皮型一氧化氮合酶（eNOS）积累有关，eNOS是产生一氧化氮（NO）的关键酶，能够引发肺内血管扩张。我们检测了在常氧条件下BHLKO小鼠的eNOS蛋白水平，发现其在CT16时升高，CT4时也有所升高，但程度较小【图6A和图S6B】。重要的是，NO水平与eNOS水平一致，在CT16时BHLKO小鼠中明显升高，而在CT4时没有显著变化【图6B和图S6C】。值得注意的是，诱导型NOS（iNOS）在我们的小鼠模型中未受影响【图6C】。在通过胆总管结扎（CBDL）诱导HPS的大鼠模型中，血清内皮素-1（ET1）水平升高被认为会刺激eNOS的活性。我们在不同的小鼠模型中分析了常氧CT16时的ET1血清水平，发现HLKO和BHLKO小鼠的ET1水平升高【图6D】。细胞外信号调节激酶（ERK）和蛋白激酶B（AKT）通路被认为在CBDL诱导的HPS大鼠模型中参与了肺血管扩张的过程。我们发现，在肝敲除小鼠模型的肺部，ERK在氨基酸位点Thr202/Tyr204的磷酸化水平升高，尤其是在BHLKO小鼠中【图6A】。AKT在氨基酸位点Ser473的基础磷酸化水平在HLKO和BHLKO小鼠中轻微升高，但在BLKO小鼠中没有变化【图6A】。值得注意的是，在相同的小鼠中，我们在肝脏或肾脏样本中未检测到ERK和AKT基础磷酸化水平的变化【图6E和6F】，这表明这些效应是肺部特异性的，而不是由于广泛的全身性效应。与CBDL诱导的HPS类似，我们在BHLKO小鼠的肺部观察到增殖细胞核抗原（PCNA）水平轻微升高【图S6D】。此外，血清中的循环细胞因子/趋化因子分析显示BHLKO小鼠的多种趋化因子水平升高，特别是CCL2、CCL5和CXCL1【图S6E】，支持了炎症反应的调节，这与之前关于HPS的研究一致。为了更深入地了解BHLKO小鼠肺部发生的分子变化，我们进行了全基因组转录组分析。在常氧CT16时，AlbCRE和BHLKO小鼠肺部的基因表达分析【图6G】显示，BHLKO小鼠中有204个基因差异表达，其中72个基因上调，132个基因下调【图6H; 数据S4A】。对BHLKO小鼠肺部差异调控基因的富集分析显示，许多免疫相关的通路受到了调控【图6I; 数据S4B】。BHLKO小鼠在常氧下表现出低氧血症【图5A】。将BHLKO小鼠肺部差异表达基因（DEGs）与野生型小鼠肺部在缺氧暴露4小时后的基因变化进行比较，发现这两组数据集之间的重叠很小（204个基因中有31个重叠）【图S6F; 数据S5】。这提示我们观察到的肺部变化并非仅仅是这些小鼠低氧血症的结果。同样，AlbCRE对照小鼠在CT16时暴露于缺氧条件下时，肺部eNOS和pERK水平略有升高，但这些效应相比BHLKO小鼠在常氧条件下观察到的变化要轻微得多【图S6G】。综上所述，我们的研究表明，缺乏肝脏Bmal1和Hif1α的小鼠在肺部表现出显著的分子变化，包括ERK激活、eNOS和NO积累，以及多种免疫相关通路的调节，这些可能在HPS的病理生理学中发挥作用。![]()
图6. 肝脏特异性Bmal1和Hif1a敲除小鼠肺部的分子特征分析
(A) 对照小鼠（AlbCRE）、肝脏特异性Hif1a敲除小鼠（HLKO）、肝脏特异性Bmal1敲除小鼠（BLKO）和肝脏特异性Bmal1和Hif1a双敲除小鼠（BHLKO）在常氧CT16条件下的肺部蛋白提取物的免疫印迹分析（每种基因型n = 5只小鼠）。
(B) AlbCRE、HLKO、BLKO和BHLKO小鼠肺组织中在常氧CT16条件下的一氧化氮（NO）测量（均值 ± SEM，n = 5只小鼠）；单因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验，****p < 0.0001。
(C) AlbCRE、HLKO、BLKO和BHLKO小鼠肺组织中在常氧CT16条件下的诱导型一氧化氮合酶（iNOS）免疫印迹分析（每种基因型n = 5只小鼠）。
(D–F) (D) AlbCRE、HLKO、BLKO和BHLKO小鼠血清中内皮素-1（ET-1）在常氧CT16条件下的免疫印迹分析（每种基因型n = 5只小鼠）。(E) AlbCRE、HLKO、BLKO和BHLKO小鼠肝脏总蛋白提取物在常氧CT16条件下的免疫印迹分析（每种基因型n = 5只小鼠）。(F) AlbCRE、HLKO、BLKO和BHLKO小鼠肾脏总蛋白提取物在常氧CT16条件下的免疫印迹分析（每种基因型n = 5只小鼠）。
(G) 实验设计示意图，小鼠在常氧CT16条件下被处死，收集肺部并提取RNA进行测序。
(H) BHLKO小鼠与AlbCRE小鼠相比的差异表达基因的热图表示；阈值为调整后的p < 0.05和|log2foldchange| > 1（参见Data S4A中的基因列表）。
(I) 通过EnrichR对BHLKO小鼠的差异表达基因进行的富集分析（参见Data S4B中的通路列表）。图形说明由BioRender.com生成。
肝脏缺乏Bmal1和Hif1α的小鼠肺部单细胞RNA分析揭示了肺细胞组成和基因表达的变化
正如上文所述，我们对缺乏肝脏Bmal1和Hif1α的小鼠进行了全肺分析，发现了多种信号通路及免疫相关基因表达的变化。肺部由多种细胞类型组成，如上皮细胞、间充质细胞以及多种免疫细胞，这促使我们对BHLKO小鼠和AlbCRE对照小鼠的肺部进行单细胞RNA测序分析。每种基因型使用了三个生物学重复（共6个肺部）；经过过滤后，共22,741个细胞被整合并分析（质量控制步骤详见STAR方法，并显示在【图S7A–S7C】；【数据S6】）。我们在AlbCRE和BHLKO小鼠的肺部中共识别出30个不同的细胞簇，这些细胞簇被分为12种主要细胞类型，基于代表性标记基因进行了分类【图7A和图S7D；表S2；数据S6】。这些细胞簇的身份与之前报道的单细胞肺部数据集大致一致，并且在不同基因型和生物学重复之间保留了细胞异质性【图S7B和S7C】。最大的三个细胞群体，即内皮细胞、间质细胞和上皮细胞，在BHLKO和AlbCRE对照小鼠的肺部中其相对丰度没有明显差异【图S7C】。然而，BHLKO小鼠的肺部中单核细胞和红细胞前体细胞的丰度相较于AlbCRE对照小鼠减少【图7B】。此外，我们注意到BHLKO小鼠肺部中T细胞群体的相对丰度较对照小鼠更高，而B细胞群体则表现出相反的趋势【图7B】。因此，在BHLKO小鼠肺部中，T细胞与B细胞的比例几乎是对照小鼠的两倍。这表明，尽管肺部的内皮和间质细胞的丰度在两种基因型之间相对相似，但某些特定免疫细胞类型的丰度变化，加上观察到的血清中循环细胞因子/趋化因子的变化【图S6E】，支持免疫系统可能参与了观察到的表型。肺部单细胞RNA测序分析不仅使我们能够解析细胞丰度的变化，还能分析其相关的基因表达变化。为此，我们对主要细胞簇进行了DESeq分析。尽管内皮细胞、间质细胞和肺泡巨噬细胞在BHLKO和AlbCRE对照小鼠肺部中的丰度没有差异，但这些细胞类型表现出最多的差异表达基因（DEGs）【图7C】。这表明，肝脏中缺失Bmal1和Hif1α在某些肺细胞群体中引发了基因表达的变化【数据S7和S8】。在内皮细胞和肺泡巨噬细胞中，上调和下调的DEGs数量几乎相等，而在间质细胞中，下调的DEGs几乎是上调基因的两倍【图7D–7F】。内皮细胞的差异表达基因的功能富集分析识别了血小板活化等基因功能通路，已知这些通路可以调节免疫反应【图7G】。另一个识别的通路是病毒进入的调控，主要由Trim基因组成，这些基因与先天免疫相关【图7D和7G】。这两个通路主要由在BHLKO肺部中下调的DEGs组成【图S7F】，支持了这些细胞中免疫相关通路的抑制。在间质细胞中，基因表达变化与白细胞迁移相关【图7H和图S7G】。我们还发现了与丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联反应相关的基因表达变化，这可能与在BHLKO小鼠肺部观察到的ERK激活有关【图6A】。在间质细胞和肺泡巨噬细胞中，诸如Cxcl10、Cxcl14和Cxcl1等趋化因子也是差异表达基因中的一部分，进一步支持了免疫相关的变化【图7E、7F和图S7G；数据S8】。有趣的是，肺泡巨噬细胞中的差异表达基因如Gucy1a2、Gucy1b1和Gucy1a1与cGMP和NO信号通路相关【图7I和图S7H】，这与我们发现的BHLKO小鼠肺部eNOS和NO水平升高相吻合。综上所述，这些发现表明，Bmal1和Hif1α的缺失导致肺部细胞群体和细胞类型特异性基因表达的变化，这些变化可能在HPS的病理生理过程中发挥作用。肝脏Bmal1和Hif1α缺失小鼠肝脏中Serpina基因的表达发生变化
之前的研究提出，肝脏与肺部的通信变化可能通过分泌因子（如内皮素-1【图6D】）的改变参与了肝肺综合征（HPS）的病理生理过程。由于BHLKO小鼠表现出HPS的特征，并且缺失了两个关键的肝脏转录因子，即HIF1α和BMAL1，我们假设对其肝脏基因表达进行分析，尤其是分泌因子的变化，可能有助于揭示肝脏如何与肺部通信并调节其功能的潜在机制。为此，我们对BHLKO小鼠在常氧CT20下的肝脏进行了全基因组转录组分析（RNA测序），并将其与AlbCRE、BLKO和HLKO肝脏转录组进行了比较【图2和图S2】。主成分分析（PCA）显示基因型之间有明显的分离【图S8A】。BHLKO小鼠表现出最多的差异表达基因（DEGs），其次是BLKO和HLKO小鼠【图S8B】，不同基因型之间存在一定的重叠【图S8C】。肝脏可能通过分泌蛋白与肺部通信，因此我们将分析范围缩小至基于GO数据库编码分泌蛋白的基因表达变化。在此类别中，BHLKO小鼠的差异表达基因数量最多，其次是BLKO和HLKO小鼠【图S8D】。我们进一步聚焦于HLKO和BHLKO小鼠中共同的这些基因，因为我们只在这两种基因型中观察到了缺氧引起的死亡率【图5A和5B】。结果显示共有8个基因【图S8E】，其中5个属于SERPIN（丝氨酸蛋白酶抑制剂）家族（Serpina3c、Serpina3m、Serpina11、Serpina1d和Serpina1e）【图S8F】。值得注意的是，人类SERPINA1基因编码α1-抗胰蛋白酶，主要在肝脏中产生，其缺乏会导致人类遗传性疾病，进而引发肺部疾病。通过定量PCR对这5个Serpins的表达分析证实，Serpina3c和Serpina11在HLKO和BHLKO小鼠中上调，而Serpina3m和Serpina1e下调【图S8G】。因此，这些结果提示Serpina家族基因可能在肝肺通信中发挥作用，且其在肝脏中的表达变化可能影响肺部，并在HPS的病理生理过程中发挥作用。
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图7. 肝脏特异性Bmal1和Hif1a敲除小鼠的肺部表现出细胞特异性的丰度变化和通路富集
(A) 来自AlbCRE和BHLKO小鼠肺部在CT16时收集的22,741个细胞的UMAP图。簇按细胞类型和编号以颜色标注。内皮细胞（ECs）；间质细胞（SCs）；上皮细胞（ETs）。
(B) 每种细胞群体相对于样本中总细胞的比例，按基因型平均每个样本的三个重复。框显示了组成AlbCRE（灰色）与BHLKO（橙色）肺部的细胞平均比例。每个框中的线表示均值。多重独立t检验（*p < 0.05）。
(C–I) (C) 12种主要细胞类型中差异表达基因（DEGs）的数量（FDR < 0.05）。火山图显示了假体细胞中上调（红色）和下调（蓝色）的DEGs，包括(D) 内皮细胞、(E) 间质细胞和(F) 肺泡巨噬细胞。蓝色和红色分别表示下调和上调基因的数量。功能富集分析显示了与(G) 内皮细胞、(H) 间质细胞和(I) 肺泡巨噬细胞的DEGs对应的前10个基因本体（GO）通路（2–1,000个基因）（p < 0.05）。
讨论
近年来，氧气生物学与昼夜节律逐渐联系在一起，HIF1α和BMAL1分别作为其中的关键角色。然而，它们在体内相互作用的分子和生理意义仍然知之甚少。在本研究中，我们展示了BMAL1和HIF1α在小鼠的缺氧反应中发挥了重要作用，肝脏中对缺氧的转录反应有高达84%依赖于BMAL1或HIF1α。HIF1α和BMAL1在缺氧转录反应中的共同作用（约50%）与之前报道的这两种含bHLH-PAS结构域的蛋白质在体外存在物理相互作用一致。我们还发现这两个转录因子在昼夜依赖性地调控缺氧反应时具有独立作用，这提示HIF1α和BMAL1可能在不同的时间点参与不同的转录因子复合物。此外，研究显示HIF1α与其他钟蛋白（如PER1、PER2、CRY1和CRY2）在培养细胞中有相互作用。因此，BMAL1或HIF1α的相互作用伙伴可能会随着时间的不同而变化，进而激活不同的转录程序以应对缺氧。因此，研究这些不同的复合物在体内全天的动态变化将是一个有趣的课题。我们还发现，肝脏中HIF1α在缺氧时的积累受到时间的调控，且依赖于Bmal1，而BMAL1对缺氧的反应则可能通过其磷酸化变化独立于HIF1α。关于这些变化是否源于细胞自主性低氧反应，或由于系统性效应，仍然不清楚。细胞培养实验有望为这些开放性问题提供一些线索。
我们的实验清楚表明，BLKO小鼠在缺氧时肝脏中HIF1α的积累依赖于Bmal1。这与之前在培养的肌管细胞中发现的Bmal1缺失会削弱HIF1α在缺氧时的积累的研究一致。Bmal1调控HIF1α积累的分子机制可能发生在多个水平，仍有待进一步研究。由于我们没有观察到Bmal1对Hif1α转录水平的显著影响，因此推测Bmal1对HIF1α积累的作用是转录后调控的。缺氧条件下HIF1α的积累主要通过减少其蛋白酶体降解来实现，这提示BMAL1-HIF1α的相互作用可能稳定HIF1α，正如之前报道的HIF1β在HIF1α稳定化中的关键作用一样。令人意外的是，我们发现BHLKO小鼠在昼夜依赖性地暴露于缺氧时生存率降低。这些小鼠在主观暗周期暴露于缺氧时迅速死亡，而在主观光周期则表现出较高的生存率。一个可能的解释是，当氧气消耗相对较高时，如在主观暗周期小鼠活跃和进食时，这些小鼠无法补偿缺氧。BHLKO小鼠表现出HPS的特征，包括轻微的肝病、低氧血症和肺血管扩张。这些特征表明BMAL1和HIF1α能够保护小鼠免受HPS的影响，但其分子机制仍不清楚。需要指出的是，与CBDL诱导的HPS和人类HPS不同，BHLKO小鼠的肝功能变化非常轻微。然而，这些小鼠依然遭受低氧血症和肺血管扩张。这提示我们在肝脏中对Bmal1和Hif1α的基因操纵足以影响肺功能，而无需引发明显的肝病。肝病已被证明可以加剧HPS中的肺部病理，而在人类肝移植后这些病理可以得到缓解。这表明肝肺通信在HPS的发展和严重性中至关重要。我们的BHLKO小鼠为发现与肝肺通信相关的分子提供了令人兴奋的新途径，特别是在HPS的背景下。与之前使用CBDL诱导HPS的研究一致，我们在BHLKO小鼠的血清中检测到了ET1水平的升高。此外，我们的BHLKO肝脏转录组分析发现Serpina（分泌型丝氨酸蛋白酶抑制剂）家族基因发生了显著变化，之前已有研究表明这些基因与肺功能的调节有关。因此，这些蛋白可能通过依赖于HIF1α和BMAL1的机制参与了肝肺通信，调节肺功能。需要指出的是，肝肺之间的器官通信可能通过多种信号分子介导，包括小分子（如代谢物）或长链非编码RNA，并可能通过第三方（如肝-肠-肺轴）进行，增加了其复杂性。至今，在啮齿动物中还没有针对HPS的遗传模型，未来使用BHLKO小鼠研究HPS的病理生理学预计将提供宝贵的新信息。当前用于研究HPS的啮齿动物模型是通过手术干预，即CBDL。尽管该模型提供了有用的信息，但其高死亡率使研究这些患病啮齿动物变得困难。另一个主要缺点是CBDL模型系统会导致严重的肝病，最终导致肺血管扩张。然而，在人类研究中，HPS已被明确发生在肝病补偿良好和失代偿的情况下，以及在没有肝硬化的门静脉高压患者中。因此，我们的BHLKO小鼠作为HPS研究的一个有吸引力的模型，因为这些小鼠在仅表现出轻微肝功能障碍的情况下也表现出HPS的特征。总而言之，我们的研究表明，肝脏BMAL1和HIF1α在缺氧的转录反应中起着关键作用，它们的缺失可能通过激活eNOS、NO的积累（导致肺血管扩张）以及调节免疫反应，导致HPS的发生。我们提出，缺乏肝脏Bmal1和Hif1α的小鼠是研究HPS的一个有吸引力的遗传小鼠模型，并提供了一个很好的机会来阐明HPS及其相关的肝肺通信未被发现的方面。研究的局限性
在本研究中，我们展示了BMAL1和HIF1α在时间依赖性地介导缺氧转录反应中的重要作用。我们还表明BMAL1在缺氧时对HIF1α的积累是必需的。然而，在分子层面上，BMAL1如何支持HIF1α积累的机制仍不清楚，以及在小鼠暴露于缺氧时观察到的BMAL1磷酸化变化是否是细胞自主性反应，尚待进一步研究。此外，我们提供了证据表明缺乏肝脏Bmal1和Hif1α会导致小鼠出现类似肝肺综合征的症状；然而，肝脏如何通过BMAL1和HIF1α依赖的机制与肺部通信以调节肺功能的分子机制尚不明确。我们确实发现，在这些肝脏特异性敲除小鼠中，若干Serpin基因的表达水平发生了变化，这提示它们可能参与了这一过程；然而，它们的功能相关性仍需要进一步验证。原文网址：https://www.cell.com/cell-metabolism/abstract/S1550-4131(24)00274-2
