【文献解读】抑制PNCK会加剧肿瘤微环境炎症，并增强头颈部鳞状细胞癌对免疫检查点抑制剂的敏感性
文摘
科学
2024-10-16 17:00
江苏
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文献：Ding Q, Weng Y, Li Y, Lin W, Lin X, Lin T, Yang H, Xu W, Wang J, Ying H, Qiu S. Inhibition of PNCK inflames tumor microenvironment and sensitizes head and neck squamous cell carcinoma to immune checkpoint inhibitors. J Immunother Cancer. 2024 Oct 12;12(10):e009893. doi: 10.1136/jitc-2024-009893. PMID: 39395840.杂志：Journal for ImmunoTherapy of Cancer影响因子：10.3
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背景：肿瘤微环境（TME）与头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的发展密切相关，并显著影响免疫治疗的效果。近期研究强调了PNCK在癌症进展中的关键作用，但其与免疫治疗的关系仍不清楚。方法：我们利用来自我们队列和公共数据库的测序数据评估PNCK的表达、预后意义及免疫效能预测。通过体外和体内实验探讨PNCK在HNSCC进展中的作用。动物模型评估PNCK敲低结合免疫检查点抑制剂（ICIs）的治疗效果和生存益处。单细胞转录组分析PNCK对TME的影响，蛋白组学研究则阐明其机制。结果：PNCK在HNSCC的进展中发挥多方面的重要作用。低PNCK表达与改善预后、增强免疫细胞浸润及提高对ICIs的反应性相关。相反，PNCK促进HNSCC细胞的迁移、侵袭、增殖、集落形成、斑马鱼血管生成和小鼠肿瘤生长。此外，靶向PNCK可以提高对ICIs的敏感性，并显著改变TME中T细胞和B细胞的比例。这些变化归因于PNCK磷酸化ZEB1的核转录抑制，限制细胞因子释放，导致免疫微环境炎症，从而调节TME。结论：抑制PNCK可能是一种潜在的HNSCC治疗策略，因为它能够激活免疫反应，改善TME，从而增强HNSCC患者免疫治疗的效果。头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是一个重要的全球健康问题，全球发病率排名第六。近期临床证据强调了免疫治疗，特别是免疫检查点抑制剂（ICIs）在HNSCC进展管理中的有效性。然而，患者对ICIs的耐药现象普遍存在，这与肿瘤内在信号通路的遗传改变等多种因素有关。肿瘤细胞通过内部调节因子建立抑制性的肿瘤微环境（TME），以逃避免疫监视。这些发现促使研究人员加大力度，阐明临床对ICIs耐药的分子和细胞机制。恶性细胞逃避ICIs对肿瘤靶向免疫的恢复效应的一个常见机制是建立“免疫荒漠”TME。因此，研究者们致力于开发“点燃”TME的策略，以促进免疫效应细胞的浸润，提高对ICIs的临床敏感性。PNCK是钙调蛋白激酶家族的一员，由于其对细胞内钙水平的调节及对下游信号通路的影响，受到关注。尽管PNCK与乳腺癌和肾癌相关，表明其作为癌基因的潜力，但其在HNSCC发展中的角色及其与TME的相互作用尚未得到全面研究。本研究旨在填补这一空白，探讨PNCK在HNSCC中的多重作用。具体而言，我们的目标是阐明（1）PNCK如何通过体外和体内相结合的方式促进HNSCC的恶性进展；（2）PNCK与TME之间的复杂关系及其对肿瘤免疫治疗的影响；（3）PNCK影响HNSCC免疫治疗反应的主要调节机制。通过采用全面的实验框架，本研究旨在揭示PNCK在HNSCC中的功能重要性及其作为治疗靶点的潜力。这些发现可能有助于为HNSCC患者开发更有效的治疗策略，从而改善他们的临床结果。结果
PNCK 与不良预后相关，并促进“免疫荒漠”型头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的发展为了探究PNCK在癌症中的作用及其在恶性肿瘤中的改变，我们首先进行了探索性分析，使用我院样本（n=193）以及公共数据库（TCGA-HNSC，n=503）的测序数据，研究PNCK表达模式与患者预后的关系。结果发现，PNCK在恶性HNSCC细胞中高度表达。对TCGA-HNSC转录组和蛋白质数据的分析显示，肿瘤组织中PNCK水平显著高于正常组织（图1a，在线补充图S2a,b）。在单细胞水平上，恶性细胞中的PNCK表达上调（在线补充图S2c）。高PNCK表达与较高的临床及病理T分期（在线补充图S2d）、较高的N分期、淋巴血管浸润（在线补充图S2e）以及晚期临床和组织学分期相关（在线补充图S2f）。进一步分析显示，PNCK在HNSCC中具有显著的预后预测能力。来自福建省肿瘤医院队列（n=193）和TCGA-HNSC（n=503）的数据表明，高PNCK表达与较低的生存时间相关（图1b，在线补充图S3a）。单变量及时间依赖性受试者工作特征（ROC）曲线证实了PNCK对整体生存率的预测有效性，曲线下面积（AUC）超过0.7（在线补充图S3b,c）。此外，长期随访显示，我中心PNCK低表达患者的复发率低于PNCK高表达患者（图1c）。这些结果表明，PNCK可能是HNSCC中一个有前景的预后指标。![]()
图1 对PNCK在预后及免疫炎症反应中预测意义的初步探索鉴于PNCK表达的临床意义，我们进一步深入研究其在肿瘤微环境（TME）中的内在作用及机制影响。KEGG富集分析显示，高PNCK表达富集于促癌相关通路，如Hedgehog信号通路（图1d），而低表达则富集于活跃的免疫炎症反应通路，如细胞因子-细胞因子受体通路（图1e）。这些结果提示PNCK的变化可能影响免疫微环境，值得进一步研究免疫细胞的浸润情况。因此，我们评估了肿瘤微环境中免疫环境的变化，发现高PNCK表达与TME中免疫细胞浸润减少相关。基质、免疫和ESTIMATE评分的分析显示高、低PNCK表达组之间存在显著差异（图1f，在线补充图S4a）。随后对细胞浸润的评估表明，大多数免疫细胞的水平（包括T细胞和B细胞）与PNCK表达呈显著负相关，这一结果通过TIMER（图1g）和ssGSEA算法得到了验证（在线补充图S4b）。此外，PNCK高表达还与CD8+ T细胞活化相关基因（如CD8A、CD8B、CTLA4、GZMA和GZMB）呈负相关（在线补充图S4c）。由于细胞因子在细胞间通讯、尤其是免疫反应中至关重要，我们观察到在不同PNCK表达水平的患者之间，趋化因子和白介素等重要细胞因子家族成员的活性存在显著差异（图1h）。此外，高PNCK表达患者与低PNCK表达患者之间的IFNγ评分也存在显著差异（在线补充图S4d）。总的来说，低PNCK表达与更高的免疫细胞浸润相关，表明其具有“免疫炎症”特征，而高PNCK表达则对应“免疫荒漠”特征。从免疫微环境的表征转向免疫治疗效果的预测是临床应用中的关键一步。在这方面，PNCK表达与常见的免疫检查点标志物呈负相关（图1i，在线补充图S4d）。通过TIDE算法分析TCGA-HNSC和黑色素瘤（GSE100797）队列中的免疫治疗反应率，我们发现PNCK表达较低的患者更有可能对免疫治疗产生反应（在线补充图S4e,f）。这表明PNCK表达较低的患者可能更容易从ICI治疗中受益，这可能与其更活跃的免疫炎症反应有关，例如多种免疫细胞的激活及促炎性细胞因子的释放。PNCK 在细胞层面上促进HNSCC恶性生物行为的验证基于PNCK在促癌通路中的高度富集，我们推测PNCK可能促进癌细胞的恶性行为，如转移和增殖。为了进一步验证这一假设，我们首先在CAL27和SCC7细胞中确认了PNCK的过表达（OE）和敲低（KD）（图2a,b）。肿瘤细胞的迁移和侵袭是癌症转移过程中关键步骤。在划痕实验中，PNCK敲低显著抑制了24小时后的细胞迁移（图2c）。迁移和侵袭实验显示，敲低组在48小时后通过膜和穿透Matrigel的细胞数显著减少，表明PNCK敲低抑制了HNSCC细胞的迁移和侵袭（图2d）。与此同时，无限制增殖是肿瘤细胞的关键生物学特征。CCK8实验显示PNCK敲低显著抑制了细胞生长，抑制作用在48小时达到峰值，SCC7细胞也显示出类似结果（图2e）。克隆形成实验中，PNCK敲低组的克隆形成显著减少（图1f）。EdU染色显示敲低组处于DNA复制阶段的细胞更多（图2g,h）。PNCK敲低增加了G1期的细胞比例，S期和G2期细胞数略有减少（图2i），提示G1期停滞和细胞周期紊乱。这些结果表明，PNCK在细胞恶性行为中起促进作用，可能成为潜在的癌症治疗靶点。![]()
图2 细胞水平验证PNCK促进头颈部鳞状细胞癌恶性生物学行为PNCK基因敲低通过诱导抗肿瘤免疫反应抑制肿瘤生长尽管PNCK在体外表现出促癌特性，但这些结果并未考虑到PNCK与肿瘤微环境（尤其是免疫系统）之间的复杂相互作用，而免疫系统对于肿瘤发展至关重要。为了解决这一局限性，我们在斑马鱼和小鼠模型中进行了体内研究，并使用HNSCC患者的组织芯片验证了我们的发现。斑马鱼作为强大的体内模型，显示出与人类高度相似的基因同源性（图3a）。斑马鱼的功能性研究表明，PNCK敲低减少了血管荧光，而PNCK过表达则增强了血管荧光，表明PNCK表达与血管生成之间可能存在联系（图3b,c）。随后，将野生型（WT）和PNCK敲低的SCC7细胞植入免疫健全的小鼠中，结果显示PNCK敲低显著抑制了HNSCC的生长、肿瘤质量（图3d,e,f）和肺转移（图3g,h）。为了进一步确认这种肿瘤抑制效应是否由免疫系统介导，将WT和PNCK敲低的SCC7细胞注射到严重免疫缺陷的小鼠（NSG）中。在免疫缺陷条件下，肿瘤减少的趋势变弱，且无统计学显著差异（在线补充图S5a），这突显了在PNCK敲低时免疫系统对抑制肿瘤进展的重要作用。对55个原发性肿瘤和5个匹配的非癌组织的免疫组织化学染色显示，肿瘤中的PNCK表达显著高于正常组织（图3i）。PNCK高表达的患者肿瘤体积显著更大（图3j），表明PNCK在HNSCC中表达上调，并与肿瘤体积相关，提示其促癌作用。![]()
图3 PNCK基因敲除显著抑制了头颈部鳞状细胞癌的体内生长基于在免疫健全C3H小鼠中观察到的肿瘤抑制作用，我们假设，抑制Pnck主要通过增强抗肿瘤免疫来发挥其抗肿瘤作用。为了阐明这一机制，我们对三个随机选取的Pnck敲低（KD）和野生型（WT）肿瘤样本的RNA进行了高通量测序，从而启动了转录组分析，这些样本分别来源于这些小鼠的移植肿瘤模型。我们最初在Pnck KD和WT肿瘤组织之间鉴定出421个差异表达基因（DEGs），其中115个上调，306个下调（图4a）。上调的DEGs包括免疫细胞趋化因子，如Ccl24、Ccr10、Cxcr2、Vtcn1和Ackr4（图4a），这表明免疫炎症细胞因子的分泌增加。GSVA通路富集分析显示，Pnck-KD肿瘤中免疫相关通路显著上调，如细胞因子生成和循环免疫蛋白介导的免疫过程（图4b）。在TCGA-HNSC数据集中，PNCK低表达组的通路与补体和凝血级联反应以及细胞因子-细胞因子受体相互作用相关，这表明存在抗肿瘤免疫。相比之下，PNCK高表达与细胞周期和DNA复制通路相关，这表明肿瘤增殖（图4c）。小鼠肿瘤组织的免疫组织化学结果显示，Pnck-KD组中CD4、CD8和CD11b的表达更高，且与PNCK表达呈负相关（图4d），这表明Pnck敲低激活了抗肿瘤免疫过程。![]()
这些结果表明，Pnck敲低可诱导免疫相关通路的激活，其特征是免疫炎症介质的分泌增加和抗肿瘤免疫应答增强。Pnck敲低增强了头颈鳞状细胞癌（HNSCC）治疗中免疫检查点抑制剂（ICIs）的治疗效果免疫检查点抑制剂已改变了多种癌症的治疗格局，但应答率仍然较低。肿瘤细胞可通过形成“免疫荒漠”微环境来逃避免疫检查点抑制剂的作用。目前正在探索“激活”肿瘤微环境（TME）和增强免疫细胞浸润的策略，以提高对免疫检查点抑制剂的应答率。我们发现，在我们内部队列和Pnck敲低小鼠中，肿瘤微环境表现出免疫炎症特征增强，同时PNCK表达降低。这一发现促使我们假设PNCK敲低可能使肿瘤对免疫检查点抑制剂治疗敏感。为了验证这一假设，我们设置了八组小鼠治疗实验：对照组（WT+IgG，n=10）、敲低组（KD+IgG，n=10）、接受抗CTLA-4单药治疗组（WT+抗CTLA4，n=10）、接受联合治疗组（KD+抗CTLA4，n=10）、接受抗PD-L1单药治疗组（WT+抗PD-L1，n=10）、接受联合治疗组（KD+抗PD-L1，n=10）、接受抗CTLA4和抗PD-L1联合治疗组（WT+抗CTLA4+抗PD-L1，n=10）以及另一组接受抗CTLA4和抗PD-L1联合治疗组（KD+抗CTLA4+抗PD-L1，n=10）。治疗始于肿瘤细胞注射后第5天，每3天给药一次，总剂量为600微克（图5a）。联合抗CTLA-4或抗PD-L1治疗显著减缓了肿瘤生长（图5b，c）。值得注意的是，在PNCK敲低组中，同时给予这两种治疗导致肿瘤生长速率和体积的减少最为显著。在单药治疗组中，40%的小鼠表现出肿瘤完全消退，而在双药联合治疗组中，70%的小鼠表现出肿瘤完全消退（图5c）。Pnck敲低联合免疫检查点抑制剂显著延长了生存期（在线补充图S5b）。治愈的小鼠在重新接种后未出现新的肿瘤，表明存在持久的抗肿瘤免疫记忆（图5d）。此外，抗CTLA-4联合治疗组肿瘤组织中的常见免疫细胞标志物和细胞因子，包括CD4、CD8、IFN-γ和PD-L1显著上调，表明免疫活性增强（图5e）。![]()
图5 PNCK基因敲除增强了免疫检查点抑制治疗的效果我们的研究结果表明，Pnck敲低可能会增强对免疫检查点抑制剂（ICI）治疗的敏感性，而且Pnck敲低与免疫检查点抑制剂治疗的联合方法可能会在肿瘤微环境（TME）内诱导炎症反应。单细胞RNA测序揭示Pnck敲低肿瘤与野生型肿瘤中独特的免疫微环境为了阐明Pnck敲低对肿瘤微环境（TME）异质性和免疫细胞群体变化的影响，我们对来自Pnck敲低（Pnck-KD）和野生型（WT）肿瘤的肿瘤细胞进行了单细胞RNA测序分析。对分选的细胞进行了10X单细胞转录组测序（在线补充图S6a）。我们获得了21,617个细胞，并通过UMAP聚类进行分析，确定了21个亚群。这些亚群包括五种免疫细胞类型（T细胞、B细胞、单核细胞/巨噬细胞、NK细胞和树突状细胞）和三种非免疫细胞类型（上皮细胞、成纤维细胞和内皮细胞）（在线补充图S6b，c）。在敲低组和野生型组之间，免疫细胞组成存在显著差异，其中Pnck敲低肿瘤中T细胞和B细胞富集，而野生型肿瘤中单核细胞/巨噬细胞更为普遍（在线补充图S6d，e）。免疫组织化学分析进一步证实了敲低组和野生型组之间免疫细胞的异质性。如在线补充图S7所示，该分析有力地验证了T细胞、树突状细胞和巨噬细胞在蛋白质水平的差异表达，这与单细胞RNA测序的结果一致。接下来，我们分析了Pnck敲低组和野生型组中相同免疫细胞亚群内的差异基因表达。在这些亚群内鉴定出了许多差异基因（在线补充图S6f）。为了进一步描绘肿瘤微环境（TME）内的异质性，我们对T细胞和B细胞进行了亚组分析。在T细胞中，我们确定了五个T细胞亚群：初始T细胞、增殖性T细胞、干扰素应答T细胞（IFN T）、耗竭T细胞（Tex）、前体耗竭CD8+T细胞（Tpex）和调节性T细胞（Treg）（图6a–d）。这些亚群在Pnck敲低（Pnck-KD）组和野生型（WT）组之间的比例存在显著差异。在Pnck-KD肿瘤中，耗竭T细胞占16.96%，而在WT肿瘤中占32.7%，而前体耗竭T细胞在Pnck-KD肿瘤中显著扩增（图6e）。此外，蛋白质表达分析显示，与WT样本相比，Pnck-KD样本中前体耗竭T细胞（Tcf7+ Pd1+ Cd8+）的比例更高（图6f，在线补充图S8a）。在这些亚组内，差异基因表达分析揭示了众多表达模式显著改变的基因，包括一系列功能基因的改变（在线补充图S8b）。KEGG富集分析表明，在前体耗竭T细胞亚群中，免疫相关通路如细胞因子-细胞因子受体相互作用、抗原加工、T细胞受体信号通路和自然杀伤细胞介导的细胞毒性上调，而在增殖性T细胞中，细胞周期和PI3K-Akt信号通路上调，这反映了免疫状态的激活（图6g，在线补充图S8c）。![]()
肿瘤浸润B淋巴细胞是肿瘤微环境（TME）中的重要组成部分，它们调节免疫反应并对肿瘤发展轨迹产生深远影响。在我们的研究中，观察到敲低（KD）肿瘤中存在显著的B细胞浸润（图7a）。我们确定了四种B细胞亚群：初始B细胞、记忆B细胞、调节性B细胞和浆细胞B细胞（图7b，c，在线补充表S3）。记忆B细胞在KD肿瘤中显著增加，而调节性B细胞在野生型（WT）肿瘤中占主导地位（图7d）。大多数细胞表达了激活标志物Tnfrsf8（Cd30），表明TME中存在活跃的B细胞（图7e）。调节性B细胞对免疫反应具有负调节作用，在WT肿瘤中更为丰富，这表明存在免疫抑制。我们在WT和KD组之间发现了许多差异表达基因（DEGs）（图7f）。值得注意的是，Ifi30在KD肿瘤中显著上调，与免疫促进B细胞和良好预后相关，而Ppp1r14b和C1galt1在WT肿瘤中上调，与免疫抑制B细胞和不良预后相关（图7g）。分化时间线表明，初始B细胞是其他亚型的前体（图7h）。![]()
PNCK通过调节ZEB1核转位重塑肿瘤免疫抑制微环境作为一种激酶，PNCK通过磷酸化其相互作用蛋白，从而引发一系列事件，这可能是驱动免疫炎症微环境重构的关键机制。基于这一假设，我们推测PNCK表达的变化将与微环境内磷酸盐含量的变化相关联。因此，我们测量了磷酸化蛋白的水平，并发现PNCK敲低（Knockdown, KD）对应于总体磷酸化蛋白浓度的降低，而过表达（Overexpression, OE）则导致浓度增加（图8a）。为了阐明PNCK如何促进免疫逃逸的机制，我们进一步进行了磷酸蛋白质组学分析，以研究在野生型PNCK（WT, n=3）和过表达（OE, n=3）条件下磷酸化的整体情况。我们的分析揭示了1267个差异磷酸化蛋白，其中817个蛋白的磷酸化水平增加，450个蛋白的磷酸化水平降低，这表明在PNCK过表达的情况下，蛋白磷酸化水平普遍呈上升趋势（图8b，c）。此外，我们将上调的磷酸化蛋白与WT和OE组中与PNCK相互作用的蛋白进行交集分析，确定了32个PNCK OE特异性上调的磷酸化蛋白（图8d）。![]()
图8 PNCK 调节 ZEB1 的核转运并重塑肿瘤免疫抑制微环境先前的研究已报道，在黑色素瘤细胞中，转录抑制因子ZEB1与CD8+T细胞浸润减少相关，并且是黑色素瘤免疫逃逸的关键决定因素。我们也检测到在PNCK敲低后，功能性T细胞向肿瘤微环境（TME）的浸润减少，这促使我们考虑PNCK与ZEB1之间可能存在某种关系。因此，我们探究了PNCK与ZEB1之间的功能相互作用，评估它们的表达之间是否存在相互关联。我们首先在SCC7细胞中验证了PNCK与ZEB1的相互作用（图8e）。蛋白质-蛋白质对接模拟描绘了PNCK与ZEB1之间稳定的对接界面，其中ZEB1（蓝色）和PNCK（黄色）通过Tyr-23和Tyr-229形成氢键（黄色虚线），产生的结合能为-14.6 kcal/mol，表明它们之间存在强烈的相互作用（图8f）。为了确定这种相互作用是否会引起下游功能的改变，我们注意到ZEB1的表达随着PNCK水平的变化而调节，即PNCK敲低组ZEB1表达降低，而PNCK过表达组ZEB1表达升高（图8g）。同时，在PNCK过表达（OE）组中，我们观察到核蛋白中ZEB1及其磷酸化形式（p-ZEB1）的水平相较于对照组有所升高（图8h）。这表明PNCK过表达促进了ZEB1及其磷酸化形式在细胞核内的积累，提示PNCK有助于ZEB1的核转位。此外，多细胞因子分析显示，PNCK敲低组中细胞因子水平升高，表明免疫反应更为显著（图8i）。鉴于阴性对照（NC）样本中细胞因子水平已经较低，PNCK过表达对细胞因子产生的抑制作用可能不易观察到。在这种低基线背景下，PNCK过表达的额外抑制作用变得难以检测。为了阐明ZEB1、PNCK和肿瘤中细胞因子产生之间的机制联系，我们进行了挽救实验。在该实验中，在PNCK过表达的细胞系中敲低ZEB1导致细胞因子水平显著升高，有效逆转了PNCK过表达的影响（图8i）。这表明PNCK通过ZEB1调节细胞因子表达，从而影响肿瘤微环境（TME）中的整体细胞因子谱。我们的数据表明，PNCK促进ZEB1的核转位，随后导致一系列炎性细胞因子的释放，从而增强TME内的免疫炎症状态（在线补充图S9）。讨论与结论
免疫疗法在肿瘤学中显示出巨大潜力，但其疗效在患者之间存在差异，导致过度治疗或治疗不足的问题。耐药性的一个关键因素是“免疫沙漠”型肿瘤中功能性T细胞的缺乏。基于PNCK过表达与“免疫沙漠”表型和免疫检查点抑制剂（ICI）耐药性相关的观察，我们证明了PNCK缺乏可抑制免疫健全小鼠中的肿瘤发生。这种肿瘤抑制作用主要归因于抗肿瘤免疫的激活。肿瘤的发展和进展依赖于肿瘤细胞与肿瘤微环境（TME）之间的相互作用，肿瘤微环境包括内皮细胞、成纤维细胞、免疫细胞和细胞外成分。肿瘤微环境维持着癌症的特征，如增殖信号、抵抗细胞死亡、血管生成、侵袭、转移、炎症和免疫逃逸。它还显著影响治疗效果，因此对于开发新的治疗策略至关重要。我们的研究确定了PNCK为癌基因，其抑制在体内和免疫缺陷小鼠中表现出一定程度的肿瘤抑制作用。值得注意的是，在免疫健全小鼠中，这种作用显著增强，并且还具有增强对免疫检查点抑制剂（ICI）敏感性的额外益处。具体而言，PNCK敲低具有肿瘤抑制作用，并增强了效应T细胞和B细胞的浸润，这表明存在免疫依赖性的抗肿瘤作用。了解肿瘤微环境（TME）对于开发有效的癌症治疗策略至关重要。本研究利用10X单细胞RNA测序技术，深入探讨了PNCK在调节肿瘤微环境中的作用。我们的结果显示，在Pnck敲低（Pnck-KD）和野生型（WT）肿瘤微环境之间，免疫细胞存在显著的异质性。一方面，T细胞在抗癌反应中起着关键作用，能够消除肿瘤细胞、抑制免疫逃逸并形成免疫记忆。Tpex细胞在免疫治疗中发挥着至关重要的作用，这表明增加它们在肿瘤微环境中的存在对于提高治疗效果和延长患者生存期至关重要。值得注意的是，在PNCK敲低组中发现了更多的Tpex细胞，这表明抗原呈递得到改善，免疫反应更强，这是有效癌症免疫治疗的关键因素。此外，耗竭的T细胞，尤其在PNCK野生型组中更为普遍，它们分泌更多的抗炎细胞因子，抑制免疫反应，并表达更高水平的抑制性受体，这些受体在与其他细胞相互作用时会抑制T细胞活性并损害疾病防御能力。耗竭T细胞的持久性和增殖能力有限，进一步损害了免疫系统。另一方面，癌症免疫疗法研究强调了B细胞在抗肿瘤免疫中的关键作用，因为B细胞能够产生针对肿瘤细胞的抗体，从而引发免疫反应，抑制肿瘤的生长和扩散。我们的研究表明，与野生型（WT）组相比，PNCK敲低（PNCK-KD）组中B细胞的数量更多。在野生型组中，主要的B细胞亚群是调节性B细胞，它们具有潜在的免疫抑制功能。这一发现进一步表明，PNCK敲低后，微环境在免疫学上变得更加活跃。因此，靶向PNCK可能为免疫系统有效对抗肿瘤创造有利条件，为开发癌症免疫疗法干预措施提供了见解。尽管我们的研究揭示了Pnck改变引起的免疫微环境异质性，但还需要进一步研究来阐明具体的调节机制和临床应用。细胞因子在塑造肿瘤微环境（TME）和调节免疫抑制方面起着关键作用。例如，白细胞介素-12（IL-12）可以激活促炎细胞因子，并增强T细胞和树突状细胞的功能，从而克服免疫抑制。对细胞因子表达，特别是膜锚定型IL-12的精确控制，可以重新极化肿瘤免疫微环境，提高T细胞治疗的疗效。有报道称，ZEB1可以通过抑制促炎细胞因子的表达或促进抗炎细胞因子的表达来调节肿瘤微环境中的免疫反应。这种调节功能可能会影响免疫抑制细胞（如髓源性抑制细胞和调节性T细胞）的功能和分布，进一步加剧肿瘤的免疫逃逸。ZEB1作为上皮-间质转化（EMT）中的一个关键分子，因其在肿瘤发生和免疫调节中的双重作用而备受关注，特别是它通过对细胞外基质重塑和免疫逃逸的影响。我们的研究表明，PNCK作为上游调节因子，通过调节ZEB1的磷酸化来影响细胞因子的表达，进而影响免疫细胞的浸润和活性。靶向PNCK或其对ZEB1的调节可能恢复肿瘤微环境中的免疫活性，提高免疫治疗的疗效。综上所述，本研究阐明了PNCK在影响肿瘤微环境和使头颈鳞状细胞癌（HNSCC）对免疫检查点抑制剂（ICIs）敏感方面的关键作用，从而为开发新型免疫疗法奠定了重要的科学基础。材料与方法
2015年1月至2018年1月期间，从福建省肿瘤医院收集了193例头颈肿瘤患者的肿瘤活检样本，并根据第八版TNM标准进行分期（见在线补充表S1）。无特定病原体（SPF）雌性C3H小鼠（6-8周龄）购自SPF（北京）生物技术有限公司。野生型（WT）斑马鱼的养殖标准参见《斑马鱼实验手册》。小鼠SCC7细胞（RRID：CVCL_V412）和人CAL27细胞（RRID：CVCL_1107）均来自本实验室的放射生物学研究室。实验流程详见在线补充材料。将SCC7细胞重悬于0.2毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中，并皮下注射到C3H小鼠或NSG小鼠的侧腹部。在第一组未采用联合治疗的动物实验中，每只小鼠注射1×10⁶个SCC7细胞。在第二组实验中，为了研究在较高肿瘤负荷下PNCK敲低（KD）联合免疫检查点抑制剂（ICIs）的效果，每只小鼠注射5×10⁶个SCC7细胞。治疗始于肿瘤细胞注射后第5天，每3天给药一次，总剂量为600微克。使用以下公式确定肿瘤大小：长径×(短径)²/2，并随时间绘制成曲线以创建生长曲线。如果实验过程中小鼠的肿瘤体积达到2000mm³，则立即对小鼠实施安乐死。在生存实验中，肿瘤体积超过1000mm³被视为重要事件。对于ICI治疗，接种野生型或Pnck敲低（KD）SCC7细胞的小鼠在第5、8和11天接受腹腔注射抗小鼠CTLA4单克隆抗体（mAbs）（每只小鼠200微克；BioXCell，货号BE0032，克隆号：UC10-4F10-11，RRID：AB_1107598）、抗PD-L1 mAbs（每只小鼠200微克；MCE，货号HY-P99145，克隆号：10F.9G2）或相应的同型对照mAbs。RNA提取、cDNA合成和实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）我们使用TRIzol试剂提取总RNA，并使用RT PCR试剂盒（Promega，货号LS2052）从1微克RNA中合成第一链cDNA。RT-qPCR使用SYBR Green Master Mix（Promega，货号LS2062）进行。循环条件设置为95°C 30秒，然后进行40个循环，每个循环为95°C 5秒和60°C 30秒。使用相对定量2-ΔΔCT方法计算相对水平。所有引物序列见在线补充表S2。在受精后30分钟的斑马鱼胚胎中，于琼脂糖培养皿中进行显微注射。采用RNA靶向编辑技术敲低内源性pnck基因。16 过表达（OE）实验将胚胎分为对照组（CMV-mCherry）和实验组（CMV-pnck），每组均重复三次。将注射后的胚胎（体积为6纳升）置于E3缓冲液中培养，并在受精后48小时（hpf）使用活体荧光显微镜进行观察。对pnck基因操作后血管生成率的变化进行计算机分析和统计学分析。实验流程详见在线补充材料。在实验后期对小鼠实施安乐死，并使用0.1毫克/毫升的脱氧核糖核酸酶I（DNase I）和1毫克/毫升的胶原酶D在37°C下消化肿瘤样本30分钟。将得到的单细胞悬液通过70微米细胞筛（Miltenyi Biotec，货号130-098-462）过滤，并与Fc阻断剂（1:200，BD Pharmingen，货号553142）孵育，以防止非特异性结合。细胞在冰上避光条件下与异硫氰酸荧光素（FITC）偶联的抗小鼠CD45抗体（1:200，BD Pharmingen，货号553079）、BV510偶联的抗小鼠CD8抗体（1:200，BD Pharmingen，货号563068）和固定活力染料（1:1000，BD Pharmingen，货号565388）染色40分钟。使用CytoFLEX S流式细胞仪（Beckman Coulter）进行流式细胞术分析，并使用CytExpert软件进行数据分析。单细胞分离、测序和数据分析的实验流程详见在线补充材料。组织样本首先用4%多聚甲醛固定，然后包埋于石蜡中，并切成4微米厚的切片。这些切片在二甲苯中脱蜡，并通过一系列梯度乙醇溶液进行复水。使用柠檬酸缓冲液（pH 6.0）在微波炉中进行抗原修复20分钟，然后在室温下冷却。接下来，用5%牛血清白蛋白在室温下封闭切片1小时，以防止非特异性结合。将针对目标抗原的特异性一抗应用于切片上，并在4°C下孵育过夜。用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，切片在室温下避光与不同荧光素偶联的二抗孵育1小时。细胞核用DAPI复染10分钟。染色后的切片用抗褪色封片剂封固，并在荧光显微镜下观察。使用适当的滤光片捕获不同荧光素的图像。样品经二硫苏糖醇和碘乙酰胺处理以实现蛋白质变性和烷基化，随后进行胰蛋白酶消化（1 mg/mL，1/50 w/w）和肽段脱盐。富集磷酸肽，并使用Sep-Pak C18柱进行色谱分离，采用流动相梯度（A：99.9% H2O，0.1% FA；B：99.9% ACN，0.1% FA）。质谱设置包括毛细管电压、气体温度和流速。数据通过MaxQuant软件与uniprot-Mus musculus-10090-2023.2.1.fasta数据库进行比对处理。实验流程详见在线补充材料。PNCK和ZEB1的蛋白质-蛋白质对接是使用GRAMM-X软件（网址：http://gramm.compbio.ku.edu/）进行的。PNCK和ZEB1的结构域是从蛋白质数据库（PDB，网址：http://www.rcsb.org/）中获得的。蛋白质-蛋白质相互作用使用Pymol（版本2.4）和PDBePISA（网址：https://www.ebi.ac.uk/pdbe/pisa/）进行可视化和分析。肿瘤组织被匀浆，并收集细胞上清液，使用Luminex 200系统进行多细胞因子测定。根据制造商的建议，分析了一组包含31种小鼠细胞因子的面板，包括TNF-α、IFN-γ、GM-CSF、IL-10、IL-16、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-6、CX3CL、CXCL1、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL16、CXCL5、CCL11、CCL12、CCL17、CCL19、CCL2、CCL20、CCL22、CCL24、CCL27、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7和CCL1。统计分析使用GraphPad Prism V.8.4.1软件进行。对于两组之间的比较，采用双尾非配对Student's t检验或Wilcoxon检验。对于涉及两组以上的比较，使用单因素方差分析（ANOVA）或双因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey多重比较检验。生存分析采用双侧log-rank检验，分类数据采用χ²检验进行比较。使用Spearman相关分析评估变量之间的关联性。p<0.05被认为具有统计学显著性。原文地址：https://jitc.bmj.com/content/12/10/e009893
注：因文章篇幅有限，所有相关引用文献，以及补充素材可以点击至原文查阅。
苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过六年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。![]()
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