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题目
中性粒细胞（Neutrophil）、中性粒细胞胞外陷阱（Neutrophil Extracellular Traps，NETs）与脓毒症（Sepsis）中的内皮细胞功能障碍（Endothelial Cell Dysfunction）
摘要
脓毒症（Sepsis）是一种持续的全身性炎症状态，涉及多器官衰竭，其原因是机体对感染的免疫反应失调。脓毒症的一个标志是内皮细胞功能障碍（Endothelial Dysfunction）。在脓毒症的进展过程中，中性粒细胞（Neutrophil）是抵御感染的第一道先天免疫防线。除了传统机制，如吞噬作用、释放炎症细胞因子、活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）和其他抗菌物质外，活化的中性粒细胞还释放一种由解聚的DNA、组蛋白、髓过氧化物酶（Myeloperoxidase）和其他颗粒组成的网状结构，这些结构称为中性粒细胞胞外陷阱（Neutrophil Extracellular Traps，NETs），它们可以有效捕捉血液循环中的细菌。相反，过度的中性粒细胞活化和NETs的释放可能会诱导内皮细胞转向促炎和促凝的表型。此外，中性粒细胞和NETs还可以降解内皮细胞表面的糖萼（Glycocalyx），增加内皮的通透性。因此，内皮屏障崩溃，导致微循环血流受损、组织灌注不足，并在脓毒症晚期引发危及生命的器官衰竭。1 引言
脓毒症（Sepsis）定义为由机体对感染的失调免疫反应引起的致命性器官功能障碍，仍然具有较高的发病率和死亡率。在脓毒症期间，中性粒细胞（Neutrophil）在宿主对入侵病原体的炎症反应中起着关键作用。中性粒细胞主要通过三种方式发挥效应功能：吞噬作用（Phagocytosis）、脱颗粒（Degranulation）和释放中性粒细胞胞外陷阱（Neutrophil Extracellular Traps，NETs）。NETs是由组蛋白（Histones）、胞质和颗粒蛋白组成的胞外网状解聚核DNA或线粒体DNA结构，具有抗微生物活性。NETs能够中和和杀死细菌、真菌和病毒，并抑制其扩散。然而，如果调控失衡，过量的NETs会进一步引发炎症和器官损伤，从而促进脓毒症的进展。其他免疫细胞，如巨噬细胞（Macrophages）和嗜酸性粒细胞（Eosinophils），也可以释放胞外陷阱（ETs），杀死病原体并参与脓毒症及其他疾病，如自身免疫过程。在脓毒症期间，中性粒细胞的寿命延长，迁移能力受损。这使它们局限于血管内，通过释放细胞因子、活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）和NETs引发过度的血管炎症。值得注意的是，中性粒细胞和NETs能刺激内皮细胞（Endothelial Cells）产生促炎和促血管生成的反应，导致免疫系统进一步失调。活化的内皮细胞表现出糖酵解率增加，进一步促进炎症和氧化应激。NET成分的直接破坏作用，加上炎症环境和氧化应激，会通过裂解连接、粘附分子的高表达以及细胞凋亡来降解内皮细胞表面的糖萼（Glycocalyx），增加内皮的通透性。此外，中性粒细胞和NETs通过降解抗凝系统和上调组织因子（Tissue Factor，TF）诱导内皮细胞呈现促凝表型。结果，内皮屏障的崩溃加剧了微血管渗漏，触发了血管低血压、组织水肿和脓毒症中的致命性器官衰竭。在本综述中，我们将重点讨论中性粒细胞、NET形成与脓毒症进展中的作用，随后总结它们对内皮细胞功能障碍的影响。最后，我们将提供有关潜在治疗靶点的证据。2 中性粒细胞、NET形成与脓毒症
中性粒细胞在先天免疫中起着关键作用，因为它们是抵御病原体的第一道防线。在感染或炎症期间，大量中性粒细胞从骨髓中逃逸出来。这一过程伴随着蛋白水解酶、活性氧（ROS）和活性氮物种（Reactive Nitrogen Species，RNS）的释放。在正常情况下，中性粒细胞是所有白细胞中寿命最短的，受调控的细胞死亡对于防止持续的炎症反应和组织修复至关重要。在脓毒症期间，大多数免疫细胞趋向于经历凋亡，形成免疫抑制环境，而中性粒细胞显示出凋亡延迟，导致炎症延长。几条信号通路的激活解释了中性粒细胞对凋亡的抗性。在外周循环中，补体成分5a（Complement Component 5a，C5a）和脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）等促炎因子激活细胞外调节蛋白激酶（ERK）1/2和磷脂酰肌醇-3激酶（PI-3K），导致Akt的磷酸化，随后是Bad的磷酸化，最终阻止了凋亡体的形成。C5a还增强了抗凋亡蛋白Bcl-xL的表达并减少了Bim的表达，进一步抑制了对细胞凋亡至关重要的剪接酶caspase的活性。当被LPS激活时，髓系核分化抗原防止髓系细胞白血病蛋白-1（MCL-1），Bcl-2家族中的抗凋亡因子，的蛋白酶体降解。在啮齿动物中，单细胞RNA测序确认了LPS刺激后，中性粒细胞的多个亚群被分化，并且程序性细胞死亡配体1（PD-L1）在特定亚群中高表达。机制上，脓毒症可以增强中性粒细胞上的PD-L1表达，通过直接接触诱发淋巴细胞凋亡，最终促进脓毒症诱导的免疫抑制。在脓毒症早期，表达CXC受体2（CXCR2）的中性粒细胞从血液中被招募到感染部位，响应CXC配体2（CXCL2）。迁移至感染部位后，中性粒细胞释放NETs、ROS和RNS以杀死病原体。然而，在严重脓毒症期间，中性粒细胞的迁移能力受损。这一过程涉及了中性粒细胞上表达的Toll样受体（TLRs）的激活。Alves-Filho等人发现，直接激活中性粒细胞上的TLR2导致CXCR2下调和趋化能力的损害。因此，中性粒细胞聚集在血管内，促进病原体扩散。研究表明，在生理条件下主要不存在于中性粒细胞中的CC受体2（CCR2），在通过TLRs激活后在循环中的中性粒细胞中表达。CCR2驱动了中性粒细胞向产生CC配体2（CCL2）的远端器官的不适当浸润，进一步引发肺、肝和肾等器官的组织损伤。众所周知，年长的脓毒症患者预后较差。炎症老化的组织显示出高频率的中性粒细胞逆向跨内皮迁移（reverse transendothelial migration，rTEM），进一步加剧远端器官损伤。Barkaway等人证明，年老小鼠显示出高水平的由肥大细胞衍生的CXCL1驱动的rTEM。在这一模式中，内皮异常趋化因子受体1-CXCL1的增强促使CXCR2在中性粒细胞上的脱敏，导致其方向性运动能力丧失，进一步加剧了血管渗漏和器官损伤。此外，在年老小鼠模型中发现NETs释放增加，可能加剧了炎症。2004年，Brinkmann等人证明了中性粒细胞能够释放NETs。作者推测NET形成是细胞死亡的早期事件。在白介素-8（IL-8）、LPS或佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸的刺激下，NET释放发生，涉及蛋白激酶C（PKC）的激活。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）帮助中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）从胞质颗粒转移到细胞核，在那里通过切割组蛋白破坏染色质。PKC和Raf-MEK-ERK信号通路激活的NADPH氧化酶促进了ROS的产生，导致钙内流增加，激活了瓜氨酸化酶4（PAD4）并使组蛋白瓜氨酸化。髓过氧化物酶（MPO）促进了染色质和核膜的分解，并在NET液泡中与颗粒混合。细胞内NET形成（NETosis）成熟后，NETs通过中性粒细胞外膜的破裂被挤出。Remijsen等人发现，NET形成涉及NADPH氧化酶介导的超氧化物产生和自噬，且二者相互独立。然而，自噬的参与仍存在争议。Simon等人则表明，NET形成在小鼠和人类细胞系中并不依赖自噬。在中性粒细胞和血小板通过CD11a直接相互作用后，革兰氏阴性菌通过激活血小板中的TLR4诱导NET形成。革兰氏阳性菌诱导的NETosis则需要TLR2和补体受体3。除了上述的自杀性NETosis外，中性粒细胞能够在不破裂膜的情况下释放NETs。在NET生成过程中，DNA小囊泡如同串珠从核膜出芽，通过胞质，并与外膜融合。最终，NETs被运送出细胞。这种类型的NETosis不依赖于ROS，并且仅需30分钟，而自杀性NETosis则需要数小时。据建议，中性粒细胞可以在不依赖细胞死亡的过程中释放线粒体DNA（mtDNA）。mtDNA不含组蛋白，与质粒DNA相似。在核DNA和mtDNA被转运出细胞后，中性粒细胞仍具备效应功能，如趋化性、招募和吞噬能力（Figure 1）。![]()
图1中性粒细胞（Neutrophil）、NET形成与脓毒症（Sepsis）。
(A) 在非重症脓毒症期间，表达CXCR2的中性粒细胞（Neutrophil）从血液中被CXCL2招募至感染部位。中性粒细胞迁移至感染部位，通过释放抗菌物质如活性氧（ROS）、一氧化氮（NO）和中性粒细胞胞外陷阱（Neutrophil Extracellular Traps，NETs）来杀死病原体。其他免疫细胞如淋巴细胞（Lymphocyte）也可迁移至感染部位以防止病原体扩散。(B) 然而，在重症脓毒症期间，中性粒细胞的寿命延长，功能受损，原因是CXCR2下调和CCR2上调。一方面，迁移能力受损导致病原体扩散。另一方面，许多中性粒细胞局限于血管内并释放NETs，导致血管炎症、内皮损伤和血栓形成。NET形成可分为三种类型。第一种类型为自杀性NETosis，因为NETs通过细胞裂解释放。第二种类型允许NET释放与中性粒细胞常规活性功能如吞噬作用共存。第三种类型是线粒体DNA（mtDNA）NETosis，存活的中性粒细胞释放mtDNA形成NETs，这一过程不依赖于细胞死亡，但依赖于ROS。(C) 外周循环中的脂多糖（LPS）和补体成分5a（C5a）通过三条信号通路诱导中性粒细胞对凋亡的抗性。此外，中性粒细胞通过PD-L1上调诱导淋巴细胞凋亡。另外，CCR2在正常条件下不存在于中性粒细胞中，但通过Toll样受体（TLR）的激活，在中性粒细胞中上调。CCR2驱动了中性粒细胞不适当浸润至产生CCL2的远端器官，进一步导致肺、肝和肾等远端器官的组织损伤。C5a，补体成分5a；CCL2，CC配体2；CCR2，CC受体2；CR3，补体受体3；CXCL2，CXC配体2；CXCR2，CXC受体2；ERK1/2，细胞外调节蛋白激酶1/2；G-，革兰氏阴性菌；G+，革兰氏阳性菌；iNOS，诱导型一氧化氮合酶；LPS，脂多糖；MCL-1，髓系细胞白血病蛋白-1；MNDA，髓系核分化抗原；MPO，髓过氧化物酶；mtDNA，线粒体DNA；NE，中性粒细胞弹性蛋白酶；NETs，中性粒细胞胞外陷阱；PAD4，瓜氨酸化酶4；PD-L1，程序性细胞死亡配体1；PI-3K，磷脂酰肌醇-3激酶；PI3Kγ，磷脂酰肌醇-3激酶γ；PMA，佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸；ROS，活性氧；TLR，Toll样受体。
正如之前所述，NETs在宿主免疫中起着关键作用。外化在NETs上的抗菌蛋白LL-37改善了脓毒症小鼠的存活率，可能是通过抑制促炎细胞因子的释放。然而，NETs的过量释放促进了炎症。在胞外空间，宿主的无细胞DNA可作为损伤相关分子模式（Damage-Associated Molecular Pattern，DAMP）。此外，线粒体DNA（mtDNA）可刺激小鼠脾细胞和巨噬细胞分别分泌肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）。胞外组蛋白也被认为是DAMP，因为它们通过TLR和Nod样受体信号通路激活免疫细胞。Xu等人表明，组蛋白促使了IL-6、IL-10和TNF-α的高水平表达。3 中性粒细胞、NETs与免疫性血栓形成
Engelmann等人回顾了NET介导的血栓形成机制，并将此过程命名为“免疫性血栓形成”（Immunothrombosis）。尽管该过程可以捕捉病原体并防止其扩散，但过度的血栓形成可能进一步促进脓毒症的进展。在NETs中，DNA纤维和组蛋白网络提供了一个招募红细胞、血小板、白细胞和血浆蛋白的支架，从而形成正反馈循环，增强体内和体外的血栓形成。最近的一项研究表明，NETs中的胞外DNA可以与vWF（von Willebrand Factor）相互作用，进一步促进血栓形成和炎症。此外，受损的内皮细胞的炎症传播了急性期反应物，如vWF和细胞表面粘附受体进入循环系统。Von Brühl等人显示，NETs促进了凝血因子XII（FXII）与中性粒细胞的相互作用，并启动了内源性凝血途径。在脓毒症小鼠中的活体显微镜数据显示，NETs中的组蛋白H4诱导了血管内凝血。此外，NETs通过抑制抗凝血剂（如抗凝血酶AT、活化蛋白C APC和TF途径抑制剂）促进了血栓形成。最近的一项研究表明，中性粒细胞还可以释放携带活性组织因子的NETs。在脓毒症患者中，富含组织因子的NETs可能导致免疫性血栓形成，并加重病情结局。NETs诱导的血栓形成导致器官缺血性损伤和弥散性血管内凝血（DIC）。在脓毒症晚期，DIC的发生率较高，且与多器官衰竭和难治性脓毒性休克有关。4 中性粒细胞和NETs诱导的促炎和促血管生成的内皮细胞表型
在脓毒症期间，NETs触发内皮细胞的激活，并可能损害其结构和/或功能。病原体识别受体（如TLRs）的参与促使内皮细胞重新编程，趋向促炎和促血管生成的表型。Wojciak-Stothard等人发现，NETosis的标志物在肺动脉高压患者中增加。作者证明，NETs可以通过MPO/H2O2依赖的TLR4/NF-κB信号通路激活在人类肺动脉内皮细胞（HPAECs）中诱导促炎和促血管生成反应。他们还显示，NETs显著诱导了HPAECs中细胞间粘附分子-1（ICAM-1）和几种促血管生成因子的表达水平，如血小板衍生生长因子（PDGF）和肝素结合的EGF样生长因子。NF-κB信号通路的激活通过增加血管细胞粘附分子（VCAM-1）、血小板内皮细胞粘附分子-1（PECAM-1）的表达以及IL-6、IL-8和血管内皮生长因子（VEGF）的分泌，增强了内皮细胞的促炎和促血管生成反应。据报道，NETs通过几条与Akt、ERK1/2和p38的磷酸化相关的途径诱导了中性粒细胞效应功能，如胞吐作用、ROS生成和NET形成。有趣的是，IL-8的产生与NET形成通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路激活紧密相关。NETs诱导了一种"M1样"的巨噬细胞表型，其特征是释放炎性细胞因子，如IL-1、IL-6、IL-8和TNF。在体外和体内，M1表型巨噬细胞还分泌几种促血管生成因子，包括VEGF和成纤维细胞生长因子（FGF）。VEGF作为最重要的生长因子之一，能够通过增加葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）、果糖-2,6-二磷酸酶-3（PFKFB3）和乳酸脱氢酶A（LDH-A）的表达水平来刺激糖酵解。此外，VEGFR2的激活通过PI3K/Akt途径抑制了生长抑制转录因子FOXO1的表达，FOXO1通过抑制糖酵解和线粒体呼吸来维持内皮细胞静止状态。增殖增强转录因子MYC位于内皮细胞的细胞核内，驱动合作促进增殖和糖酵解的基因表达。先前的一项研究表明，作为NET组成部分之一的NE参与了对血管生成至关重要的一些生长因子的蛋白水解，如VEGF和PDGF。Ebos和Kerbel认为，阻断一种生长因子可能会补偿性地上调其他生长因子的表达，并再次刺激血管生成。这可以解释为什么抗VEGF治疗的疗效在患者中有所不同，并且仅导致部分血管回归。在炎症的动物模型中，Mirabelli等人报告称，局部抗VEGF治疗仅将角膜新生血管减少了14%。机制上，当VEGF被阻断时，其他生长因子如FGF的表达可能会增加，从而通过FGF-MYC-HK2轴再次促进糖酵解。在脓毒症早期，过量释放的促炎细胞因子和生长因子促使内皮细胞仍然处于以高糖酵解为特征的增殖状态。值得注意的是，增强的糖酵解促进了NF-κB驱动的内皮炎症。PFKFB3的增加活性在体外和急性肺损伤模型中刺激了ICAM-1和VCAM-1的表达。这似乎是通过NF-κB的激活实现的，进一步诱导了中性粒细胞和巨噬细胞的募集。增殖中的内皮细胞表现出即使在有氧的情况下也具有高水平的糖酵解，类似于肿瘤细胞中的Warburg效应。肿瘤血管中的类似代谢转变可以解释脓毒症中内皮细胞代谢的变化。在肿瘤血管生成期间，糖酵解的最终产物乳酸通过促进NF-κB抑制因子IκB-α的磷酸化和降解来激活NF-κB。随后，激活的NF-κB增强了内皮细胞的促炎反应，如上所述的那样。这些变化加剧了脓毒症期间的炎症和氧化应激（Figure 2）。![]()
图2 中性粒细胞（Neutrophils）和NETs通过激活NF-κB信号通路诱导促炎和促血管生成的内皮细胞表型。
(A) NETs通过MPO/H2O2介导的NF-κB激活刺激人类内皮细胞中的促炎和促血管生成反应。此外，NETs激活了几种中性粒细胞功能，如胞吐作用、ROS生成和NET形成，这可能与Akt、ERK1/2和p38的磷酸化有关。除了对中性粒细胞的影响外，NETs还诱导了“M1样”巨噬细胞表型，其特征是释放促炎性细胞因子，如IL-8。此外，研究发现IL-8的浓度通过MAPK通路的激活与NET形成密切相关。外化在NETs上的抗菌蛋白LL-37能够抑制巨噬细胞的焦亡（pyroptosis），从而抑制促炎细胞因子的释放。
(B) NF-κB信号通路通过上调ICAM-1、VCAM-1、PECAM-1，并增加IL-6、IL-8和VEGF-A的分泌，增强了内皮细胞的促炎和促血管生成反应。此外，在此过程中释放了许多促血管生成因子，如VEGF、PDGF和FGF。这些因子通过上调MYC和HIF-1α以及下调FOXO1，增加了糖酵解酶和转运体的表达水平。
(C) 在炎症和血管生成反应期间，增殖的内皮细胞因糖酵解酶和转运体（如GLUT1、PFKFB3、HK、PK和LDH-A）的上调而显示出比静止细胞更高的糖酵解率。值得注意的是，PFKFB3和糖酵解产物乳酸通过NF-κB驱动的血管炎症起作用。F1,6BP，果糖-1,6-二磷酸；F2,6BP，果糖-2,6-二磷酸；F6P，果糖-6-磷酸；FGF，成纤维细胞生长因子；G6P，葡萄糖-6-磷酸；GLUT1，葡萄糖转运蛋白1；HIF-1α，缺氧诱导因子-1α；HK，己糖激酶；ICAM-1，细胞间粘附分子-1；LDH-A，乳酸脱氢酶A；MAPK，丝裂原活化蛋白激酶；NF-κB，核因子κB；NOX2，NADPH氧化酶2；OXPHOS，氧化磷酸化；PDGF，血小板衍生生长因子；PECAM-1，血小板内皮细胞粘附分子-1；PEP，磷酸烯醇丙酮酸；PFK-1，磷酸果糖激酶-1；PFKFB3，果糖-2,6-二磷酸酶3；PK，丙酮酸激酶；VCAM-1，血管细胞粘附分子-1；VEGF，血管内皮生长因子。
简而言之，中性粒细胞和NETs通过NF-κB激活能够在内皮细胞中诱导促炎和促血管生成反应。内皮细胞中增强的糖酵解驱动了促炎程序和ROS的积累。结果，这形成了一个恶性循环，导致持续的血管炎症和过度的氧化应激。5 中性粒细胞和NETs损伤内皮细胞的糖萼并增加内皮渗透性
如前所述，中性粒细胞和NETs会损伤内皮细胞的糖萼并增加内皮的渗透性。这一现象可能进一步导致失调的炎症、微循环血流障碍、组织低灌注和危及生命的器官衰竭。覆盖内皮细胞的基质网状结构就是糖萼，它由糖胺聚糖（GAG）、蛋白多糖和糖蛋白组成。GAG链包含肝素硫酸盐、软骨素硫酸盐和透明质酸，这些成分与CD44结合。选择素和整联蛋白是参与中性粒细胞粘附和凝血的糖蛋白。内皮糖萼还固定了胞外超氧化物歧化酶（SOD3），后者防止氧化应激。糖萼也存在于细胞间隙和靠近基底膜的一侧。糖萼的损伤会导致血管屏障受损并提高微血管渗透性。由于糖萼的破坏，内皮细胞的粘附分子暴露，进一步引发炎症、白细胞和血小板的滚动和粘附。一项临床研究表明，在带有组蛋白复合DNA（hcDNA）高水平的儿科创伤患者中，血浆中的syndecan-1（一种蛋白多糖）水平升高，这表明糖萼发生了降解。通过MPO、基质金属蛋白酶（MMP）和其他含有NET的蛋白酶的酶解也会诱导糖萼的降解。虽然MMP-9活性的作用存在争议，但一项临床试验显示，MMP-9的活性形式仅存在于重症脓毒症患者中。此外，许多由中性粒细胞和NETs诱导的炎性细胞因子，如TNF-α、IL-6和IL-8，可以直接损伤糖萼。肥大细胞受到TNF-α刺激后，可以释放细胞因子、蛋白酶、组胺和肝素酶，进一步促进糖萼的降解。一项最近的研究表明，在炎症过程中，整合素与金属蛋白酶15的表达上调，它们在膜近端区域裂解CD44，破坏了内皮细胞糖萼的完整性。此外，氧化应激诱导的组蛋白去乙酰化酶能够上调MMP的表达并抑制MMP的组织抑制因子（TIMP1和TIMP3），进一步激活MMP2和MMP9，促进syndecan-1和SOD3从内皮细胞表面脱落，最终导致内皮糖萼的紊乱。脓毒症期间的旁内皮渗透性主要因连接断裂而增加。在内皮细胞之间存在两种常见的连接类型：紧密连接（TJs）和粘连连接。紧密连接包含闭合蛋白和claudin，这些蛋白通过紧密连接区域蛋白（ZO）锚定在肌动蛋白骨架上。TNF-α可以通过激活NF-κB通路破坏内皮细胞间的claudin-5。ROS会导致occludin从细胞间连接处重新排列，从而促进其与ZO-1的解离，并增加内皮的溶质渗透性。粘连连接主要由血管内皮（VE）钙粘蛋白组成，通过连接素连接到肌动蛋白骨架。由于VE-钙粘蛋白易受酶解破坏，因此容易被MMP裂解，进一步损害连接的完整性。在NETs诱导的炎症反应过程中，cAMP/Rac1信号被抑制。反过来，这会刺激Rho活性和激酶如Src和Pyk2的激活，这两者都会导致VE-钙粘蛋白磷酸化、与连接蛋白的解离和内吞作用。VE-钙粘蛋白的内吞增加了内皮细胞之间的间隙，加剧了血管屏障的渗透性。ICAM-1的表达在炎症和血管生成期间显著上调。几项研究表明，这种粘附分子可能在调节屏障完整性方面起着重要作用。一方面，越来越多的证据表明，ICAM-1通过促进VE-钙粘蛋白的磷酸化，在中性粒细胞依赖的方式下破坏了内皮的渗透性。另一方面，Sumagin等人提出，ICAM-1的过表达通过PKC依赖的信号传导增加了内皮的渗透性，而无需白细胞的存在。研究还表明，ICAM-1信号传导除了在调节旁细胞渗透性方面发挥重要作用外，还可以参与跨细胞渗透性的调节。例如，穴样小泡是将白蛋白从内皮的管腔侧运输到基底膜的主要机制之一。重要的是，caveolin-1的Src磷酸化受到ICAM-1结合的促进。内皮细胞的凋亡导致了高渗透性。NETs在脓毒症期间促进内皮细胞的凋亡。Saffarzadeh等人发现，NETs直接诱导内皮细胞死亡，其细胞毒性部分由组蛋白和MPO介导。此外，在促炎环境下，中性粒细胞和NETs会使O2−和NO的产生增加1000倍，增加过氧亚硝酸盐（ONOO−）的形成，导致NO可用性减少。过氧亚硝酸盐会诱导线粒体外膜的通透性，允许各种促凋亡信号分子的流出。过氧亚硝酸盐还能够诱导DNA损伤，并激活DNA修复酶PARP-1。在严重的DNA损伤下，PARP-1的过度激活会耗尽细胞内的NAD+储备，而NAD+是糖酵解途径的关键辅因子。因此，NAD+的丧失导致腺苷三磷酸（ATP）的减少，进一步导致内皮功能障碍（Figure 3）。![]()
图3 中性粒细胞（Neutrophils）和NETs损伤内皮细胞的糖萼并增加内皮的渗透性
(A) 在脓毒症期间，NETs可以通过hcDNA和蛋白酶直接导致糖萼的降解。此外，由中性粒细胞和NETs诱导的大量炎性细胞因子，如IL-6、IL-8和TNF-α，也可以损伤糖萼。此外，肥大细胞被TNF-α激活，释放细胞因子、蛋白酶、组胺和肝素酶，进一步降解糖萼。此外，氧化应激诱导的HDAC能够上调MMP的表达并抑制MMP的组织抑制因子（TIMP1和TIMP3），从而激活MMP促进糖萼的脱落。
(B) 在糖萼降解后，内皮细胞的粘附分子暴露，引发进一步的炎症、白细胞和血小板的滚动和粘附。
(C) 内皮旁渗透性增加主要是由于连接的断裂。研究表明，TNF-α通过激活NF-κB导致claudin的破坏。ROS导致occludin的重新分布，限制了其与ZO-1的关联。VE-cadherin容易受到酶解。此外，炎症介质通过多个信号通路促进VE-cadherin的磷酸化和与p120连接蛋白的解离，并诱导VE-cadherin的内吞作用。上调的ICAM-1也可以促进VE-cadherin的磷酸化。
(D) ICAM-1还可以通过caveolin-1的磷酸化增加跨内皮的渗透性，caveolin-1是caveolae的主要组成部分。然而，内皮细胞的凋亡是导致跨内皮渗透性增加的主要原因。NETs通过MPO和组蛋白促进凋亡。此外，在氧化应激期间形成的ONOO−也通过DNA损伤诱导细胞死亡。GAG，糖胺聚糖；hcDNA，组蛋白复合DNA；HDAC，组蛋白去乙酰化酶；MMP，基质金属蛋白酶；ONOO−，过氧亚硝酸盐；SOD，超氧化物歧化酶；VE-cadherin，血管内皮钙粘蛋白；ZO，紧密连接蛋白。
中性粒细胞在某些病原体特异性感染中可能通过减少血管渗漏在脓毒症中发挥部分保护作用。例如，在由脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitides，Nm）引起的脑膜炎球菌血症中，中性粒细胞的募集能够进行有效的吞噬作用，部分减少由细菌引发的血管渗漏。有趣的是，Nm是强效的中性粒细胞胞外捕网（NET）诱导剂。Lappann等人发现，NETs可以抑制细菌生长，但无法产生杀菌活性。
6 中性粒细胞和NETs通过降解抗凝系统和上调组织因子诱导内皮细胞的促凝表型
覆盖在内皮管腔侧的糖萼在维持血管腔内的抗血栓性中极为重要。一旦糖萼被NETs损伤，ICAM-1、E-selectin和其他粘附分子暴露在裸露的内皮上，从而加速了中性粒细胞和血小板的募集。此外，糖胺聚糖（GAGs）在生理条件下能够防止凝血。在血管系统中，硫酸乙酰肝素是糖胺聚糖的主要成分，约占总含量的50%-90%。硫酸乙酰肝素主要与抗凝血酶（AT）结合，而硫酸皮肤素与肝素辅因子II（HCII）结合。此外，硫酸乙酰肝素也可以与HCII结合。抗凝血酶通过灭活凝血酶（因子IIa）和因子Xa发挥其抗凝作用，而HCII仅抑制凝血酶。组织因子（TF）在凝血中也起着至关重要的作用。该蛋白通常表达在内皮细胞上，并未与血液直接接触。当中性粒细胞和NETs损伤内皮时，TF暴露出来，启动了血浆介导的止血过程（即外源性途径）。在此过程中，TF作为血浆因子VIIa的细胞受体，TF/VIIa复合物随后激活因子IX和因子X。在需要因子V的关键反应中，因子Xa通过蛋白水解切割凝血酶原生成凝血酶。最终，FXIIIa（由凝血酶激活的转谷氨酰胺酶）诱导形成不溶性纤维蛋白凝块。NETs还可以上调内皮细胞中的TF表达。Folco等发现，用NETs处理人类内皮细胞会增加TF mRNA的表达并增强内皮细胞的TF活性。在机制上，NETs通过IL-1α和组织蛋白酶G诱导TF产生。组织蛋白酶G是NETs中的一种丰富的丝氨酸蛋白酶，它裂解前体IL-1α，进而激活IL-1α促进TF的生成。Haubitz等人显示，蛋白酶3（PR3）和弹性蛋白酶刺激了人类内皮细胞中的TF表达，而弹性蛋白酶诱导的促凝作用被α1-抗胰蛋白酶（α1-AT）阻断，表明该作用依赖于酶的活性。有趣的是，PR3对内皮细胞的促凝作用是非酶促的。组蛋白是NETs的另一种成分，通过上调TF和下调抗凝血酶调节蛋白（TM），触发内皮细胞的促凝状态，这一过程由TLR2和TLR4调节。此外，组蛋白的细胞毒性作用可能会在内皮上暴露磷脂酰丝氨酸（PS）。PS通常存在于血浆膜的内层，可以通过将TF转移到外层来刺激其促凝活性。NETs中的过氧化氯酸由MPO生成，增加了人类大隐静脉内皮细胞中的TF mRNA表达水平并刺激了内皮TF活性。多种抗凝机制，尤其是TM、蛋白C和内皮蛋白C受体（TM-PC-EPCR）抗凝途径，在脓毒症或炎症期间受到抑制。TM-PC-EPCR系统是重要的内源性抗凝机制。在凝血过程中，凝血酶和蛋白C分别与其受体TM和EPCR结合，形成凝血酶-TM-PC-EPCR复合物，从而进一步促成活化蛋白C（APC）的形成。APC是一种由凝血酶从前体蛋白C生成的蛋白酶，具有许多抗凝特性，如灭活促凝因子FVa和FVIIIa，促进纤溶酶原激活物的释放。如上所述，NETs可以激活内皮细胞中的NF-κB信号通路。该转录因子在凝血中起着重要作用。Song等开发了一种转基因小鼠，其内皮细胞中过表达了NF-κB抑制因子I-κBα的突变体。转基因小鼠的凝血酶-AT水平降低，表明NF-κB信号通路可能参与了脓毒症引发的凝血过程。内皮特异性NF-κB信号通路的激活会导致内皮细胞中的TM和EPCR蛋白水平下降。此外，阻断内皮NF-κB信号抑制了TNF-α转化酶活性，该酶负责EPCR的脱落，从而降低血浆纤溶酶原激活物抑制剂1型（PAI-1）水平并恢复APC水平。除抗凝作用外，APC还具有细胞保护特性，例如阻止炎性细胞因子的释放，维持内皮完整性并保护细胞免于凋亡。因此，血浆中APC水平的下降与预后密切相关。尽管存在争议，APC已用于治疗严重脓毒症。![]()
图4中性粒细胞和中性粒细胞胞外捕网（Neutrophil Extracellular Traps, NETs）通过降解抗凝系统并上调组织因子（Tissue Factor, TF），诱导内皮细胞的促凝表型。
(A) 糖胺聚糖（Glycosaminoglycans, GAGs）在抗凝系统中起关键作用：硫酸乙酰肝素（Heparan Sulfate, HS）主要与抗凝血酶（Antithrombin, AT）结合，以抑制因子IIa和因子Xa；硫酸皮肤素（Dermatan Sulfate, DS）主要与肝素辅因子II（Heparin Cofactor II, HCII）结合，以抑制因子IIa。此外，HS还与HCII相互作用。因此，NETs诱导的糖萼降解有助于抗凝系统的破坏。
(B) 此外，粘附分子和TF暴露在内皮上，导致血栓和纤维蛋白形成。除了释放富含TF的NETs，中性粒细胞还通过NET成分增加内皮上的TF表达水平。
(C) 胱天蛋白酶G（Cathepsin G）、弹性蛋白酶（Elastase）、蛋白酶3（Proteinase 3, PR3）和髓过氧化物酶（Myeloperoxidase, MPO）可以通过不同的信号通路刺激TF表达，并进一步启动外源性凝血途径。另一种NET成分——组蛋白（Histone），通过上调TF和下调血栓调节蛋白（Thrombomodulin, TM）诱导内皮促凝表型，这些作用部分由Toll-like Receptor 2, TLR2和Toll-like Receptor 4, TLR4介导。此外，组蛋白能够刺激磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）暴露，增强TF的促凝活性。此外，NETs还可以通过Nuclear Factor-kappa B, NF-κB激活破坏TM-PC-EPCR系统（血栓调节蛋白、蛋白C和内皮蛋白C受体），这是重要的天然抗凝机制。NF-κB信号还促进肿瘤坏死因子α转换酶（TNF-α Converting Enzyme, TACE）活性，据报道它负责EPCR的脱落。
7 潜在的败血症治疗靶点
7.1 抑制败血症中的NET形成
白精氨酸脱亚胺酶4（Peptidyl Arginine Deiminase 4, PAD4）是参与染色质松弛的重要酶。通过催化组蛋白瓜氨酸化，PAD4削弱了DNA和组蛋白的结合（见图5和表1）。PAD4的过度表达通过释放NETs并诱导内皮细胞上ICAM-1和VCAM-1的表达，导致严重的血管损伤。因此，使用PAD4抑制剂可以预防NET的形成，并避免内皮细胞功能障碍。Martinod等人发现，PAD4−/−小鼠在一定程度上免受LPS诱导的休克影响。PAD4抑制剂Cl-amidine在小鼠败血症模型中有效预防了NET的形成并提高了总体存活率。PAD4抑制剂GSK484抑制NET形成，显著减少了小鼠肺部的血栓形成。新生儿NET抑制因子（Neonatal NET-inhibitory Factor, nNIF）可以抑制PAD4活性、组蛋白瓜氨酸化和核松弛化。Yost等人证明，nNIF及其相关肽能够在小鼠感染和全身炎症模型中阻断NET的形成。然而，需要注意的是，PAD4并不总是NET释放所必需的，因为线粒体DNA（mtDNA）不含组蛋白，这表明抑制NET形成的效果有限。![]()
图5潜在的败血症治疗靶点。在血管中，nNIF、NRPs和PAD4抑制剂通过抑制染色质松弛来防止NET的形成。此外，PAD4抑制剂还可能减少ICAM-1和VCAM-1的表达。与野生型对照相比，TLR-4−/−小鼠未表现出增强的血栓反应，且循环中的ICAM-1显著减少。DNase1和DNase1-like 3通过降解NET结构的支架来阻断血栓形成的正反馈循环。PFKFB3阻滞剂可用于控制败血症期间由过度糖酵解引起的炎症。使用PFKFB3抑制剂还可以促进NADPH的生成，这可能诱导NET的形成。此外，PFKFB3阻滞剂放大了VEGFR阻断剂的抗血管生成作用。在灌注的内皮细胞模型中，补充GSH或NAC（GSH的前体）显著减少了ROS的生成。HSA可以抑制循环和组织中O2−的生成，并抑制NF-κB的活化，从而抑制氧化应激和氮化应激。除了直接清除ROS和RNS，维生素C还通过防止NOX的活化，减少iNOS的表达，并增强NO的生物利用度来减少它们。随之减少的**ONOO−**的形成能够有效预防内皮细胞的凋亡。
TLR4 表达在血小板上，也参与了小鼠和人类中NET的诱导。Obi等人报告称，与野生型对照相比，TLR4−/− 小鼠没有表现出增强的血栓形成反应，循环中的ICAM-1水平明显降低。因此，这表明抑制TLR4可能改善败血症患者的临床结果。C34是一种新型的TLR4抑制剂，在体外和体内均有效。它在小鼠内毒素血症模型中减少了全身性炎症反应。TAK-242是另一种TLR4信号通路的抑制剂。该化合物通过与TLR4的TIR结构域中的747号半胱氨酸结合，抑制TLR4信号依赖的炎症反应。尽管实验室研究结果令人鼓舞，但一项随机对照试验显示，TAK-242未能降低败血症患者的细胞因子水平。Eritoran (E5564)是Rhodobacter aphaeroides的合成类脂A类似物，它在体外和体内显著抑制LPS诱导的NF-κB活化和炎症性细胞因子产生。然而，在一项严重败血症的临床研究中，Eritoran并未显著降低28天死亡率。值得注意的是，TLR4抑制剂在NET形成中可能发挥间接作用，TLR的抑制可能具有多效性。Claushuis等人证明，在小鼠败血症模型中抑制血小板的TLR信号通路并未改变宿主的免疫反应，这表明TLR在败血症进展中的重要性可能有限。DNase通过降解NET结构的支架，阻断了血栓形成的正反馈回路。DNase1主要在非造血组织中表达，优先切割不含蛋白的DNA。此外，免疫细胞分泌DNase1-like3，其靶向DNA-蛋白复合物，如核小体。DNase1和DNase1-like3还可以在体外和体内的败血症中保护内皮细胞。7.2 抑制败血症中的糖酵解
与肿瘤内皮细胞类似，激活的内皮细胞在败血症期间表现出高度的糖酵解活动。Cantelmo等人报告称，肿瘤内皮细胞的糖酵解能力高于正常内皮细胞，表现为PFKFB3的高表达。因此，使用PFKFB3抑制剂的治疗概念已被扩展到败血症患者。此外，靶向内皮细胞的糖酵解可以预防炎症期间的病理性血管生成。Wang等人指出，3-(3pyridinyl)-1-(4-pyridinyl)-2-propen-1-one (3PO) 处理通过抑制血管炎症保护小鼠免受急性肺损伤的影响。一类新的3PO衍生物已经被合成以提高其抗血管生成特性。例如，PFK158是一种小分子PFKFB3抑制剂，它可以在小鼠小细胞肺癌模型中抑制ATP的产生和细胞增殖。此外，phenoxyindole 44表现出对PFKFB3的高度选择性，而非对PFKFB1和PFKFB2同工酶的选择性。7.3 维持ROS生成与清除的平衡
在败血症期间，ROS的生成与清除之间的不平衡是导致内皮细胞功能障碍的主要机制之一。Glutathione (GSH) 或其前体N-acetylcysteine (NAC) 显著减少了暴露于败血性休克患者血浆中的内皮细胞的死亡率和ROS生成。一些临床试验表明，使用NAC治疗的患者在ICU中的住院时间缩短，败血症的严重程度评分有所改善。除了清除ROS外，NAC还被证明可以在细菌感染过程中抑制NET的形成，这可能更好地解释了ICU中患者住院时间的缩短和严重程度评分的改善。Albumin具有与其巯基相关的抗氧化作用。Meziani等人在败血性休克的大鼠模型中使用了human serum albumin (HSA)。作者证明，接受HSA治疗的动物显示出ROS和RNS生成的减少。HSA减少了循环和组织中的O2−生成，进一步防止了内皮细胞功能障碍。事实上，O2−的减少导致其与NO的相互作用减少，从而抑制ONOO−的生成。此外，HSA抑制了NF-κB信号的激活，从而减少了主动脉中的硝化应激和氧化应激。最后，vitamin C因其抗氧化作用而被用于败血症患者中。在清除ROS和RNS后，vitamin C被氧化为抗坏血酸自由基。抗坏血酸通过抑制NOX激活、抑制iNOS表达并增强NO的生物利用度，进一步抑制了ROS和RNS的生成。不幸的是，一项临床试验显示，与安慰剂相比，vitamin C的输注并未改善器官功能障碍评分，也未改变血管损伤和炎症的标志物。8 结论与展望
在败血症中，neutrophils和NETs构成了强大的抗微生物防御机制。然而，过度的中性粒细胞激活和NET的释放会使内皮细胞从抗炎、抗凝的表型转变为促炎、促凝的表型。此外，NETs还会降解glycocalyx并增加内皮的通透性，导致内皮屏障的不稳定性，进一步加速败血症的进展。到目前为止，已经提出了几种潜在的针对内皮细胞功能障碍的治疗靶点。尽管人们越来越认识到过度NET释放可能是一个重要的治疗靶点，但研究结果尚不一致。大多数NET形成抑制剂仍处于临床前阶段，仍需进一步的临床试验。抗糖酵解治疗主要用于抑制肿瘤生长，而在败血症患者中使用的治疗剂量和时间尚需进一步研究。值得注意的是，糖酵解中的关键酶，如hexokinase、phosphofructokinase-1和pyruvate kinase，也可能成为新的、有前景的治疗靶点。原文网址：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/ctm2.1170
