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题目
动态别构调节驱动自分泌和旁分泌TGF-β信号传导
要点：
小鼠在仅具有自分泌但无旁分泌TGF-β1信号传导的情况下仍能存活
αvβ8的结合激活L-TGF-β1的自分泌信号传导，而无需其释放
构象熵的重新分布驱动了αvβ8对L-TGF-β的别构激活
通过稳定柔性结构域，可以操控熵重新分布的方向
摘要
TGF-β在发育和免疫中至关重要，以非共价结合其前体结构域的潜伏复合物（L-TGF-β）形式表达，并通过与GARP的共价结合呈现在免疫细胞表面。通常认为，成熟的TGF-β必须从L-TGF-β1中解离才能发生信号传导。我们之前的研究发现，通过αvβ8介导的TGF-β自分泌信号传导可以在TGF-β1未从其潜伏形式释放的情况下发生。在本研究中，我们展示了经过基因工程改造的无法从L-TGF-β1中释放TGF-β1的小鼠，与TGF-β1缺乏的小鼠不同，它们能够在没有早期致命性组织炎症的情况下存活。通过结合冷冻电子显微镜与基于细胞的实验，我们揭示了一种无需释放的TGF-β1自分泌信号传导的动态别构机制，αvβ8结合通过重新分配L-TGF-β1的内在柔性，使TGF-β1暴露于其受体。动态别构机制解释了TGF-β3的潜伏/激活机制，以及为何TGF-β3的功能与TGF-β1不同，表明这一机制可能广泛适用于其他柔性细胞表面受体/配体系统。关键词：TGF-β1；TGF-β3；潜伏期；激活；Furin；TGF-β信号传导；αvβ8整合素；动态别构调节；调节性T细胞；单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）；自分泌信号传导；旁分泌信号传导；熵重新分配
1. 引言
转化生长因子-β（TGF-β）是一种多功能细胞因子，在发育、免疫、癌症和纤维化中发挥关键作用。TGF-β有三种不同的基因产物（TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3），它们都以失活（潜伏）形式表达（L-TGF-β），激活对于其功能至关重要。目前，大多数针对TGF-β的治疗策略并未专注于特定的潜伏期和/或激活机制，而是对TGF-β信号传导进行全局抑制，导致显著的毒性。对潜伏和激活机制的深入理解可能有助于开发更好的针对TGF-β的治疗方法。成熟TGF-β的潜伏性由其在生物合成过程中通过Furin裂解的N端前体结构域的非共价结合决定。前体结构域围绕成熟的TGF-β同源二聚体，形成环状二硫键连接的同源二聚体（潜伏相关肽[LAP]），从而形成L-TGF-β。LAP具有四个主要功能：（1）通过束缚域的套索环将成熟的TGF-β与其受体隔离，从而赋予其潜伏性；（2）通过与TGF-β环境分子（如GARP）的结合，将L-TGF-β定位于细胞外基质或细胞表面，稳定并通过共价键将其连接到细胞表面；（3）促进正确折叠并提高分泌效率；（4）与关键的激活蛋白，尤其是整合素结合。活化的成熟TGF-β是二硫键连接的同源二聚体，其在TGF-β受体（TGF-βR）结合域中高度保守，尤其是成熟的TGF-β1和TGF-β3，与TGF-β受体（TGF-βR1/TGF-βR2）的结合亲和力相似。尽管这些结构域保守，但缺乏TGF-β1或TGF-β3的小鼠表现出不同的表型，这可能是由于TGF-β1和TGF-β3的LAPs之间的低同源性所致。值得注意的是，TGF-β1和TGF-β3的LAP都包含整合素结合基序RGDLXXL/I，并且可以与两种整合素（αvβ6和αvβ8）结合，这两者共同构成了TGF-β1和部分TGF-β3功能的大部分。整合素的结合最终导致TGF-β的激活，进而通过机制尚不明确的自分泌或旁分泌途径进行TGF-β信号传导。整合素αvβ6和αvβ8在结构和序列上的差异表明它们激活TGF-β的机制不同，可能导致TGF-β在特定背景下的功能有所区别。对于αvβ6，整体构象变化将来自肌动蛋白细胞骨架的力传递至L-TGF-β，破坏LAP（潜伏相关肽），释放成熟的TGF-β以进行旁分泌信号传导。该机制依赖于保守的β6亚基胞质结构域，它与肌动蛋白细胞骨架结合。然而，通过αvβ8介导的TGF-β1激活释放的成熟TGF-β1很难检测到，表明旁分泌TGF-β1信号传导效率较低。相应地，αvβ8并不会经历整体构象变化，也不依赖于肌动蛋白细胞骨架的力生成，因为β8的胞质结构域并不参与激活，也不与肌动蛋白结合。我们的前期研究表明，αvβ8结合会引发L-TGF-β1束缚域的柔性，我们提出假设：通过与αvβ8结合产生的柔性足以暴露成熟的TGF-β1，使其无需从潜伏复合物中释放即可与TGF-β受体结合并启动自分泌信号。然而，仍不清楚在没有机械力的情况下，αvβ8结合如何促使L-TGF-β产生柔性，特别是在L-TGF-β通过GARP结合而稳定的情况下，以及这种机制在生理上是否具有相关性。广泛认为TGF-β的释放和旁分泌信号传导是其功能所必需的。在本研究中，我们首先验证了没有TGF-β1释放的自分泌信号传导在生理上具有相关性。我们通过基因工程改造小鼠，使其全身只表达不能释放TGF-β1的突变型tgfb1。这些小鼠的TGF-β信号传导仍保持完整，它们可以存活、繁殖，并避免了因TGF-β1缺乏引发的早期致命性组织炎症，证明成熟的TGF-β1在结合其潜伏复合物时可以被激活、与其受体结合并启动信号传导。接着，我们探究了无需释放TGF-β1即可与TGF-β受体结合的机制。我们提出了一个动态别构模型，即当L-TGF-β与αvβ8结合时，L-TGF-β在RGD结合区域周围的局部构象熵减少，同时远端区域（包括L-TGF-β/GARP）的构象熵增加，暴露出成熟的TGF-β，使其能够与受体结合而无需释放。为了支持这一模型，我们解析了L-TGF-β3/GARP的结构，显示L-TGF-β1和L-TGF-β3的基础构象熵水平不仅决定了整合素非依赖性的TGF-β激活的基础水平，还决定了驱动整合素依赖性TGF-β激活的熵。与L-TGF-β1相比，L-TGF-β3中整合素介导的熵变化更高，导致成熟的TGF-β3的旁分泌释放，但不会发生在TGF-β1中，这表明TGF-β亚型在自分泌和旁分泌信号传导中的机制存在差异。此外，通过稳定αvβ8/L-TGF-β/GARP的不同柔性结构域，可以操控熵重新分布的方向。总体而言，我们的结构和细胞实验揭示了基于蛋白质动力学的别构机制，通过在蛋白质复合体的长距离上重新分配构象熵，决定了自分泌和旁分泌TGF-β功能，而这一机制是独立于肌动蛋白细胞骨架的力量的。这些结果推动了对TGF-β家族成员潜伏期和激活机制的理解，为通过柔性细胞表面蛋白介导的信号传播的结构理解提供了路线图。2. 结果
2.1 未释放的自分泌TGF-β1信号传导防止由全身TGF-β1缺乏引起的致命性组织炎症
TGF-β通过自分泌和旁分泌机制进行信号传导（图1A）。TGF-β1缺乏的小鼠缺乏来自所有细胞的自分泌和旁分泌TGF-β1信号，并在早期因广泛的组织炎症而死亡（图1B）。这种现象与T细胞中的TGF-β信号传导有关，因为当T细胞中的TGF-β受体被删除时，也会出现相同的表型。T细胞主要接收自分泌还是旁分泌TGF-β1信号目前尚不明确。我们的近期结构和细胞研究表明，TGF-β1的释放对于自分泌TGF-β1信号传导并非必要。为了验证这一发现的生理学意义，我们设计了一个带有TGF-β1中furin识别序列突变的小鼠模型（tgfb1R278A/R278A），该突变阻止TGF-β1从其潜伏复合物（LAP）中裂解，从而只能进行自分泌信号传导，而无法进行旁分泌信号传导（图1C–1F和图S2）。我们假设如果未释放的成熟TGF-β1能够有效结合TGF-β受体并诱导自分泌信号，那么这些突变小鼠将避免因TGF-β1缺乏而引发的早期致命性组织炎症。Tgfb1−/− 小鼠在10至14天内开始表现出消瘦症状，并在24天内死亡（图1G和1H）。相反，tgfb1R278A/R278A 小鼠在240天内（截至本文提交时）与tgfb1R278A/WT和野生型（WT）同窝小鼠表型无异，显示出相似的出生后存活率和体重增加（图1H–1J）。鉴于母体内分泌的TGF-β1通过胎盘在胚胎发育期间以及出生后通过母乳提供给幼鼠，这在遗传研究中对TGF-β1的作用研究造成了困扰。母体来源的TGF-β1在一定程度上补偿了胎儿TGF-β1的缺乏，使得tgfb1−/− 小鼠能够存活至断奶期，但随后死于自身免疫病。当母体TGF-β1缺乏时，tgfb1−/− 小鼠在出生后立即死亡。我们的研究表明，母体来源的TGF-β1裂解物对于生存并非必要，因为从纯合tgfb1R278A/R278A 母鼠中出生的小鼠显示出与从杂合母鼠出生的小鼠相似的存活率、体重增加及表型（图1J；视频S1）。tgfb1R278A/R278A 小鼠的器官在组织学上与WT和tgfb1R278A/WT 小鼠无异，而tgfb1−/− 小鼠的心脏、肝脏和肺部则表现出大量的免疫浸润（图1K和1L；表S1）。因此，自分泌TGF-β1信号传导无需TGF-β1释放即可拯救由TGF-β1缺乏引发的早期致命性组织炎症，并且TGF-β1的内分泌或旁分泌释放在此过程中并不涉及或必要。为了验证这些发现，我们进行了多个对照实验。我们证实tgfb1R278A/R278A 小鼠没有成熟TGF-β1裂解的证据（图1M和1N），并且发现非裂解的TGF-β1在WT小鼠器官和CD4+ T细胞裂解物中大量表达（图1M和1N），且在WT CD4+ T细胞表面易于检测，表明在WT小鼠中也可能存在未释放的自分泌TGF-β1信号传导（图1O）。我们确认非裂解的TGF-β1能够诱导足够的TGF-β信号传导（图1P），以在体外（图1Q–1S）和体内（图1T–1V）生成免疫抑制性调节性T细胞（Tregs）。综上所述，我们的研究支持了自分泌TGF-β1信号传导在无需释放成熟TGF-β的情况下具有生理学相关性。![]()
图1：未释放的自分泌TGF-β1信号传导防止由全身TGF-β1缺乏引起的致命性组织炎症
(A–C)：自分泌和旁分泌TGF-β1信号传导的示意图。分别展示了野生型小鼠（WT/WT，A）、TGF-β1敲除小鼠（tgfb1−/−，KO/KO，B）和带有furin切割位点突变的敲入小鼠（KI/KI，C，即tgfbR278A/R278A）。插图显示了符号说明。KI/KI小鼠按照图S2A生成。
(D)：示意图显示了重组的目标tgfb1基因位于染色体7（GenBank: M13177.1）上的位置。
(E)：WT/WT、WT/KI和KI/KI小鼠的测序色谱图，相关序列显示在上方。
(F)：TGF-β1蛋白单体的示意图，标明LAP、furin切割位点、突变的R278A序列和成熟TGF-β1肽的位置。
(G)：KO/KO小鼠与同窝WT/KO对照小鼠在出生后第18天的体重比较。显示平均值和标准误（SEM）。*p < 0.05，Student’s t检验。
(H)：KI/KI、WT/KI和WT/WT小鼠可以存活至成年，而KO/KO小鼠因多器官炎症在24天内死亡。*p < 0.0001，Mantel-Cox分析组间比较。
(I)：KI/KI、WT/KI和WT/WT小鼠随时间的体重变化。
(J)：来自KI/KI或WT/KI母鼠的KI/KI小鼠随时间的体重变化。
(K)：器官组织学（心脏、肺、肝脏）的图像，显示WT/WT（左）、KI/KI（中）和KO/KO（右）小鼠的组织切片（n ≥ 5）。比例尺：30 μm。
(L)：KO/KO（n = 6）、WT/WT（n = 6）、WT/KI（n = 5）和KI/KI（n = 6）小鼠的疾病评分散点图，分别用填充圆圈、空圆圈、空方块和红色填充三角形表示。显示平均值和SEM。ANOVA后Tukey多重比较检验，*p < 0.0001。
(M)：使用等量的血浆或器官裂解物（肾脏、肝脏、肺或脾脏）在还原条件下进行抗成熟TGF-β1的免疫印迹分析，样本来自WT/WT、KO/KO或KI/KI小鼠。+或-表示相应的基因型。分子量标记位置（MWMs）在左侧，未切割和切割TGF-β1条带的预期位置在右侧（约50和12.5 kDa）。下方为使用抗肌动蛋白的免疫印迹作为蛋白质加载对照。
(N)：WT/WT或KI/KI小鼠的CD4+ T细胞分别在BSA或固定的αvβ8上培养。按照M中的方法检测成熟TGF-β1。上图：短曝光；中图：长曝光显示WT CD4+ T细胞中的成熟TGF-β1。下图：同一膜条被剥离后重新用抗肌动蛋白检测。显示了具有代表性的实验（n = 3）。
(O)：未裂解的TGF-β1存在于WT CD4+ T细胞表面。激活的WT小鼠CD4+ T细胞表面生物素化后捕获在链霉亲和素琼脂糖（SA）上，按照上述方法进行检测。下方为用抗Na+/K+ ATP酶检测的细胞膜标记物的免疫印迹。显示了具有代表性的3次实验的相似结果。
(P)：来自激活CD4+ T细胞的裂解物（N），显示（上图）αvβ8介导的TGF-β信号传导增加，通过抗磷酸化SMAD2/3（pSMAD2/3）检测。注意pSMAD2迁移速度略慢于pSMAD3，中图为总SMAD2/3，底图为肌动蛋白。显示了具有代表性的实验（n = 3）。
(Q)：诱导性Treg（iTreg）的生成示意图。
(R)：来自KI/KI小鼠和对照WT/WT（或WT/KI）小鼠的CD4+ T细胞在激活条件下培养于BSA（±重组TGF-β1作为阳性对照）或固定的αvβ8胞外结构域上。CD4+ T细胞用抗FoxP3和抗CD25染色，展示了代表性的四象限散点图。右上象限为FoxP3+、CD25+的Treg。
(S)：图表显示激活CD4+ T细胞中Treg的百分比。显示SEM。ns，无显著性差异。
(T)：来自KI/KI和年龄、同窝对照（WT/WT或WT/KI）的外周血单个核细胞（PBMCs）的代表性散点图，并按照R中的方法染色。
(U, V)：从成年小鼠PBMC（U，n = 9 WT/WT和WT/KI；n = 8 KI/KI）或脾脏（V，n = 6 WT/WT和WT/KI；n = 3 KI/KI）中枚举的Treg与KO/KO小鼠中减少的Treg百分比相比（见图S2）。显示SEM。ns，无显著性差异。*p < 0.05。
另见图S2和S8。
2.2 L-TGF-β1/GARP和αvβ8/L-TGF-β1/GARP复合物的结构
为了探讨TGF-β1无需释放即可结合TGF-β受体的机制，我们使用单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）研究L-TGF-β1/GARP（图2A和2B）以及αvβ8/L-TGF-β1/GARP复合物。通过将L-TGF-β1/GARP与重组的αvβ8胞外结构域按1:1摩尔比混合，我们获得了1:1和2:1的αvβ8:L-TGF-β1/GARP复合物，这一比例由质量光度法（图S3A）和单颗粒cryo-EM揭示（图2C–2G和图S3）。使用细胞TGF-β1激活检测，我们证明一个αvβ8足以从L-TGF-β1/GARP中激活TGF-β1以进行信号传导（图S3B）。因此，虽然我们确定了2:1（图S3E）和1:1的αvβ8:L-TGF-β1/GARP复合物结构，但我们重点分析了1:1复合物，获得了2.5 Å分辨率的结构（图2C和图S3E）。通过进一步的分类，我们分离出少量未结合的L-TGF-β1/GARP（占4.6%的颗粒，分辨率为3.4 Å，图2D）和αvβ8（占1.5%的颗粒，分辨率为4.5 Å，图2E），其余93.9%的颗粒为三聚体复合物，显示出多种不同构象（分辨率2.5–8.3 Å，图2F–2H）。此外，我们从纯化的L-TGF-β1/GARP样本中解析出3.0 Å分辨率的L-TGF-β1/GARP结构（图S3H）。![]()
图2 L-TGF-β1/GARP单独存在及与αvβ8结合的结构和构象灵活性
(A) L-TGF-β1二聚体的原子模型，A原型体中的结构域已上色并标注。
(B) L-TGF-β1/GARP构建的示意图。编号从信号肽后开始。标示了两个原型体及其各自的RGD基序或RGE突变、解析出的半胱氨酸、TGF-βR2结合位点和GARP跨膜截短。
(C) αvβ8/L-TGF-β1/GARP复合物的密度图，显示为两种阈值，低阈值为透明灰色，高阈值为实色。颜色代码：整合素αv为绿色，β8为蓝色。
(D, E) 从C的分类中确定的L-TGF-β1/GARP（D）和αvβ8（E）的密度图。
(F) αvβ8/L-TGF-β1/GARP的13个子类的密度图，按照从分辨率最佳到最差的L-TGF-β1/GARP排列。类3至类12的图以相同的两种阈值显示。L-TGF-β1的颜色方案与A中的示意图一致。每个密度图下方的百分比代表该类颗粒的比例。条形颜色与A中的相同，未解析的区域显示为白色。
(G) 从F中选出的五个类，展示了L-TGF-β1相对于αvβ8的运动。αvβ8和L-TGF-β1在密度图中的带状图任意着色。
(H) G中显示的子类的比较，说明了构象灵活性的增加（类3 vs. 类7），运动的程度和方向（类3 vs. 类5，类4 vs. 类6）。结构使用αv的β螺旋结构域进行对齐，显示L-TGF-β/GARP在αvβ8顶部的摇摆运动。
另见图S3。
总体而言，L-TGF-β1/GARP的cryo-EM结构与其晶体结构（PDB: 6GFF）基本一致，但我们发现了束缚域与L-TGF-β1对侧的臂域相连。在大多数结构中，分辨率足以解析侧链，从而建立可靠的原子模型（图3A，左）。从模型的真实空间精修中获得的密度图局部分辨率和个别残基的温度因子（B因子）一致（图3B和图S3E）。我们还对L-TGF-β1/GARP进行了1微秒的全原子分子动力学（MD）模拟，揭示了每个残基的均方根波动（RMSF）与B因子之间的明确相关性（图S4A）。RMSF衡量局部结构的灵活性和动态性，因此局部分辨率或B因子为特定区域的相对柔性提供了定量测量。结果显示，束缚域的一半（包括套索部分）比L-TGF-β1中另一部分的束缚域更加柔性（图3B，放大的上方视图与下方视图对比）。这些结果表明，在溶液中，束缚域与GARP接触的部分通过广泛的相互作用得以稳定，而暴露成熟的TGF-β1可能需要破坏这些广泛的相互作用。![]()
图3 L-TGF-β1/GARP与αvβ8结合后的空间熵重新分布
(A) L-TGF-β1/GARP（左）和αvβ8/L-TGF-β1/GARP（右，图2F中的class 1）的密度图，结合精细的原子模型。
(B, C) L-TGF-β1/GARP（B）和αvβ8/L-TGF-β1/GARP（C）的带状图。残基根据归一化的B因子着色，颜色范围由比例尺表示。两种放大视图分别显示套索环（上）和包含RGD的臂域（下）。B中虚线的环（下方）表示未解析的RGD环。
(D) L-TGF-β1的带状图，展示与αvβ8结合前后归一化的B因子变化，B因子降低的区域（绿色），增加的区域（红色）。与整合素结合的臂域稳定化（下虚线框，放大视图），而束缚域（包含套索，上虚线框，放大视图）和GARP变得更加柔性。
(E) 模型展示了复合物形成时的构象熵重新分布。不同区域用彩色虚线圈出。ΔS < 0，局部熵减少；ΔS > 0，局部熵增加；ΔS ≈ 0，局部熵无变化。带状图的模糊表示显示结构中的域柔性。
(F) L-TGF-β1/GARP/MHG8与αvβ8结合后的预测空间熵重新分布。标记命名与E相同。
(G, H) αvβ8/L-TGF-β1/GARP/MHG8密度图的两种不同视图（G）和与原子模型对接的视图（H）。L-TGF-β1/GARP/MHG8几乎完全解析，仅解析了整合素头部结构的很小一部分。
(I) L-TGF-β1/GARP与αvβ8fl-nd结合后的预测空间熵重新分布。
(J) 比较αvβ8tr和αvβ8fl-nd与L-TGF-β1/GARP复合体的重建局部分辨率。局部分辨率用相同的比例尺编码显示。两个密度图显示为两种密度阈值。
(K) αvβ8fl-nd/L-TGF-β1/GARP的带状图。残基根据归一化的B因子着色，颜色范围由比例尺表示。虚线框内的放大视图分别显示套索环（上）和包含RGD的臂域（下）。
(L) 带状图显示αvβ8fl-nd与αvβ8tr在与L-TGF-β1/GARP复合体中归一化B因子变化，B因子减少（绿色），增加（红色）。
(M) 可溶性αvβ8tr、αvβ8fl-nd和固定在细胞膜上的αvβ8tr与膜结合的L-TGF-β1/GARP结合时的预测熵重新分布。标记命名与E相同。假设在细胞膜中的锚定增加了L-TGF-β1/GARP的稳定性（1）。与αvβ8tr结合后，构象熵从L-TGF-β1的臂域向整合素αvβ8重新分布（2）。通过扣环和纳米盘重组的αvβ8fl的稳定性，构象熵主要向束缚域重新分布（3和4）。固定的αvβ8tr几乎完全将熵重新分布到束缚域，导致足够的柔性以有效激活TGF-β（5和6）。
(N) TMLC报告细胞中TGF-β激活实验设计的示意图，无αvβ8（1），无C末端限制的可溶性αvβ8tr（2）或带C末端限制的αvβ8tr（3），可溶性αvβ8fl-nd（4），或固定的αvβ8tr（5）或扣环αvβ8tr（6）。
(O) 使用如N中配置和编号的实验方案，分析可溶性和固定的αvβ8tr（带扣环和不带扣环）、αvβ8fl-nd和固定的αvβ8tr对TGF-β的激活。显示为平均值和标准误差（SEM）。
另见图S4。
2.3 αvβ8/L-TGF-β1/GARP的结构动态与诱导柔性
基于L-TGF-β1/GARP单独存在以及与αvβ8结合的结构，我们提出假设，整合素与L-TGF-β1/GARP的结合进一步诱导了GARP、L-TGF-β1或两者的柔性，导致L-TGF-β1/GARP界面及套索环的不稳定。在所有反映GARP/L-TGF-β1相对于αvβ8运动和柔性的快照中（图2F–2H和图S3C–S3E），靠近RGD结合环的结构域始终被解析，但L-TGF-β1/GARP其余部分的密度逐渐减弱（图2F）。尽管GARP仅在两个快照中被解析（图2F的类别1和2），但由于GARP与每个L-TGF-β1单体之间形成二硫键，GARP仍存在于所有L-TGF-β1颗粒中。通过聚焦分类、对齐和3D变异性分析（3DVA），揭示了L-TGF-β1/GARP相对于αvβ8的摇摆运动（图2G, 2H, S3F和S3G；视频S2）。除了摇摆运动外，随着运动范围的增加，我们还观察到从GARP到束缚域的密度逐渐消失（图2G, 2H和图S4B）。通过观察GARP和束缚域的摇摆和局部分辨率的逐步变化，排除了由于颗粒错位而导致密度消失的可能性，而是由柔性增加所致。因此，我们得出结论，GARP在重建中的消失是由于束缚域柔性的增加。在一个快照中（图2F和图3A右的类别1），GARP被很好地解析（包含了6.3%的分类颗粒），束缚域中的套索环在与αvβ8结合后变得更加柔性，使用局部分辨率和基于公共参考的归一化B因子变化进行了测量。同时，L-TGF-β1/GARP和αvβ8/L-TGF-β1/GARP结构中L-TGF-β1/GARP剩余部分的局部分辨率相当（图3B, 3C和图S3）。在这个解析度最佳的三聚体复合物结构中，L-TGF-β的臂域在与αvβ8结合后变得更加稳定，B因子降低了约15 Ų，但束缚域，包括套索环和GARP与成熟TGF-β的界面变得更加柔性，B因子增加了约15 Ų（图3D）。因此，TGF-β/GARP界面的不稳定性导致L-TGF-β1/GARP在重建中的逐步消失，这也体现在B因子的逐步增加中（图2F类别3到8，图S4C和图S4D）。因此，αvβ8的结合不仅稳定了RGD环和与整合素结合的臂域，还别构性地在L-TGF-β1环的远端区域（特别是套索环和束缚域）诱导了更多的柔性。这些发现表明，这种诱导的柔性有助于激活TGF-β1（图3D和图3E）。2.4 空间构象熵重新分布驱动αvβ8介导的L-TGF-β激活
是什么驱动了TGF-β1的别构激活？L-TGF-β1/GARP与αvβ8/L-TGF-β1/GARP之间的变化不符合“经典别构”模型，即通过稳定结构的逐步构象变化引发“多米诺效应”。在解析度最佳的结构中（图3A, 类别1），L-TGF-β1在与整合素结合后的整体构象变化非常小（GARP的均方根偏差[RMSD]为1.3 Å，3950对原子；L-TGF-β1非整合素结合亚单位A：RMSD 1.9 Å，2496对原子；L-TGF-β1整合素结合亚单位B：RMSD 2.0 Å，2398对原子）。相反，我们观察到重建图中的局部分辨率和精细结构中的每个残基的B因子发生了明显变化（图3A–3D）。事实上，构象柔性，而不是一系列离散的构象变化，被认为是驱动动态别构的动力。从热力学角度审视别构，可以将“经典”和“动态”别构联系起来，任何对蛋白质的改变都会通过熵和焓影响自由能。假设动态别构通过熵的贡献对自由能产生影响。根据玻尔兹曼方程，S = kB ln(W)，其中S为熵，kB为玻尔兹曼常数，W表示微观态的数量，构象动态性越高，构象熵越高。当蛋白质结合小分子、肽或DNA时，往往会发生构象熵重新分布，即在结合位点的构象熵减少，而在远端区域的构象熵增加。空间构象熵重新分布解释了动态别构。应用这一概念解释L-TGF-β1的动态别构激活，我们的结果提出了一个假设：当与αvβ8结合时，L-TGF-β1/GARP的构象熵从αvβ8结合位点重新分布到L-TGF-β的束缚域，从而别构性地暴露成熟的TGF-β，进而与TGF-βR结合，启动信号传导。我们设计了额外的实验来测试这一动态别构假设。首先，我们测试了在αvβ8/L-TGF-β1/GARP中稳定L-TGF-β/GARP界面是否会改变构象熵重新分布的方向。通过使用抑制性Fab MHG8，该抗体结合并稳定L-TGF-β1/GARP界面，我们解析了αvβ8/L-TGF-β1/GARP/MHG8的结构。结果发现，L-TGF-β1束缚域，包括LAP环和整合素结合位点，得到了很好解析，但大部分的αvβ8（包括头部结构域）未被解析，确认了构象熵重新分布至整合素的现象。接下来，我们进一步测试了通过稳定柔性区域是否能够改变构象熵重新分布的方向。我们解析了L-TGF-β1/GARP与全长αvβ8（αvβ8fl）结合的冷冻电镜重构，该αvβ8fl通过纳米盘重构约束其原本柔性的下腿。与截短的αvβ8（αvβ8tr）相比，这种重构中αvβ8的下腿得到了更好的解析，但L-TGF-β1/GARP的局部分辨率较差，B因子更高。这些结果表明，αvβ8/L-TGF-β1/GARP中的构象柔性区域作为熵的储库，可以通过调节或操控来改变熵重新分布的方向。为了进一步验证构象熵重新分布方向性的假设，我们将L-TGF-β1/GARP锚定在细胞膜中，并允许其与不同程度约束的αvβ8结合。在这种系统中，L-TGF-β1/GARP表达于转化的水貂肺上皮TGF-β响应报告细胞（TMLC）的细胞膜上，并允许与空的纳米盘（作为对照）或不同形式的αvβ8结合。预测膜约束会将L-TGF-β1/GARP的熵重新分布至αvβ8，导致TGF-β1激活效率较低。随着对αvβ8约束的增加，TGF-β1的激活效率也随之增加。结果显示，不受约束的可溶性αvβ8tr不能有效诱导TGF-β信号传导。相比之下，带C末端扣环的可溶性αvβ8tr或αvβ8fl-nd更有效地激活了TGF-β信号传导。而全球固定的C末端扣环或不带扣环的αvβ8tr具有最高的激活效率。在此实验配置中，未施加来自肌动蛋白细胞骨架的机械力，因此，αvβ8依赖的TGF-β激活机制支持动态别构。实验结果支持了构象熵重新分布不仅足够，而且是驱动αvβ8介导L-TGF-β激活的主要机制的假设。2.5 L-TGF-β3和L-TGF-β3/GARP的内在和诱导柔性
GARP呈递的L-TGF-β3在发育过程中至关重要，并可能在出生后免疫抑制中发挥作用。因此，我们进一步研究了单独存在的L-TGF-β3和由GARP呈递的L-TGF-β3的结构及其αvβ8介导的激活。我们采用与L-TGF-β1相似的策略，纯化了重组L-TGF-β3和L-TGF-β3/GARP复合物（图4A）。单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）研究提供了L-TGF-β3/GARP（2.9 Å，图4B和图S5A）的结构，与L-TGF-β1/GARP（3.0 Å）结构相当。两者接触GARP的束缚域部分几乎完全相同（图4C和图S5B–S5D）。然而，通过B因子比较，L-TGF-β3在其他所有区域（特别是包含整合素结合位点的臂域以及束缚域中的套索环部分）比L-TGF-β1更加柔性。这种内在柔性的增加表明L-TGF-β3受到的约束较少，且具有较高的基础熵。我们假设，基础熵的增加有助于即使在不与αvβ8结合的情况下，成熟的TGF-β3也能暴露给其受体。整合素结合后，进一步的熵扰动可能会导致成熟的TGF-β3从其潜伏复合物中释放出来。为了验证这一假设，我们解析了αvβ8/L-TGF-β3（2.7 Å）和αvβ8/L-TGF-β3/GARP（约4.9–7.2 Å）的结构，使用了furin切割位点突变（R277A）的L-TGF-β3构建体，以确保成熟的TGF-β3仍然与潜伏复合物相结合。尽管αvβ8/L-TGF-β3/GARP稳定形成，且αvβ8的密度得到了很好的解析，但L-TGF-β3仅有一小部分得到解析，GARP没有解析。为了简化结构分析，我们重点研究了不带GARP的αvβ8/L-TGF-β3。进一步分类显示，L-TGF-β3在αvβ8顶部的摇摆范围比αvβ8结合的L-TGF-β1大得多。总体而言，αvβ8/L-TGF-β3和αvβ8/L-TGF-β3/GARP的结构研究揭示了类似但更剧烈的构象熵重新分布，表明L-TGF-β3的内在柔性在与αvβ8结合后进一步增强，类似于L-TGF-β1/GARP中的构象熵重新分布机制。![]()
图4 L-TGF-β3/GARP的内在柔性导致TGF-β3的高基础活性
(A) L-TGF-β3/GARP构建体的示意图，所有结构域均已注释并按照图2A中的颜色标记。
(B) 左图：L-TGF-β3/GARP的密度图，结构域按A中的颜色标记。条形图的颜色按照A中的标准，未解析的区域显示为白色。右图：相同的密度图（透明）内展示了L-TGF-β3/GARP的带状图。
(C) L-TGF-β1/GARP（透明灰色）和L-TGF-β3/GARP（彩色实面）的地图对比，显示L-TGF-β3/GARP的臂域比L-TGF-β1/GARP更柔性。
(D) L-TGF-β3的带状图，残基按归一化的B因子着色，颜色范围由比例尺表示。虚线框内的两个放大视图分别展示了套索环（上方）和包含RGD的臂域（下方）。
(E) L-TGF-β1/GARP和L-TGF-β3/GARP的共识模型，每个Cα用球体表示，并根据L-TGF-β1/GARP和L-TGF-β3/GARP之间的归一化B因子差异着色。注意，整个L-TGF-β3的B因子，特别是束缚域（上方虚线框）和臂域（下方虚线框），比L-TGF-β1/GARP高得多（约50 Ų），表明GARP呈递的L-TGF-β3比L-TGF-β1更柔性。
(F) 质量光度直方图：峰值对应于单独的L-TGF-β3/GARP或αvβ8（约190 kDa），L-TGF-β3/GARP与一个（约390 kDa）或两个αvβ8整合素结合（约590 kDa）。
(G) L-TGF-β3/GARP与一个αvβ8结合的密度图，显示为两种阈值。L-TGF-β3/GARP的主要部分消失，表明在与αvβ8结合后其柔性大幅增加。
(H) 由所有与一个αvβ8结合的L-TGF-β3颗粒重建的密度图，显示为两种阈值。
(I) 上排：H中所有颗粒的3D分类，显示了与αvβ8结合的L-TGF-β3的柔性。下排：αvβ8和L-TGF-β3的拟合原子模型，插入到上排对应的地图中。
(J) 机制模型示意图：L-TGF-β3/GARP的内在柔性（左）与αvβ8诱导的柔性（右）。
另见图S5。
这提出了一个假设：束缚域/套索的柔性有一个阈值，达到此阈值后成熟的TGF-β可以暴露于其受体，而无需释放。如果是这样，GARP呈递的L-TGF-β3的内在柔性增加允许成熟的TGF-β3暴露于其受体，甚至无需整合素结合即可进行基础激活。为了验证这一点，我们在TMLC报告细胞中表达L-TGF-β3/GARP并测量TGF-β的激活，发现其基础TGF-β活性显著高于L-TGF-β1/GARP，后者无基础活性。如果束缚域/套索的柔性确实有一个阈值，较高的诱导柔性可能足以在αvβ8结合后释放成熟的TGF-β3。确实，在固定的αvβ8上培养的L-TGF-β3/GARP TMLC细胞的上清液中检测到大量释放的TGF-β，而L-TGF-β1/GARP TMLC细胞则没有检测到释放的TGF-β。为什么成熟的TGF-β3而非TGF-β1会从其潜伏复合物中释放？这一现象可以通过套索环的内在柔性差异来解释。L-TGF-β3的套索环不仅比L-TGF-β1短，而且在与成熟TGF-β相互作用的关键残基上保守性较低。我们假设L-TGF-β3的套索环进化得更加柔性，因而对成熟TGF-β3的覆盖较少，允许L-TGF-β3的基础活性更高。为了验证这一假设，我们将TGF-β3的套索环置换到TGF-β1中（L-TGF-β1_lasso3），观察到TGF-β1的基础激活显著增加，但未达到野生型L-TGF-β3的水平。综上所述，我们得出结论，臂域、束缚域和套索环的构象熵水平，以及套索环的结构，是维持潜伏期、暴露或释放成熟TGF-β的关键因素。![]()
图5 αvβ8与L-TGF-β3结合足以释放成熟的TGF-β3
(A) TGF-β激活实验的示意图，TMLC细胞被转染并分类以在细胞表面表达等量的L-TGF-β1/GARP或L-TGF-β3/GARP，并在BSA或αvβ8涂层的孔中培养。
(B) 表达L-TGF-β1/GARP（紫色方块）或L-TGF-β3/GARP（紫色倒三角形）的TMLC细胞在所示基质上培养过夜，随后检测荧光素酶活性，报告为相对光单位（RLUs）的发光量。显示的是平均值和标准误（SEM）。*p < 0.01，使用单因素ANOVA和Tukey事后检验。
(C) TGF-β激活实验示意图，显示将培养上清液（L-TGF-β1/GARP [黄色方块]或L-TGF-β3/GARP [黄色倒三角形]）应用于野生型（WT）TMLC细胞以检测释放的TGF-β。
(D) 按照C中格式进行过夜培养后检测荧光素酶活性。结果（C和D）以活性TGF-β（ng/mL）表示。显示的是平均值和标准误（SEM）。*p < 0.001，使用单因素ANOVA和Tukey事后检验。
(E) 上图：L-TGF-β1和L-TGF-β3套索环的带状模型和过滤密度图。套索环的脯氨酸残基被标记为标记点。中图：带状模型下方显示序列位置和物种保守性（较大字体表示更高的保守性）。下图：L-TGF-β1和L-TGF-β3模型的叠加图，展示套索3未能像套索1那样有效覆盖成熟TGF-β的TGF-βR2结合位点。
(F) 显示L-TGF-β1、L-TGF-β3以及套索交换的L-TGF-β1（L-TGF-β1_lasso3嵌合体）套索区域的序列比对。
(G) 套索3域使L-TGF-β1/GARP不稳定化。上图：示意图。下图：TMLC细胞稳定表达GARP，转染编码L-TGF-β1（紫色方块）、L-TGF-β3（紫色倒三角形）或带有套索3的L-TGF-β1交换体（TGF-β1_lasso3嵌合体，绿色倒三角形）的构建体，并分类为等量表达。WT TMLC细胞（黄色圆圈）或表达L-TGF-β/GARP的细胞系培养过夜，随后报告荧光素酶活性，显示为相对光单位（RLU）的发光量。显示的是平均值和标准误（SEM）。*p < 0.05，****p < 0.0001，使用单因素ANOVA和Sidak多重比较检验。
另见图S6。
2.6 TGF-β从αvβ8介导的L-TGF-β激活中释放的功能后果
在体内αvβ8介导的TGF-β激活发生的生理条件下，αvβ8由一个细胞呈递，而L-TGF-β呈现在接触细胞的表面。在这种情况下，如果TGF-β被释放（旁分泌），则αvβ8介导的TGF-β激活可能导致双向信号传导；如果TGF-β未被释放（自分泌），则只会在呈递TGF-β的免疫细胞上引发单向信号传导。为了测试这种αvβ8介导的定向TGF-β激活是否发生，我们设计了一个体外共培养模型系统，其中TGF-β1缺失的胚胎成纤维细胞（MFB-F11）稳定表达TGF-β响应的分泌性碱性磷酸酶（SEAP）报告构建体，而TMLC细胞在表面表达TGF-β（图6A–6C）。MFB-F11报告细胞对外源性TGF-β高度敏感，表明其具有完整的TGF-β受体（TGF-βR）和下游信号传导系统。当与表达L-TGF-β1/GARP的TMLC TGF-β报告细胞共同培养时，SEAP在细胞上清液中报告来自αvβ8表达细胞的TGF-β信号，而细胞裂解液中测得的荧光素酶报告来自L-TGF-β1/GARP TMLC细胞的TGF-β信号（图6A–6C）。由于MFB-F11细胞缺乏TGF-β，系统中唯一的TGF-β1细胞来源是来自表达L-TGF-β1/GARP的TMLC TGF-β报告细胞。当将αvβ8表达的MFB-F11报告细胞与L-TGF-β1/GARP表达的TMLC报告细胞共同培养时，结果只检测到自分泌信号，因为只检测到了荧光素酶信号（图6A–6C）。这种自分泌信号的独占性可以归因于L-TGF-β1的束缚域和套索环的柔性不足，无法释放成熟的TGF-β1，但在潜伏环内足够暴露以在αvβ8结合后与TGF-βR2结合。接下来的问题是，L-TGF-β3在αvβ8激活中的方向性是否与L-TGF-β1不同，因为在αvβ8结合后成熟的TGF-β3会被释放。确实，既观察到自分泌又观察到旁分泌TGF-β3信号，因为检测到荧光素酶和SEAP信号（图6D）。我们假设，与TGF-β1相比，L-TGF-β中的成熟TGF-β3对TGF-βR2的可及性更高，而TGF-βR2是与成熟TGF-β结合的第一个受体，从而启动信号传导。为了测试TGF-βR2是否在L-TGF-β复合物中与暴露的成熟TGF-β结合，我们对固定的αvβ8结合的L-TGF-β3或L-TGF-β1/GARP复合物进行了TGF-βR2结合实验。在这些系统中，成熟TGF-β和LAP之间的furin切割位点在与tgfb1R278A/R278A小鼠类似的位置被突变，因此成熟的TGF-β不能释放。与我们的结构分析和TGF-β激活实验一致，我们观察到当L-TGF-β3/GARP与固定的αvβ8结合时，TGF-βR2与其复合物的形成比与L-TGF-β1/GARP更为强健（图6E）。![]()
图6 L-TGF-β的内在及整合素诱导的熵决定信号传导的方向性
(A) 双TGF-β报告系统设计示意图。TMLC细胞（紫色）和MFB-F11细胞（红色）共培养（左）。显示了稳定表达的报告构建体，其中SMAD结合元件（SBE）驱动所示的报告蛋白（荧光素酶或分泌性碱性磷酸酶SEAP）。
(B) MFB-F11报告细胞稳定转导了整合素β8（ITGB8）表达构建体，并使用抗β8抗体对高表达αvβ8的细胞进行分类。直方图展示了ITGB8转染细胞（红色曲线）中表达的αvβ8，而未转染（NT）细胞中未见（黑色曲线）。
(C) αvβ8表达的MFB-F11细胞与L-TGF-β1/GARP呈递的TMLC细胞的混合是激活L-TGF-β1/GARP表达细胞上的TGF-β信号通路所必需且足够的，但不能激活αvβ8表达的细胞。L-TGF-β1(RGD)/GARP TMLC（实心方块），L-TGF-β1(RGE)/GARP TMLC（空心三角形，见图S3B）。结果（纵轴）标准化为TGF-β激活曲线。显示的是平均值和标准误（SEM）。*p < 0.01, ***p < 0.001，使用单因素ANOVA和Sidak多重比较检验。
(D) 上图：稳定表达GARP的TMLC细胞并共转染了野生型L-TGF-β1或L-TGF-β3 IRES GFP质粒。L-TGF-β1和L-TGF-β3的表面表达是等量的。下图：共培养野生型MFB-F11（−）或αvβ8转染的MFB-F11细胞（+）与野生型TMLC（黑色圆圈）、表达L-TGF-β1/GARP的TMLC（蓝色实心方块）或表达L-TGF-β3/GARP的TMLC（绿色三角形）。左图：即使在未与αvβ8表达的MFB-F11细胞共培养时，TMLC细胞中活性TGF-β3的基础水平显著，但与αvβ8表达的MFB-F11细胞共培养后进一步增加。右图：只有在与αvβ8表达的MFB-F11细胞共培养时，TMLC L-TGF-β3/GARP细胞的SEAP显著增加。结果显示为任意单位（a.u.）的平均值和SEM。**p < 0.01, ***p < 0.001，使用单因素ANOVA和Sidak多重比较检验，L-TGF-β3/GARP细胞在野生型MFB-F11或αvβ8表达MFB-F11细胞上的结果为配对t检验。
(E) TGF-βR2更高效地结合αvβ8结合的L-TGF-β3/GARP，而不是L-TGF-β1/GARP。上图：示意图显示了依次固定的αvβ8胞外结构域，L-TGF-β1或L-TGF-β3/GARP复合物的结合，TGF-βR2-Fc（小鼠Fc），以及抗小鼠辣根过氧化物酶（HRP）。下图：代表性实验（n = 3），显示了不同浓度的TGF-βR2-Fc，信号以450 nm的光密度（OD450）报告。
3. 讨论
3.1 TGF-β1不释放激活的生理作用
TGF-β1在哺乳动物生物学中具有重要作用，从胚胎植入到整个生命周期的各个阶段都发挥关键作用。传统观念认为，TGF-β的释放是自分泌和旁分泌功能所必需的。大量生化和结构实验进一步强化了这种观点。然而，我们之前的研究表明，αvβ8/L-TGF-β1可以使成熟的TGF-β1在不释放的情况下暴露并与其受体结合。通过本研究，我们提供了确凿证据，证明不释放的成熟TGF-β可以支持自分泌信号传导。在小鼠中，与LAP共价结合的成熟TGF-β1能够产生足够的信号以支持免疫功能，因为携带这种突变的小鼠已经存活了7个月，并且没有表现出全球TGF-β1缺失所导致的早期免疫缺陷。我们成功生成了来自tgfb1R278A/R278A同源纯合子杂交的后代，这些后代在发育至成体过程中完全缺乏母源TGF-β1。这一发现提供了决定性证据，表明成熟TGF-β1的旁分泌释放对于发育或早期免疫功能并不是必需的。我们的结果与之前的报告有所不同，后者发现T细胞中条件性删除furin的小鼠表现出器官炎症，与T细胞中条件性删除TGF-β1的小鼠类似。然而，furin可能切割数百种底物，且具有独立于TGF-β1的作用。缺乏TGF-β1的T细胞无法进行自分泌TGF-β1信号传导，而在tgfb1R278A/R278A小鼠中，自分泌TGF-β1信号传导得以保留。我们确认，自分泌TGF-β1信号传导无需释放即可防止自身免疫，不仅验证了基于结构的L-TGF-β激活机制的研究方法，还展示了冷冻电镜（cryo-EM）揭示柔性蛋白结构机制的强大功能。由构象熵重新分布驱动的L-TGF-β激活
构象熵重新分布的概念，即配体结合位点周围的熵减少，而远端部位的熵增加，最初来源于通过X射线晶体学或核磁共振（NMR）光谱学对相对较小蛋白质的结构进行的定量表征。通过单颗粒冷冻电镜技术，蛋白质的构象动力学与重建结构的局部分辨率相关联，能够探索更大、复杂系统中的构象熵重新分布现象。构象熵的重新分布还解释了从配体结合位点到远端部位的动态别构通信，而无需离散的稳定构象变化传播。
在本研究中，我们利用冷冻电镜技术研究了由整合素αvβ8/L-TGF-β/GARP组成的大型多组分蛋白质复合物的构象熵重新分布，这些复合物在我们的先前研究和当前研究中被证明是高度柔性的。通过表征整合素αvβ8结合引起的L-TGF-β/GARP不同区域构象柔性的变化，我们展示了构象熵重新分布是αvβ8介导的L-TGF-β激活的动态别构机制。具体来说，我们证明了L-TGF-β复合物的内在柔性（基础构象熵）控制了TGF-β的潜伏性。对于完全潜伏的L-TGF-β1，束缚域和套索环相对稳定，而部分潜伏的L-TGF-β3中相同的区域则更具柔性。αvβ8的结合稳定了L-TGF-β1和L-TGF-β3的臂域上的RGD环，并减少了局部构象熵。熵的空间重新分布增加了相应套索环的柔性。对于L-TGF-β1，较低的基础构象熵导致了较少的熵重新分布至套索域，尽管不足以释放成熟的TGF-β1，但足以使其暴露并与受体结合。在这种情况下，TGF-β被限制在自分泌信号传导中。相比之下，由于L-TGF-β3具有较高的基础构象熵，αvβ8的结合导致更多的熵重新分布至套索域，使得L-TGF-β3达到了足以释放成熟TGF-β3的柔性阈值。释放的TGF-β3能够进行自分泌和旁分泌信号传导，作用于αvβ8或L-TGF-β3/GARP呈递的细胞。![]()
图7 基于动态熵的TGF-β激活别构模型
(A) TGF-β1的内在和整合素诱导激活的示意图。
(1) L-TGF-β1/GARP的束缚域和套索环具有较低的基础熵，无法触发显著的信号传导。
(2) αvβ8结合后稳定了臂域，但重新分布了足够的熵，使成熟的TGF-β1暴露于TGF-β受体，触发信号传导。
(B) TGF-β3的内在和整合素诱导激活的示意图。
(3) L-TGF-β3/GARP在束缚域和套索环中具有较高的基础熵，足以使成熟的TGF-β3暴露于TGF-β受体，从而允许L-TGF-β3的自分泌信号传导。
(4) αvβ8结合后稳定了臂域，重新分布了熵，使成熟的TGF-β3暴露于TGF-β受体，足以释放成熟的TGF-β3，进行旁分泌信号传导，双向作用于L-TGF-β3呈递细胞和αvβ8表达细胞。
3.2 生理相关性：TGF-β3/GARP复合物激活中的动态别构调节
TGF-β3在腭发育（palatogenesis）中起关键作用，与TGF-β1不同，TGF-β3的缺失会导致腭裂。我们对αvβ8/L-TGF-β3/GARP复合物的结构和细胞实验结果可能具有重要的生理意义，因为GARP和TGF-β3在形成共价复合物后会共同定位于腭发育的关键区域。这两者在小鼠和人类中的基因缺陷均会导致腭裂。此外，人类的遗传性腭裂综合征常因TGFB3中的furin或RGD序列的错义突变引起。然而，在itgb8缺失的小鼠中，仅部分存活的小鼠表现出腭裂现象，表明L-TGF-β3的内在柔性和成熟TGF-β3的暴露可能为腭发育提供了足够的基础TGF-β信号，即便没有整合素αvβ8的结合。3.3 动态别构机制在大分子复合物中的广泛影响
我们在αvβ8/L-TGF-β1(-β3)/GARP模型系统中的研究表明，构象熵的重新分布是一种动态系统中别构调节的方式。蛋白质动力学通过Boltzmann方程量化为构象熵，表明蛋白质的功能可以通过动态别构机制被精细调节，而不需要明显的构象变化。虽然此前仅在小蛋白质的X射线晶体学和核磁共振（NMR）光谱研究中有少量此类动力学的例子，但我们在较大的αvβ8/L-TGF-β/GARP复合物中展示了功能调节（如激活）与蛋白质动力学的关联。这表明动态别构可能是普遍存在的机制，用于精确调节蛋白质功能。单颗粒冷冻电镜是研究大蛋白复合物构象动态的宝贵工具。结合其他技术，如氢-氘交换质谱（HDX-MS）或分子动力学模拟，预计构象熵重新分布驱动的动态别构调节将在更多的生物系统中发现其重要的机制作用。3.4 TGF-β超家族潜伏期中的内在构象熵
TGF-β的三个亚型以及TGF-β超家族中的其他成员（如GDF8和GDF11）被认为处于完全潜伏状态。然而，L-TGF-β3显示出较高的基础活性，这归因于其束缚域和套索环相对于TGF-β1而言具有更高的内在熵。我们提出，相对的内在构象熵是TGF-β超家族成员控制潜伏期的进化策略。正如L-TGF-β3的例子，潜伏期并非绝对的，而是由内在构象熵的水平决定的。对于那些非潜伏的TGF-β超家族成员（如BMP9、BMP10和激活素A），它们的束缚域和套索环显示出高度柔性，表明它们具有非常高的内在熵，使其生长因子在不需要释放的情况下能够自由暴露于受体。这支持了一种替代假设，即潜伏期是一个由束缚域内在熵水平控制的连续过程，当熵足够高时，受体可以结合暴露的生长因子受体结合域，而这些生长因子仍处于前体复合物中。相比之下，L-TGF-β1由于其较低的内在熵，似乎是TGF-β超家族中的一个例外。3.5治疗意义
传统的TGF-β激活理论是二元的：TGF-β要么处于潜伏状态，要么被激活。这种二元化的观点导致了针对释放的成熟TGF-β的治疗策略，但这些策略常伴随有效性和安全性问题。αvβ8/L-TGF-β/GARP的结构和柔性表明，L-TGF-β/GARP抗体结合位点非常柔性且不稳定，多种空间位阻限制了TGF-βR抑制剂或抗体对TGF-β或TGF-β受体的进入。我们观察到抗体抑制剂或TGF-βR捕捉剂对αvβ8介导的TGF-β激活的抑制效果不佳。因此，免疫肿瘤学领域中靶向旁分泌TGF-β释放的临床试验，由于缺乏疗效，结果令人失望。我们的研究揭示了TGF-β的功能为何在不同的环境下表现出高度依赖性。动态别构调节决定了TGF-β在何时何地被激活，是否作为自分泌因子信号传导，或是否作为旁分泌信号被释放。此机制决定了TGF-β主要向呈递TGF-β的细胞、整合素表达的细胞，还是附近或远处的细胞传递信号。因此，靶向TGF-β激活是非常复杂的，但这种复杂性也提供了机会，可以通过不同层面（如靶向基础熵、熵的重新分布或释放）来调节TGF-β的上下文依赖性激活。特别是，熵的重新分布可以被引导向不同方向，如我们的研究结果所示。如何在不同病理条件下靶向这种熵驱动的机制，尚需进一步研究。总体而言，我们的结果提供了一个结构框架，用于开发靶向TGF-β特定功能的治疗方法，并表明“一刀切”的治疗策略可能无法奏效。3.6 研究局限性
tgfb1R278A/R278A小鼠模型仍处于早期开发阶段，全面的免疫学表征尚在进行中。因此，我们无法排除随着小鼠年龄增长，由于缺乏旁分泌释放的成熟TGF-β1而导致组织炎症的延迟效应。尽管我们提供了理解动态别构机制的概念框架，但我们对构象熵重新分布的描述仅是部分定量的。要对大规模构象熵重新分布进行更全面的定量描述，需要对现有方法进行重大改进。原文链接
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(24)00965-6
