文献：Li S, Shao R, Li S, Zhao J, Deng Q, Li P, Wei Z, Xu S, Chen L, Li B, Zou W, Zhang Z. A monoallelic variant in CCN2 causes an autosomal dominant spondyloepimetaphyseal dysplasia with low bone mass. Bone Res. 2024 Oct 16;12(1):60. doi: 10.1038/s41413-024-00364-2. PMID: 39414788.
杂志：Bone Research
细胞通信网络因子2（CCN2）是一种分泌的细胞外基质相关蛋白，其异常增高的表达与纤维化、慢性炎症或组织损伤等多种病理过程相关，因而被评估为多种疾病的治疗靶点。然而，CCN2缺失相关的人类表型仍不明朗；至今尚未发现与CCN2变异相关的人类表型。本研究收集了被诊断为脊椎骨软骨发育不良（SEMD）的家庭，并使用下一代测序对无已知遗传原因的候选致病基因进行了筛查。我们在14名表现出不同程度矮小、早发性骨关节炎和骨质疏松的患者中发现了CCN2信号肽中的单等位基因变异（NM_001901.2: c.65 G > C [p.Arg22Pro]），该变异被确定为SEMD的致因。受影响个体的血清CCN2水平降低。携带该变异的细胞系在培养基中CCN2蛋白量减少，且细胞内保留增加，表明蛋白分泌受损。此外，该变异减弱了CCN2对骨髓间充质干细胞成骨作用的刺激效应。斑马鱼ccn2a敲除模型和骨母细胞谱系特异性Ccn2缺失小鼠（Ccn2fl/fl;Prx1Cre）部分重现了受影响个体中观察到的低骨量表型。Ccn2fl/fl;Prx1Cre小鼠的病理机制涉及骨生成减少、骨吸收增加和生长板形成异常。综上所述，我们的研究表明，CCN2的单等位基因变异导致人类遗传性骨骼发育不良，并强调CCN2在人体成骨中的关键作用。骨骼发育不良是一类主要影响肌肉骨骼系统的人类遗传疾病，其中脊椎骨软骨发育不良（SEMD）是最复杂的亚型之一，涵盖了临床和遗传上异质的疾病，特征为椎骨、骨骺和骨干的异常。SEMD通常表现为骨畸形和早发性骨关节炎。在一些情况下，SEMD作为综合征的一部分，可能伴随有智力迟缓、肌肉张力低、毛发稀疏、近视和萎缩性瘢痕等额外症状。目前已描述了包括Strudwick型、Aggrecan型、Matrilin型、Missouri型和短肢-异常钙化型在内的20多个SEMD亚型，具有不同的遗传方式。至今尚未发现SEMD的共同分子通路，但大多数已知的致病基因编码的蛋白质都是细胞外基质（ECM）的组成部分，或参与ECM代谢过程。在这些情况下，致病基因中的变异可能导致蛋白质对ECM的异常影响、蛋白质分泌减少或因错误折叠的蛋白质引起的内质网应激，进而导致ECM结构框架或维持骨骼生长和稳态所需的生物信号的缺陷。尽管在SEMD的遗传研究中取得了显著进展，但遗传异质性以及多名受影响家庭的缺乏，阻碍了新遗传原因的识别，从而影响了临床实践中对许多受影响家庭的分子诊断和遗传咨询。细胞通信网络因子2（CCN2），也称为结缔组织生长因子，是已知的基质细胞蛋白之一，这类非结构性蛋白在细胞外基质中存在，并主要发挥调节作用。CCN2最初被发现对成纤维细胞样细胞具有增殖和趋化作用，早期研究主要集中在其在纤维化疾病中的病理意义。近年来，从动物模型和人类患者中获得的证据表明，CCN2的异常与多种疾病相关，包括糖尿病肾病、视网膜病、癌症发生和肿瘤发展、动脉粥样硬化以及关节炎，这些疾病大多与慢性炎症或组织损伤的病理过程相关。新兴研究将CCN2视为这些疾病的有希望的诊断或预后标志物。此外，针对CCN2的一些药物（如FG-3019、OLX-10010、EXC-001）的潜在治疗效果和安全性已在多种疾病中评估，临床试验结果颇为鼓舞人心。除了在病理状况中的作用外，CCN2还具有多种生理功能，参与中枢神经系统发育、脊髓再生和伤口愈合等。尽管CCN2在病理和生理状态中具有许多关键功能，但与CCN2缺失相关的人类表型仍未得到阐明，目前尚无任何与CCN2基因变异相关的人类单基因疾病被确认。在本研究中，我们收集了被诊断为SEMD的家庭，并使用下一代测序对无已知遗传原因的候选致病基因进行了筛查。随后进行了机制研究，以探索候选基因的潜在发病机制。结果
CCN2基因变异在一个大型脊椎骨软骨发育不良（SEMD）家族中与临床特征完全共分离我们在一例四代汉族家族中发现了CCN2基因的单等位基因变异（c.65 G > C，p.Arg22Pro），该家族患有常染色体显性脊椎骨软骨发育不良（SEMD），共14名成员受影响（图1a）。受影响个体出生时通常无明显症状，最早的变化在儿童早期显现，表现为异常的行走或跑步方式。大多数患者从小就存在膝关节、踝关节和肘关节的屈曲受限，青春期时下肢出现关节疼痛和肿胀，随着年龄的增长，症状逐渐加重。受影响个体表现出轻度至重度的不成比例矮小，且下肢相对较短。未观察到明显的额外骨骼异常。融合前的放射线检查显示长骨的发育不良的骨骺和不规则的骨干，以及椎体呈子弹状外观并伴有不规则骨骺；而在骨骺融合后，则表现为扁平椎体和椎体中央后方的凹陷变形、骨端不规则硬化、髋关节和近端股骨的发育不良，以及肘关节和踝关节的发育不良伴有骨刺形成。在部分患者中，承重关节显示明显的早发性退行性变化，放射线特征与老年性骨关节炎相似，包括关节间隙减少、关节面不规则、骨增生、软骨下囊肿和骨硬化（图1b）。使用双能X射线吸收测定法测量的骨矿物质密度（BMD）结果显示8名成年患者中有6名患有骨质疏松或骨量减少。详细的临床特征和放射学发现见于表1、表2和补充说明中。常规生化检测未发现明显异常。![]()
图1 一个大型中国家族的谱系和放射学特征，该家族患有脊柱骨骺发育不全（SEMD）为了确定这大家族脊椎骨软骨发育不良（SEMD）的遗传原因，我们采用了全基因组连锁扫描、全外显子测序（WES）和Sanger测序的组合方法。首先对18名家庭成员进行全基因组连锁分析，包括I-2、II-2、II-6、II-7、II-9、II-10、III-1、III-2、III-3、III-4、III-5、III-6、III-13、III-14、III-15、IV-2、IV-3和IV-4。连锁数据采用显性遗传模型进行分析，结果显示在6号染色体的6q22.32-q23.3区域有一个显著的候选区域，该区域由标记kgp22768966和rs9389536夹持，最大LOD值为3.5（图2a，图S1）。在此区域内未发现已知会导致SEMD的基因。随后对四名受影响者（II-2、III-9、III-13和IV-4）和两名未受影响者（II-6和III-15）进行了WES，发现有33个变异在这六名个体中与临床特征共同分离（表S1）。同时，有八个变异位于连锁区域，其中两个变异分别在CCN2和FBXO30基因中，可能导致编码蛋白质的变化。Sanger测序确认了这两个变异的存在，PCR和直接测序所用的引物为：CCN2变异5’-AGGTGGGGAGGAATGCGAGGA-3’（正向），5’-GCCGTCCAGCACGAGGCTCAC-3’（反向）；FBXO30变异5’-ATGGCTCTGAATTTGTGCAGT-3’（正向），5’-ACTGAGCGTAGTGAACGTCCT-3’（反向）。然而，仅有CCN2的变异（c.65 G > C，p.Arg22Pro）在所有可用的家庭成员（n = 28）中表现出完全的共分离，被认为是该疾病的优秀候选致病变异（图2b）。据我们所知，CCN2中的变异在当前的公共人类序列变异数据库中缺失，包括1000基因组计划、单核苷酸多态性数据库、ESP和ExAC数据库，并且在我们研究中招募的750个对照样本（1500个等位基因）中也未发现该变异。氨基酸Arg22位于CCN2的信号肽中，在不同物种间高度保守（图2c，d）。结构分析显示，该变异导致的折叠自由能增加，引起了突变CCN2的构象变化。同时，突变残基导致信号肽等电点降低，这可能会影响蛋白质的分泌过程（图2e）。![]()
图2 在患有脊柱骨骺发育不全（SEMD）的家庭中鉴定出CCN2的致病变异CCN2变异会影响CCN2蛋白的分泌，受影响个体的血清CCN2水平降低为了评估该变异是否影响CCN2的分泌，我们在细胞系中过表达了Flag标记的人类野生型或突变型（p.Arg22Pro）CCN2，并在转染48小时后收集了培养基和细胞。通过免疫荧光和西方印迹分析，我们发现与野生型细胞相比，突变型CCN2转染细胞的培养基中CCN2蛋白含量较低，而细胞内的蛋白质保留量增加（图3a–c）。接着，我们通过RT-PCR检测CCN2 mRNA的水平，发现突变转染细胞的CCN2 mRNA水平与野生型转染细胞相似（图3d）。这些发现表明，CCN2蛋白分泌的减少很可能是由于该变异对蛋白质分泌的有害影响。与细胞系的发现一致，受影响个体的血清CCN2水平显著低于健康对照组（图3e）。![]()
CCN2变异减弱了其对骨髓间充质干细胞（BMSCs）骨生成的刺激作用为了进一步阐明CCN2变异的功能后果，我们使用慢病毒在小鼠BMSCs中过表达了人类野生型或突变型CCN2。结果显示，突变型CCN2感染的BMSCs的成骨分化低于野生型感染的细胞，这通过ALP染色和活性定量得以确认（图4a，b）。尽管突变感染细胞的CCN2表达水平与野生型感染细胞相似（图4c），但成骨分化标志基因Alp、Runx2和Bglap的表达增幅较小（图4d）。这些结果表明，CCN2在促进成骨细胞分化中起着重要作用，而所识别的CCN2变异降低了其在这一过程中的有效性。![]()
图4 CCN2变异减弱了其对骨髓间充质干细胞（BMSC）成骨的刺激作用ccn2a敲低的斑马鱼表现出严重的颅面骨骼发育异常和骨量减少，而通过过表达ccn2a mRNA可以拯救这一现象斑马鱼的软骨和骨骼发育模式简单，且在进化过程中在所有脊椎动物中高度保守。遗传研究显示，斑马鱼和人类在骨骼形态发生的发育机制上有相似之处，这使得斑马鱼成为研究软骨和骨骼发育分子基础的优秀模型。斑马鱼同源蛋白ccn2a与人类CCN2蛋白的序列相似度为78.7%。因此，我们设计并验证了特异性Morpholino寡核苷酸（MO）以敲低斑马鱼中的ccn2a，从而表征CCN2缺失在骨骼发育中的功能后果。将外显子2-内含子2剪接的ccn2a MO（ccn2a-e2i2-MO）或标准对照MO微注射到受精的单细胞胚胎中。ccn2a-e2i2-MO注射的斑马鱼在受精后2天（dpf）出现明显的形态异常，包括显著的身体轴弯曲、下颌缺陷、小眼睛、心包水肿以及未膨胀的泳囊。为了进一步观察斑马鱼胚胎的骨骼结构，我们进行了卡尔辛染色。5 dpf时，发育良好的颅面软骨结构的荧光信号变得明显，而ccn2a-e2i2-MO注射的幼鱼表现出严重的颅面骨骼发育异常。颅面缺陷包括缺失梅克尔软骨、腭方骨和第五鳃弓，以及变形的遮盖骨、异位翼骨和筛骨。与对照组相比，突变形态的矿化组织染色数量显著减少，头骨骨量的相对荧光强度（RFI）定量显示ccn2a morphants的显著降低。为了确认ccn2a-e2i2-MO注射斑马鱼的骨骼发育异常是由于ccn2a敲低引起的，我们进行了救援实验，联合注射ccn2a-e2i2-MO和ccn2a mRNA，观察到ccn2a mRNA的过表达显著拯救了ccn2a morphants的骨骼畸形。这些发现表明ccn2a对斑马鱼的骨骼发育至关重要。![]()
图5 CCN2A mRNA的过表达挽救了CCN2A敲除斑马鱼形态异常和颅面表型为了理解CCN2缺陷患者骨骼表型的潜在分子机制，我们确定了骨骼发育缺陷是否由早期间充质前体细胞对CCN2的需求所致。我们通过将Ccn2fl/fl小鼠与Prx1Cre小鼠杂交，在小鼠的间充质前体细胞（Ccn2fl/fl;Prx1Cre）中敲除CCN2，其中Prx1Cre小鼠是一种转基因品系，其在早期肢芽间充质亚群中表达Cre重组酶。31为了明确CCN2对骨骼系统的影响，我们对6周龄的Ccn2fl/fl;Prx1Cre小鼠及其相应对照同窝仔鼠的四肢进行了显微计算机断层扫描（micro-CT）分析。与对照同窝仔鼠相比，Ccn2fl/fl;Prx1Cre小鼠的股骨小梁骨量减少（图6a–h），骨密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）和数量（Tb.N）均降低。而Ccn2fl/fl;Prx1Cre小鼠的骨小梁分离度（Tb.Sp）和皮质骨厚度（Ct.Th）测量值与同龄对照同窝仔鼠相似。为了进一步了解间充质前体细胞中CCN2缺失如何导致骨骼异常，我们对6周龄小鼠的股骨进行了形态学分析。苏木精-伊红（H/E）染色显示，生长板形态扭曲且增大，如图6i、j所示。软骨合成代谢标志物免疫荧光分析显示，Col2阳性区域扩大（图6k、l），而在Ccn2fl/fl;Prx1Cre小鼠中，Col1α1阳性区域的数量减少（图6m、n）。通过抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色检测骨吸收情况，结果显示TRAP阳性区域增加（图6o、p）。这些结果表明，软骨和骨形成缺陷以及骨吸收增加共同导致了Ccn2fl/fl;Prx1Cre小鼠的骨骼异常。通过对野生型和CCN2缺陷型小鼠的骨髓间充质干细胞（BMSCs）进行转录组测序，我们对差异表达基因（DEGs）进行了通路分析，发现下调基因富集于多细胞生物发育、胶原纤维组织、骨骼系统发育和四肢关节形态发生等生物通路（图S4）。RNA-seq数据提供了额外支持，表明CCN2缺乏导致了骨骼畸形。![]()
在此，我们对无已知遗传原因的短指-多指-并指-指（趾）骨发育不良（SEMD）家系进行了遗传分析，并报告了一个CCN2基因的单等位基因错义变异（c.65 G > C，p.Arg22Pro），该变异是14例常染色体显性遗传SEMD的遗传原因。计算机模拟分析显示，该变异位于CCN2的信号序列中，导致信号肽的折叠自由能升高和等电点降低。该变异对CCN2的加工和分泌产生有害影响，并可能涉及成骨障碍。我们进一步构建了斑马鱼ccn2a敲除模型和成骨细胞谱系特异性Ccn2缺陷小鼠（Ccn2fl/fl;Prx1Cre），这些模型在一定程度上再现了SEMD患者观察到的骨骼缺陷表型，尤其是低骨量表型。CCN2是一种分泌蛋白，由N端信号肽和四个保守模块组成，主要作为细胞外蛋白分泌，并与多种细胞表面受体、细胞外基质（ECM）成分和细胞因子相互作用，具有其他基质细胞外蛋白的共同特征。分泌蛋白的信号肽通常是新合成蛋白质氨基端的短序列，指导蛋白质进入细胞分泌途径，并且通常由三个独特且特征明显的区域组成：带正电荷的N端区域（n区，1–5个残基）、疏水核心（h区，7–15个残基）和包含切割位点的极性C端区域（c区，3-7个残基）。在蛋白质分泌过程中，信号肽被一种名为信号识别颗粒（SRP）的靶向因子识别，并指导其转运至内质网膜，信号序列在内质网膜的腔侧被切割，成熟蛋白质最终通过高尔基体运送到细胞外。据报道，几种人类单基因遗传代谢性骨病与致病基因信号序列中的变异有关，如 pycnodysostosis 的 CTSK 基因变异、低血钙症的 PTH 基因变异和 Schmid 型干骺端软骨发育不良的 COL10A1 基因变异。信号序列中变异的致病基础主要与突变蛋白通过分泌途径的分泌缺陷或通过称为异常蛋白质产生调节（RAPP）途径的突变 mRNA 的病理性降解有关，并且这两种不同的后果已被证明与变异在信号序列中的位置有关。研究表明，n区在蛋白质的对接和转运中发挥作用，h区是SRP的目标，c区影响信号肽切割的效率和准确性。因此，n区的变异会干扰蛋白质的转运；h区的变异往往会阻止与SRP的相互作用，从而触发RAPP途径的病理性激活，随后导致mRNA降解；c区的变异通常会阻止信号序列的切割，影响蛋白质的分泌。在本研究中，已确定的变异（c.65 G > C，p.Arg22Pro）位于CCN2的信号肽中。计算机模拟分析显示，CCN2的信号序列由26个氨基酸组成，且该变异位于其c区，变异导致信号肽的折叠自由能升高和等电点降低。我们发现，在突变体转染的细胞中，CCN2蛋白的分泌减少并在细胞内滞留，而CCN2 mRNA水平与野生型转染细胞相似。这些结果表明，该变异可能对蛋白质的加工和分泌产生潜在的有害影响。由于CCN2主要作为细胞外基质（ECM）中的分泌性基质细胞外蛋白发挥作用，因此蛋白质分泌过程的受损很可能是导致该疾病的原因。曾有有限的证据表明，CCN2可能通过内吞途径发挥某些细胞内功能，从而影响细胞核中的基因转录，因此，需要进一步的研究来排除因积累的突变CCN2可能产生的某些未知的细胞内功能，这些功能也可能参与该疾病的发病机制。由于已经发现CCN2由于不同模块之间存在多个切割位点而可以被切割成不同的片段，并且不同的CCN2片段已被证明具有不同的生物学作用，因此，与不同模块中变异相关的人类表型仍有待未来揭示。我们观察到携带CCN2变异的受试者存在骨骼发育异常，包括轻至重度的不成比例性矮身材（下肢相对较短）、关节屈曲受限、承重关节出现类似早发性骨关节炎的改变以及骨量减少。CCN2是各种器官细胞外基质（ECM）中的一组调节蛋白之一，在发育过程中，骨骼是其主要表达部位之一。先前的体内研究表明，CCN2在骨建模期间的活跃成骨部位——骨小梁骨膜成骨细胞中强烈表达。通过在骨髓间充质干细胞（BMSCs）中过表达CCN2，我们发现CCN2导致碱性磷酸酶（ALP）活性增加以及成骨细胞特异性标志物的mRNA水平升高，这表明CCN2促进了成骨细胞的分化。这一发现与逆转录病毒载体介导的ST-2间质细胞中CCN2过表达导致成骨作用增加的结果一致。体外研究支持了CCN2在间充质干细胞（MSCs）成骨过程中的重要作用，这些研究发现CCN2敲除的MSCs会导致菌落形成受损、MSCs增殖受抑制以及脂肪细胞分化增强。44我们的研究表明，与野生型相比，感染突变CCN2的BMSCs成骨作用减弱，这表明由CCN2变异导致的成骨作用受损可能参与了短肢侏儒症（SEMD）的病理机制。我们在斑马鱼和小鼠模型中的体内研究进一步提供证据表明，CCN2对骨骼发育是必需的。Ccn2a基因敲除的斑马鱼表现出明显的颅面骨发育不良和骨量减少，而这些异常通过过表达ccn2a mRNA得到逆转。由于斑马鱼和人类之间软骨和骨中的细胞类型以及调节其发育的遗传途径具有保守性，斑马鱼最近已成为骨骼研究的热门模型。然而，在人类疾病的斑马鱼模型中，受影响的解剖部位或表型严重程度的程度并不总是一对一的关系，潜在的机制仍有待阐明。在本研究中，我们未观察到携带CCN2变异的受试者出现其他某些类型短肢侏儒症中常见的明显面部畸形表型，如前额突出、鼻梁塌陷、颧骨突出、腭裂或小颌等。然而，IV-5出现了前囟闭合延迟，而15.1岁的男孩IV-4的头围为61.0厘米（成人正常范围：54.0–58.0厘米）。目前，在没有更多类似病例的情况下，很难确定上述发现是否是偶然的，也很难确定我们的发现是否具有潜在的临床意义。CCN2已被证明在哺乳动物胚胎发育期间的两种不同骨形成过程——软骨内骨化和膜内骨化中，对多种细胞类型发挥重要作用。在这里，我们还提供证据表明，CCN2在早期间充质前体细胞中的需求可能是CCN2缺乏导致短肢侏儒症（SEMD）患者表型的分子机制之一。小鼠间充质前体细胞中Ccn2的缺失（Ccn2fl/fl;Prx1Cre）部分再现了SEMD的临床发现，导致骨量减少。此外，据报道，Ccn2+/−小鼠也表现出骨量减少，骨体积分数（BV/TV）降低了30%–45%，这与本研究中Ccn2fl/fl;Prx1Cre小鼠观察到的表型一致。通过Col1α1的免疫荧光分析，我们观察到Ccn2fl/fl;Prx1Cre小鼠骨小梁骨膜成骨部位的骨形成减少，这与体外MSCs研究的发现相符。由于骨量减少可能是骨形成减少、骨吸收增加或两者兼有的结果。我们进一步使用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色检查了骨吸收的变化，发现Ccn2fl/fl;Prx1Cre小鼠TRAP阳性区域增加，表明骨丢失也与骨吸收增加有关。先前的研究表明，Ccn2敲除小鼠在骨骺区的破骨细胞数量减少。由于我们在本研究中在早期间充质前体细胞中敲除了Ccn2，因此TRAP阳性区域的增加被怀疑是一种继发性变化。对于不同研究结果之间的差异以及Ccn2fl/fl;Prx1Cre小鼠中骨形成和骨吸收解偶联的潜在机制，需要进一步研究。通过免疫荧光分析生长板中软骨合成代谢的Col2水平发现，Ccn2fl/fl;Prx1Cre小鼠中Col2标记的区域扩大。这些结果表明，Ccn2fl/fl;Prx1Cre小鼠骨骼表型的病理机制涉及骨形成减少、骨吸收增加和软骨形成异常。生物信息学分析显示，这些下调的基因在某些生物途径中富集，包括多细胞生物体发育、胶原纤维组织、骨骼系统发育和肢体关节形态发生。KEGG通路富集分析得到的通路包括环磷酸鸟苷（cGMP）-蛋白激酶G（PKG）信号通路和环磷酸腺苷（cAMP）信号通路，两者在骨骼重塑中都发挥着重要作用；磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）-Akt信号通路据报道可调节骨形态发生蛋白2（BMP2）诱导的间充质干细胞（MSCs）成骨分化，促进骨折愈合，对关节组织代谢至关重要，并参与骨关节炎的发展；细胞外基质（ECM）-受体相互作用也常见于骨骼形成和再生中，通过ECM与成骨细胞和破骨细胞的动态相互作用来调节新骨形成。此外，我们对富集于胶原纤维组织和骨骼系统发育的差异表达基因（DEGs）进行了蛋白质-蛋白质相互作用网络分析。这些数据进一步提供证据表明，CCN2缺乏导致了骨骼畸形。然而，值得注意的是，这两种小鼠模型（Ccn2fl/fl;Prx1Cre小鼠和Ccn2+/−小鼠）均表现出正常的股骨长度，除了骨量减少外，未检测到其他明显的骨骼异常。同时，在携带已确定的CCN2变异的小鼠中，我们也没有观察到骨骼发育或稳态方面的明显异常（数据未显示）。CCN家族有六个成员，其余五个CCN蛋白已被发现在骨形成过程中表达，并表现出与CCN2相似或相反的作用。遗传小鼠模型与人类中因CCN2缺乏所导致的骨骼表型谱和严重程度的差异，表明在功能冗余或其他补偿机制方面，小鼠与人类对CCN2缺乏的反应存在差异。另外，小鼠模型与人类之间因CCN2缺乏导致骨骼发育不良的阈值效应差异是否存在，仍有待阐明。CCN蛋白在小鼠骨骼发育中具有冗余或相反作用的假设进一步得到了以下发现的支持：敲除CCN6（以前称为WISP3 [MIM: 603400]）基因的小鼠并未表现出明显的骨骼表型，而该基因已知会导致人类进行性假性类风湿性发育不良，其特征是关节异常。小鼠模型与研究人类单基因疾病相关致病基因的功能紧密相关。然而，这些模型可能仅复制人类疾病表型的一些方面，表现出更严重的表型，或者根本没有临床表型。由于生物学、遗传背景、替代途径或补偿机制方面可能存在的差异，跨物种表型转化可能具有挑战性。尽管需要进一步研究来明确物种间因CCN2缺乏导致骨骼表型差异的确切原因，但已检测到的差异促使我们深入探究修饰基因、替代途径、可能的相互作用蛋白以及协同作用对短指（骨）-多指（骨）并指（骨）畸形（SEMD）发病机制的潜在影响，这将有助于我们理解物种间生物学方面的相似性和差异性。此外，尽管已经证明CCN2在各种生理过程中发挥着许多关键作用，但CCN2缺乏的受试者仅表现出骨骼异常，且没有其他器官明显异常的病史，这表明在人类中，骨骼和骨骼外器官对CCN2缺乏的敏感性可能存在差异。尽管CCN2在人类骨骼发育中的全面作用尚待进一步阐明，但CCN2缺乏导致的骨骼发育异常与我们对短指（骨）-多指（骨）并指（骨）畸形（SEMD）发病机制的理解是一致的。综上所述，本研究因此确定了CCN2是短指（骨）-多指（骨）并指（骨）畸形（SEMD）谱系的致病基因，并揭示了与CCN2缺乏有因果关联的人类表型。鉴于骨骼发育过程可能对CCN2剂量减少敏感，在临床环境中对接受CCN2靶向治疗的受试者进行骨骼改变评估可能是必要的。需要进一步的研究来确定调节CCN2是否能为骨质疏松症提供一种新的治疗方法，这也是我们期待的研究方向。研究批准
本研究（涉及人类的研究部分）遵循《赫尔辛基宣言》的原则进行，并已获得上海交通大学医学院附属第六人民医院伦理委员会的批准。在研究纳入之前，已从参与者或未成年参与者的父母处获得了书面知情同意。斑马鱼实验已获得上海模型生物研究中心机构动物饲养和使用委员会的批准。该斑马鱼设施已获得国际实验动物评估和认证协会（AAALAC）的认证。小鼠在中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所的动物设施中，在无菌条件下进行饲养和维持。所有小鼠实验均按照中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所动物饲养和使用委员会批准的协议进行。我们研究了短指（骨）-多指（骨）并指（骨）畸形（SEMD）患者及其可获得的家族成员。所有个体均接受了全面的临床询问、体格检查、生化分析和骨密度测定，以及骨骼X射线检查。SEMD的诊断基于临床表现和放射学发现。此外，我们还纳入了750名健康的、无亲缘关系的中国个体作为对照组。采用传统方法从外周血白细胞中提取并纯化基因组DNA。使用Illumina的GenomeStudio基因分型模块对样本进行基因分型，并按照Infinium HD Assay Super协议收集数据。使用MERLIN程序（版本1.1.2）进行多点参数连锁分析和完全外显的显性遗传模型的单倍型分析。利用人类2009年2月（GRCh37/hg19）组装的UCSC基因组浏览器（http://genome.ucsc.edu/)。将合格的DNA样本进行片段化处理，连接接头，通过连接介导的PCR进行扩增，并与外显子组阵列杂交以进行富集。使用Agilent 2100 Bioanalyzer和定量PCR来评估捕获的连接介导PCR产物的富集程度。对每个合格的捕获文库在Illumina Hiseq平台上进行高通量测序。所得数据使用Illumina的碱基识别软件以默认参数进行碱基识别，并生成配对末端读取数据。使用Burrows-Wheeler Aligner（BWA V0.7.15）将高质量读取数据映射到人类参考基因组GRCh37上，并使用Picard-tools（v2.5.0）去除重复读取。使用Genome Analysis Toolkit（GATK）根据最佳实践对InDels周围的局部进行重新比对和碱基质量分数重新校准。应用GATK（v3.3.0）的HaplotypeCaller进行包括单核苷酸多态性（SNP）和插入缺失（InDel）在内的基因组变异检测，并使用硬过滤方法获得高置信度的变异调用。使用SnpEff工具对变异进行一系列注释。排除了在1000 Genomes Project数据库（http://www.1000genomes.org/）、ESP6500（http://evs.gs.washington.edu/EVS/）和ExAC数据库（http://exac.broadinstitute.org/）中等位基因频率>0.1%的变异。通过连锁分析和全外显子组测序（WES）相结合的方法，在候选致病基因中确定的变异，在所有可获得的家族成员中通过PCR扩增后进行Sanger测序确认。使用虾碱性磷酸酶（Promega）和外切核酸酶I（Epicentre）对扩增的PCR产物进行纯化。测序反应使用BigDye Terminator循环测序即测即用反应试剂盒，版本3.1（Applied Biosystems）进行，并使用ABI Prism 3130自动测序仪（Applied Biosystems）和Polyphred进行检测和分析。从小鼠（4周龄的C57BL/6品系）的胫骨和股骨骨髓腔中分离出骨髓间充质干细胞（BMSCs）：用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）冲出骨髓，然后进行离心和红细胞裂解。将细胞沉淀轻轻重悬，并在添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的α-MEM培养基中培养。人胚肾293T细胞（HEK293T）和小鼠胚胎成纤维细胞C3H10T1/2购自美国细胞培养物保藏中心（ATCC）。HEK293T细胞在含有10% FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中培养，C3H10T1/2细胞在含有10% FBS和1%青霉素/链霉素的α-MEM培养基中培养。所有细胞均在37°C、5% CO2的湿润培养箱中培养。构建了过表达带有Flag标签的全长人CCN2突变体（p.Arg22Pro）或野生型CCN2的噬菌体载体。根据Effectene转染方案（QIAGEN，301425），将野生型或突变型载体与pLenti-EGFP一起转染到HEK293T细胞中，其中pLenti-EGFP作为对照。为了构建慢病毒载体，我们使用pLenti载体（pLenti-hCCN2-3xFlag-ZsGreen-Puro）过表达了ZsGreen、带有Flag标签的全长人CCN2突变体或野生型CCN2。慢病毒包装按照VSVG-delta 8.9系统进行。将骨髓间充质干细胞（BMSCs）或C3H10T1/2细胞用慢病毒感染24小时，然后用嘌呤霉素处理48小时。ZsGreen慢病毒用作对照。为了进行体外成骨细胞分化，用慢病毒感染的骨髓间充质干细胞（BMSCs）在含有10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素、50 μg/mL L-抗坏血酸（Sigma，A5960）和1.08 mg/mL β-甘油磷酸钠二水合物（Sigma，G9422）的α-MEM培养基中进行诱导。在第7天，用4%多聚甲醛（PFA）固定BMSCs 10分钟，并根据BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒（Beyotime，C3206）的说明书进行碱性磷酸酶（ALP）染色。为了进行ALP活性的定量分析，将成骨细胞与Alamar Blue（Invitrogen）一起孵育1小时，并使用发光仪（Envision）读取以量化细胞数量。然后，将成骨细胞与溶解在溶液（6.5 mmol/L Na2CO3、18.5 mmol/L NaHCO3、2 mmol/L MgCl2）中的磷酸酶底物（Sigma，S0942）一起孵育20分钟。使用发光仪（Envision）在A405处读取ALP活性，并以A405/Alamar Blue的值进行标准化。为了分析CCN2的分泌，将指定的质粒转染到HEK293T细胞中。48小时后收集细胞，并用含有蛋白酶抑制剂混合物（MCE，HY-K0010）的500 μL EBC缓冲液（50 mmol/L Tris，pH 7.5，120 mmol/L NaCl，0.5% NP-40）裂解细胞，然后以12,000转/分钟的速度离心。将培养基收集到15 mL离心管中，并以2,000转/分钟的速度离心。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析细胞裂解液和培养基，并使用针对Flag（Sigma，F3165-5MG，1:5,000）或GFP（Proteintech，66002-1-Ig，1:5,000）的一抗在4°C下孵育过夜，然后使用抗小鼠免疫球蛋白/HRP的二抗（Dako，P0260）进行孵育。与特异性抗体孵育后，使用增强型化学发光试剂盒（Millipore）检测蛋白质信号。我们的量化方法是在量化后计算目标条带与其匹配的内部参照条带之间的比例。然后，将每个目标条带的比例进行归一化处理，并在每个目标条带下方展示。为了进行细胞免疫荧光分析，将感染指定质粒48小时后的C3H10T1/2细胞用4%多聚甲醛（PFA）固定15分钟，然后在含有3%马血清和0.3% Triton X-100（Sangon Biotech，A110694-0500）的磷酸盐缓冲液（PBS）中封闭30分钟。之后，细胞在4°C下与小鼠抗Flag抗体（Sigma，F3165-5MG，1:200）孵育过夜。使用驴抗小鼠Cy3抗体（Jackson ImmunoResearch，715-165-150，1:1,000）作为二抗。使用DAPI（Sigma，D8417，1:1,000）进行复染。细胞用抗荧光封片剂（Dako，S3023）封片，并使用Leica SP8共聚焦显微镜捕获图像。细胞的总RNA使用Trizol（Invitrogen）进行提取，并使用Transcriptor第一链cDNA合成试剂盒（Roche）反转录成cDNA。RT-PCR分析采用FastStart Universal SYBR Green Master（Roche）在LightCycler480 PCR系统（Roche）上进行。目标基因的相对表达量以Gapdh或Hprt为参照进行标准化，并采用ΔΔCT法进行计算。所使用的引物列表如下：hCCN2-qF（人CCN2正向引物）：5'-AAGGGCAAAAAGTGCATCCG-3'
hCCN2-qR（人CCN2反向引物）：5'-TCTTCTTCATGACCTCGCCG-3'
mGAPDH-qF（小鼠GAPDH正向引物）：5'-TTCCTACCCCCAATGTGTCC-3'
mGAPDH-qR（小鼠GAPDH反向引物）：5'-GGTCCTCAGTGTAGCCCAAG-3'
mAlp-qF（小鼠Alp正向引物）：5'-CGGGACTGGTACTCGGATAA-3'
mAlp-qR（小鼠Alp反向引物）：5'-ATTCCACGTCGGTTCTGTTC-3'
mCcn2-qF（小鼠Ccn2正向引物）：5'-CTGCAGGCTAGAGAAGCAGAG-3'
mCcn2-qR（小鼠Ccn2反向引物）：5'-GATGCACTTTTTGCCCTTCT-3'
mRunx2-qF（小鼠Runx2正向引物）：5'-CCAACCGAGTCATTTAAGGCT-3'
mRunx2-qR（小鼠Runx2反向引物）：5'-GCTCACGTCGCTCATCTTG-3'
mBglap-qF（小鼠Bglap正向引物）：5'-GCAGCACAGGTCCTAAATAG-3'
mBglap-qR（小鼠Bglap反向引物）：5'-GGGCAATAAGGTAGTGAACAG-3'
mHprt-qF（小鼠Hprt正向引物）：5'-GTTAAGCAGTACAGCCCCAAA-3'
mHprt-qR（小鼠Hprt反向引物）：5'-AGGGCATATCCAACAACAAACTT-3'
人血清中的CCN2蛋白水平使用Elisa试剂盒（DRG Instruments GmbH，EIA-5195）进行测量，操作遵循制造商的说明书。在该实验中，CCN2的批内变异系数（CVs）分别为：在110.1 ng/mL水平时为1.3%，在49.9 ng/mL水平时为2.6%，在129.7 ng/mL水平时为3.9%。CCN2的批间变异系数（CVs）分别为：在27.2 ng/mL水平时为9.7%，在15.0 ng/mL水平时为9.8%，在31.0 ng/mL水平时为10.6%，在32.2 ng/mL水平时为6.2%。斑马鱼的饲养、维护与显微注射
成年野生型斑马鱼（AB品系）被饲养在28.5°C的环境中，遵循14小时光照/10小时黑暗的循环周期，并且每次设置5至6对进行自然交配。所产生的胚胎在含有0.2%速溶海水盐的去离子水中（即鱼水）维持在28.5°C，并根据先前的研究进行洗涤和分期。为了进行ccn2a基因敲低实验，我们设计了ccn2a-e2i2-MO（5’-AACAGCCAAGATCCTTACCTGTGCA-3’）和标准对照MO（5’-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3’），并由Gene Tools公司（http://www.gene-tools.com/）合成。这些MO被显微注射到受精后的一细胞期胚胎中。为了验证ccn2a-e2i2-MO的有效性，我们进行了RT-PCR分析和Sanger测序。每组30至50个胚胎的总RNA被提取并反转录成cDNA。用于扩增跨越ccn2a基因第1外显子和第3外显子的引物序列为：正向引物5’-CTCTGCTGTTCCTGACTTTCTT-3’，反向引物5’-ACTTCCCAGGCACTTTCAC-3’。同时，我们还使用了ef1α基因作为内参，其正向引物为5’-GGAAATTCGAGACCAGCAAATAC-3’，反向引物为5’-GATACCAGCCTCAAACTCACC-3’。在进行拯救实验时，我们向每个胚胎中共注射了4 ng的ccn2a-e2i2-MO和100 pg含有非突变斑马鱼ccn2a cDNA的pcDNA3.1质粒。这个野生型斑马鱼ccn2a的编码区由桑戈生物技术公司合成，并被亚克隆到pcDNA3.1载体（Invitrogen）中。首先，用养鱼水清洗5天后的斑马鱼（5-dpf），然后将其浸入0.2%的钙黄绿素溶液中10分钟。之后，再次用养鱼水彻底冲洗斑马鱼，并用0.016%的MS-222（甲磺酸三卡因，Sigma-Aldrich）进行麻醉。最后，将斑马鱼腹部朝上置于载玻片的凹槽中，并用3%的甲基纤维素（Sigma-Aldrich）固定，以便用荧光显微镜（Nikon SMZ 1500）进行观察，随后用数码相机拍照。使用形态计量分析（NIS-Elements D3.1）对头骨骨量的相对荧光强度（RFI）进行定量分析。为了最佳地显示表达模式，使用Adobe Photoshop 7.0软件对部分图像进行了色阶、亮度、对比度、色调和饱和度的调整。每组共量化并平均了10条斑马鱼的数据。Ccn2fl/fl;Prx1Cre小鼠模型分析
小鼠模型构建
携带Ccn2基因第1-5号外显子两侧loxP位点的Ccn2fl/fl小鼠由中国的GemPharmatech公司提供。Prx1Cre小鼠品系由Andrew McMahon赠送。将Ccn2fl/fl小鼠与Prx1Cre小鼠杂交，以获得Ccn2fl/fl;Prx1Cre小鼠。所有分析的小鼠均保持在C57BL/6背景上。从年龄和性别相匹配的6周龄Ccn2fl/fl;Prx1Cre小鼠及其对照同窝仔鼠中分离出左侧股骨，用70%乙醇固定，并使用SkyScan-1176显微计算机断层扫描（μCT）（Bruker micro CT，比利时）系统进行扫描。扫描采用8.96 μm体素大小、50 KV、500 μA和0.4度旋转步长（180度角范围）进行。使用NRecon软件（Bruker）1.6版进行图像的三维（3D）重建和查看，并使用CTvox软件（Bruker）3.3.0版制作骨骼的3D照片。在3D重建后，使用CTan软件（Bruker）1.13版进行骨骼分析，分割范围从85/120到255/255。对于松质骨，在小鼠股骨远端距生长板0.5 mm处的2 mm松质骨区进行显微CT评估。对于皮质骨，测量在小鼠股骨骨干中部的0.5 mm区域进行。松质骨测量指标包括骨矿物质密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁数量（Tb.N）和骨小梁间隙（Tb.Sp）。皮质骨测量指标包括皮质骨厚度（Ct.Th）。取小鼠的股骨和胫骨，用4%多聚甲醛（PFA）在4 °C下固定48小时，然后在10%乙二胺四乙酸（EDTA）中脱钙2周，用酒精脱水，二甲苯透明，并包埋在石蜡中。使用切片机（Lexica Microsystems Nussle GmbH）将每个样本矢状切片，厚度为8 μm，用于染色。苏木精-伊红（H/E）染色采用标准方案进行。对于抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色，根据制造商的说明，使用白细胞酸性磷酸酶试剂盒（Sigma, 387A-1KT）在37 °C下染色1小时。对于免疫荧光染色，切片在含有10%马血清和0.3% Triton X-100（Sangon Biotech, A110694-0500）的磷酸盐缓冲液（PBS）中封闭1小时，然后在4 °C下与兔抗II型胶原（Abcam, ab34712）或兔抗I型胶原（Abcam, ab21286）抗体孵育过夜。根据一抗的种类使用相应的二抗，并使用DAPI（Sigma, D8417）进行复染。使用防褪色荧光封固剂（Dako, S3023）封片。使用显微镜（Olympus BX51，日本东京）采集图像。统计分析使用GraphPad Prism 9软件（GraphPad Software）进行。基于细胞的实验至少重复两次。除非另有说明，否则动物被随机分配到不同组，每组至少使用3只小鼠。所有定量数据均以平均值±标准差（SD）表示。根据适当性，使用Student’s t检验、单因素方差分析（ANOVA）和Mann-Whitney检验对组间比较进行统计评估。统计学意义用*表示，其中P < 0.05；**表示，其中P < 0.01；***表示，其中P < 0.001；****表示，其中P < 0.0001；所有检验均为双侧检验。原文地址：https://www.nature.com/articles/s41413-024-00364-2
注：因文章篇幅有限，所有相关引用文献，以及补充素材可以点击至原文查阅。
