【文献解读】利用转基因斑马鱼模型发现VCP是通过调节自噬活性治疗Tau蛋白病的潜在有效靶点
文摘
科学
2024-09-28 17:00
江苏
![]()
![]()
文献：Giong HK, Hyeon SJ, Lee JG, Cho HJ, Park U, Stein TD, Lee J, Yu K, Ryu H, Lee JS. Tau accumulation is cleared by the induced expression of VCP via autophagy. Acta Neuropathol. 2024 Sep 24;148(1):46. doi: 10.1007/s00401-024-02804-z. PMID: 39316141; PMCID: PMC11422276.影响因子：9.3
Tau蛋白病，包括额颞叶痴呆和阿尔茨海默病，是一类神经退行性疾病，其特征是由于蛋白稳态缺陷而导致Tau蛋白异常积累。在生成并表征一种稳定的转基因斑马鱼后，我们发现该斑马鱼特异性表达人类TAUP301L突变体，尽管Tau mRNA的表达保持恒定，但积累的Tau蛋白通过增强的自噬活性得到了有效清除；只有在自噬被基因或化学方法抑制时，才显现出明显的类Tau病表型。我们进行了RNA测序分析、基因敲低和相关的救援实验，涉及到与临床相关的点突变的含有Valosin的蛋白（VCP），并显示VCP的诱导表达是Tau降解的关键因素，因为它促进了自噬通量。VCP在Tau清除中的这一新功能在Tau病小鼠模型中得到了进一步确认，VCP的过表达显著降低了磷酸化和寡聚/聚集的Tau水平，并改善了由Tau引起的认知行为表型，当自噬被阻断时，这些改善会被逆转。重要的是，人类阿尔茨海默病患者大脑中VCP的表达显著下调，这与其在Tau清除中的作用相一致。综合这些结果，表明通过在时空上增强VCP的表达和活性以促进自噬通路，是治疗Tau病的一种潜在治疗策略。介绍
Tau蛋白病是一类神经退行性疾病，其特征是细胞内神经纤维缠结（NFT）的积累，主要由超磷酸化的Tau（pTau）蛋白异常聚集引起，包括阿尔茨海默病（AD）和额颞叶痴呆（FTLD）。尽管进行了大量研究，Tau病的机制仍不清楚，针对Tau的治疗化合物和抗体在临床试验中未能成功，这需要进一步深入研究。Tau蛋白的病理性积累是Tau蛋白病的标志，主要源于细胞蛋白稳态的失调，其中自噬-溶酶体通路（ALP）通常发挥重要作用，负责去除大型蛋白聚集体和细胞器，但在突变或衰老等病理条件下常常受到损害，导致多种Tau病表型。因此，激活ALP活性被认为是治疗Tau病的有效治疗靶点，例如采用多种自噬诱导剂，包括哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抑制剂。然而，大多数研究仍处于临床前阶段，其详细机制和其他利用ALP的候选物尚待确定。含Valosin的蛋白（VCP）/p97/Cdc48（以下简称VCP）是六聚体AAA（与多种细胞活动相关的ATP酶）家族的一员。VCP在多个关键功能中，可以通过泛素-蛋白酶体系统（UPS）或ALP维持细胞蛋白稳态，靶向并降解多泛素化底物。临床上，VCP突变在超过50%的遗传性多系统蛋白病（MSP）患者中发现，受影响细胞中可检测到泛素阳性包涵体和环状空泡。在阿尔茨海默病和Tau病中，VCP的表达水平降低，已报告VCP的功能缺失突变导致Tau解聚酶活性降低。然而，考虑到VCP可以调控ALP的多个步骤，并且ALP专门用于去除像Tau聚集体这样的蛋白聚集体，因此VCP可能通过ALP清除Tau在Tau病和阿尔茨海默病中的积累。然而，目前尚缺乏VCP在Tau病中的直接体内证据及其详细机制。斑马鱼是一种小型脊椎动物模型，具有遗传可操作性，能够在体内进行细胞和亚细胞水平的成像，并提供适合的药物筛选平台以研究人类疾病，包括Tau病。在本报告中，我们生成了一种新的转基因斑马鱼模型，在神经元特异性启动子的驱动下表达人类TAUP301L。该转基因斑马鱼模型中，当自噬途径通过基因或化学方式抑制时，Tau病相关的表型，包括Tau蛋白的积累和磷酸化变得明显。VCP的上调表达与Tau的积累高度相关，是自噬介导Tau降解的关键，这一过程通过VCP敲低和与临床相关的VCP突变体的救援实验在体内得到验证。与这些发现一致的是，在小鼠Tau过表达模型、细胞系的研究及人类阿尔茨海默病大脑的表达分析中，也支持VCP在Tau蛋白清除中的作用，表明其在不同物种间的功能保守性。我们的结果强调了自噬在维持体内Tau蛋白稳态中的重要作用，并通过对VCP表达的严格调控，提出VCP作为通过调节自噬活性治疗Tau蛋白病的潜在有效治疗靶点。表达人类TAUP301L的斑马鱼未出现因Tau清除而引起的缺陷，这与自噬活性增加有关
在筛选的86条鱼中，我们识别出一种稳定的F1转基因系，具有生殖系传递能力，其荧光由hTAUP301L-2A与mCherry结合所致，本研究对此进行了进一步表征（Tg(elavl3:hTAUP301L-2A-mCherry；以下简称“Tau tg”；图1a，补充图1）。作为对照，我们还生成了一条仅在相同elavl3启动子下表达mCherry的稳定系（“Ctrl”）。在Tau tg系中，人类TAU RNA在发育阶段（图1b）和成年大脑（补充图20）中持续表达。与其持续的RNA表达相反，Tau tg系中的Tau蛋白水平在受精后28小时（hpf）和2天（dpf）时有所增加，但在5 dpf时显著下降，这通过T46抗体的西方印迹分析得到确认，该抗体可以检测总Tau（图1c，d）。pTau的变化模式也类似，通过AT180、PHF和AT8抗体进行西方印迹分析，分别检测Tau在T231、S396和S202/T205位点的病理性磷酸化，这些位点在Tau病的早期、中期和晚期阶段具有特征性（图1c；补充图2a-c）。这些Tau蛋白表达的变化伴随着促炎细胞因子的表达，包括白介素6（Il6）和肿瘤坏死因子α（Tnf-α）基因，在2 dpf时强烈诱导，而在4 dpf时表达急剧下降（图1f）。然而，在Tau tg系中，虽然Tau蛋白及其磷酸化在早期表现出强烈表达，但并未在2 dpf的运动轴突生长（补充图3a）、4 dpf的突触发生（补充图3b）、3 dpf的神经元死亡（补充图3c）或6 dpf的行为（如运动、接触趋向和黑暗反应；补充图3d-f）中引发与Tau病相关的表型，这可能是由于Tau蛋白的量不足或瞬时表达后其急剧减少（图1c，d；补充图2a-c）。![]()
图1 在斑马鱼Tau蛋白过表达的转基因模型中，Tau蛋白的清除与自噬活性的增加相吻合已知Tau蛋白可以通过UPS或ALP清除。因此，我们首先检查了在Tau tg系中过表达的Tau是否通过UPS清除，方法是用著名的UPS抑制剂MG132处理斑马鱼。MG132处理导致泛素化蛋白的积累，因UPS失效，但并未影响Tau tg系中的Tau蛋白水平（补充图4），这表明Tau的清除与UPS活性无关。另一方面，我们推测含有P301L突变的Tau蛋白，其更易于高磷酸化和聚集，可能通过ALP被清除，因为磷酸化和聚集形式的Tau是通过ALP清除的。与此推理一致，Tau tg系中的自噬标志物微管相关蛋白1A/1B轻链3（LC3）-I/II和自噬介质/底物p62表达上调（图1c，e，3d；补充图2d），表明自噬通路的参与。此外，p62表达的强烈诱导后迅速下降，与Tau tg系中动态的Tau清除模式相吻合（图1c，e，3d）。这些结果表明，我们的Tau tg系中与病理相关的人类Tau蛋白磷酸化形式可能通过上调的自噬被清除，从而抑制潜在的Tau病相关表型。为测试自噬是否对Tau清除在我们的Tau tg系中至关重要，我们通过敲低与自噬相关的5号基因（atg5）来抑制自噬通路。atg5基因在自噬体形成中通过LC3-I向LC3-II的脂质化过程发挥关键作用，使用了之前验证过的atg5 morpholino（MO）。通过atg5特异性抗体的西方印迹确认了atg5 MO的有效性（图2a；补充图5a）。值得注意的是，atg5 MO的敲低导致LC3-I和p62异常积累（图2a，c；补充图5c），表明自噬功能受损。重要的是，与对照MO注射的Tau tg系和Ctrl系相比，atg5缺失使Tau tg系在2 dpf时总Tau和pTau的积累显著增加（图2a，b；补充图5b）。因此，注射atg5 MO的Tau tg胚胎比对照MO注射的胚胎表现出更严重的发育异常，并且死亡率较高（补充图6a，b）。此外，atg5缺失引起的Tau积累导致了初级运动轴突生长缺陷，使用Znp1抗体进行免疫染色以标记初级脊髓运动轴突，结果显示Tau tg morphants的平均轴突长度和分支分别减少了约15%（p < 0.01）和50%（p < 0.005），与对照morphants相比（图2d，e）。在Tau tg morphants的脑中，神经元和非神经元凋亡细胞数量也因atg5敲低显著增加（补充图6c）。![]()
图2 通过atg5耗竭抑制自噬，揭示了Tau转基因品系中的Tau蛋白毒性与atg5敲低结果一致，使用氯化铵（NH4Cl）化学抑制ALP，这是一种众所周知的自噬抑制剂，可以防止自噬体与溶酶体融合并降低溶酶体的pH。NH4Cl处理从24 hpf开始，持续3天，导致自噬缺陷，伴随LC3和p62的积累以及总Tau和pTau蛋白水平的增加，表明Tau蛋白的清除与自噬通量的增加相关（补充图7a，b）。因此，NH4Cl处理导致敏感的死亡率（补充图7c）和在4 dpf时Tau tg脑的下丘脑区域出现明显的凋亡细胞死亡（补充图7d）。此外，使用氯喹（另一种抑制自噬体与溶酶体融合并降低溶酶体pH的抑制剂）的处理也导致总Tau和AT8阳性pTau的积累，以及在5 dpf时LC3和p62的积累，与NH4Cl处理类似（补充图8）。总体而言，自噬通量与Tau积累/清除之间的相关性，以及在自噬缺陷条件下Tau tg系的Tau病相关表型，表明自噬活性对有效清除Tau蛋白至关重要，可能解释了在Tau tg系中未观察到明显Tau毒性的原因。与这些自噬抑制的发现一致，我们还验证了自噬在促进pTau（S202/T205和S396）清除中的作用，通过在HT22海马细胞中处理已知的自噬激活剂雷帕霉素（补充图15和16）。为了探究Tau在Tau tg系中清除的分子机制，我们在2.5 dpf时进行了Ctrl和Tau tg胚胎的比较RNA-seq分析，此时Tau tg系中的自噬活动正在进行（图1c，3d）。与之前的结果一致，自噬相关的基因本体（GO）类别，如“自噬”和“自噬体过程”，在Tau tg系的差异表达基因（DEGs）中显示出显著变化（图3a）。在转录组分析中识别出的自噬相关DEGs中，两个基因的表达水平发生了显著变化，即vcp和真核翻译起始因子4E结合蛋白1（eif4ebp1），其表达量增加了三倍以上（图3b；补充表1）。VCP通过多条细胞内通路参与蛋白质质量控制，包括ALP，其突变与多系统蛋白病（MSP）这种影响肌肉、骨骼和大脑的人类遗传病密切相关。有趣的是，Tau tg系中的vcp mRNA和Vcp蛋白表达水平表现出高度动态变化，在2和3 dpf时突然增加，随后急剧下降（图3c-d；补充图9），这与Tau蛋白的积累和降解及自噬通量完美吻合（图1c，3d；补充图9）。此外，vcp的表达在Tau tg系的大脑和脊髓样本中高度富集，通过荧光原位杂交法确认vcp mRNA的表达（图3e-f）。与这些发现一致，Tau tg脑细胞的Vcp免疫反应性在细胞质中也显著上调，并与标记pTau蛋白的AT8免疫反应共定位（补充图10中的箭头）。因此，我们进一步将vcp视为调节Tau清除的关键因子，通过促进自噬实现。![]()
vcp敲除实验显示，由人类VCP挽救了tau蛋白病表型，但自噬缺陷突变体未能挽救为了功能性验证上调的VCP表达是否对Tau清除是必需的，我们使用之前确认的vcp MO敲低vcp表达。通过使用Vcp特异性抗体的西方印迹确认了vcp MO的有效性（图4a；补充图11a）。在Tau tg系中，抑制vcp表达导致总Tau和pTau蛋白的显著积累（图4A；补充图11b，c）以及在2 dpf时的运动轴突缺陷，与对照MO注射的胚胎相比，主要运动轴突的长度减少约50%（p < 0.001），分支减少60%（p < 0.001）（图4b）。此外，vcp敲低在Tau tg系中导致触觉反应缺陷，而在Ctrl系中未见类似情况（补充图12），表明vcp的诱导对Tau清除和预防与Tau相关的毒性影响（如轴突生长和运动）是必需的。这些敲低表型特异于在斑马鱼和人类之间保留的vcp功能，因为在人类VCPWT mRNA表达的情况下，积累的Tau水平和由于vcp敲低造成的轴突生长缺陷得到了成功恢复，而催化失活的人类VCP突变体mRNA（VCPDKO）则未能恢复这些表型（图4a，b）。与VCP在斑马鱼Tau tg系中清除Tau的作用一致，已知的VCP激活剂SMER-28处理或VCP过表达促进了HT22细胞中Tau蛋白和pTau（S202/T205和S396）的清除（补充图15和16）。![]()
我们进一步测试了与早发性Paget病和额颞痴呆（IBMPFD）相关的VCP突变体的恢复能力，包括VCPR155H、VCPA232E和VCPD395G。VCPR155H和VCPA232E具有增强的去聚集酶（或展开酶）活性和缺陷的自噬体形成，而VCPD395G则具有降低的去聚集酶活性。有趣的是，VCPD395G mRNA的表达成功恢复了因vcp敲低引起的Tau积累/磷酸化、自噬标记物表达（图4c）和运动轴突缺陷（图4d），与人类VCPWT mRNA表达相似（图4a，c；补充图11；补充图13）；相比之下，VCPR155H和VCPA232E mRNA的表达未能恢复这些表型。这些结果强烈表明，VCP的自噬调节功能，而非去聚集酶活性，是在我们的斑马鱼模型中清除Tau所需的，这与VCP缺失细胞培养和小鼠模型中的自噬缺陷一致（见下文）。为了测试VCP是否以相同的效率清除WT Tau或P301L突变Tau，我们通过瞬时和马赛克表达人类TauWT或TauP301L-Kaede融合蛋白，在2 dpf的斑马鱼胚胎中比较TauWT和TauP301L的清除动态，并在Ctrl MO或vcp MO敲低条件下追踪它们的清除，类似于Lopez等人2017年的实验（补充图14a）。在光转换后追踪16小时内，在对照条件下80%的TauWT或TauP301L蛋白在8小时内被清除，但在vcp敲低条件下，这一清除显著延迟和抑制（补充图14b-d）。有趣的是，在这两种条件下，TauWT-Kaede和TauP301L-Kaede的清除动态没有显著差异（补充图14c和d），这表明VCP依赖的清除过程不区分TauWT和TauP301L蛋白。依赖VCP的Tau清除通过自噬在鼠模型和细胞培养中得到保留为了确认VCP依赖的Tau清除是否在小鼠中通过自噬通路得以保留，我们将腺相关病毒（AAV）构建体AAV-pSyn1-control（“对照小鼠”）或AAV-pSyn1-TauP301L（“TauP301L小鼠”）注入小鼠的海马，同时注入AAV-pSyn1-VCP（VCP），并对LC3和pTau（S202/T205）蛋白进行了免疫染色（图5a，b）。与斑马鱼的结果一致，我们发现TauP301L小鼠的海马神经元中LC3和pTau的强度显著增加，这表明自噬增强及Tau的积累（图5b）。此外，与TauP301L小鼠相比，VCP的过表达显著降低了TauP301L + VCP小鼠中的pTau水平，显示VCP通过自噬促进Tau的降解（图5b）。进一步地，将氯喹（CQ）这一自噬抑制剂与TauP301L + VCP小鼠联合注射，显著提高了LC3和pTau的水平，确认了VCP介导的Tau清除依赖于自噬。![]()
图5 通过自噬途径的VCP依赖性Tau蛋白清除在小鼠中是保守的为了探讨VCP是否调节Tau的聚合物和/或纤维状形式，我们使用pTau特异性抗体通过西方印迹分析确定这四组蛋白提取物中的高分子量pTau聚合物。结果显示，AAV-Syn1-TauP301L注射小鼠组中，pTau聚合物的多条带明显增加，与AAV-Syn1-Control组相比（补充图17b-d）。特别地，VCP过表达显著降低了在AAV-Syn1-TauP301L + AAV-Syn1-VCP注射小鼠组中的pTau聚合物（S202/T205和S396），而CQ则阻止了VCP介导的pTau聚合物的减少（补充图17b-d）。另一方面，基于以往的研究发现，S202/T205（AT8）、S199和S396的pTau抗体可以检测阿尔茨海默病（AD）患者大脑中的神经纤维缠结（NFT），我们还通过免疫组化分析（IHC）检查了注射TauP301L和VCP的小鼠脑切片中NFT的存在。IHC分析证实，TauP301L小鼠组的海马神经元中，pTau抗体染色的NFT免疫反应性增加，而VCP过表达降低了这种反应性，CQ处理则阻止了VCP介导的pTau（S202/T205、S199和S396）阳性NFT的减少（补充图18a-f），与西方印迹数据一致（补充图17a-d）。这些数据表明，VCP通过自噬机制调节pTau（S202/T205和S396）聚合物/聚集体的降解。在小鼠的实验结果与斑马鱼不同，2 dpf的斑马鱼Tau tg系中，T22抗体未能检测到Tau聚合物，硫黄素S也未能检测到NFT（补充图19a，b）。此外，我们还通过对四组小鼠进行被动回避行为测试，评估了VCP对小鼠认知功能的影响（图5d，e）。我们测量了进入黑暗房间的潜伏期，以此作为记忆保持的指标。结果显示，TauP301L小鼠的潜伏期显著缩短，与对照小鼠相比，这表明由于Tau毒性导致了记忆受损，而VCP过表达显著恢复了TauP301L + VCP小鼠的潜伏期，表明VCP通过减少Tau积累来改善记忆（图5e）。相对而言，与TauP301L + VCP小鼠相比，CQ的联合注射逆转了VCP对TauP301L + VCP + CQ小鼠的记忆效应，突显了自噬在VCP介导的Tau清除和记忆功能中的关键作用。综上所述，这些数据证明了VCP依赖的Tau清除通过自噬通路在小鼠中是保守的，并且表明VCP可能通过调节Tau水平。我们通过检查正常受试者和阿尔茨海默病（AD）患者的尸检脑样本中VCP和pTau的表达水平，进一步确认了斑马鱼和小鼠模型研究结果的临床相关性（表1）。在正常受试者的额叶皮层中发现VCP的免疫反应性，但在AD患者中显著减少（图6a）。同时，VCP免疫反应性与pTau的荧光免疫染色的共染色显示，在AD患者的皮层神经元中，VCP和pTau的水平呈负相关（图6b）。此外，与正常受试者相比，AD患者的额叶中VCP的mRNA水平显著降低（图6c）。这些观察结果强调了VCP在AD中的重要性，涉及mRNA和蛋白质水平，表明VCP表达调节与AD发病机制之间存在被低估的联系，这与我们的动物模型研究结果相一致。![]()
图6 在阿尔茨海默病患者的大脑皮层中，VCP的免疫反应性降低在本研究中，我们利用体内斑马鱼和小鼠模型以及人类细胞，展示了Tau蛋白的积累是通过激活自噬而被清除的，而不是通过泛素-蛋白酶体系统（UPS）。这种自噬激活及其对Tau相关病理表型的改善归因于VCP的功能，其表达具有高度的诱导性并与Tau清除呈正相关。与其在Tau清除中的作用一致，AD患者大脑皮层中的VCP表达显著下降，并且与Tau的积累呈负相关。根据我们所知，这些结果是首次提供的体内证据，确认VCP在通过自噬清除Tau中的重要作用。考虑到VCP在Tau清除中的关键作用，控制调节VCP的表达或功能活动可能作为一种潜在的治疗方案，用于改善与Tau病相关的表型，通过恢复自噬活性并加速Tau清除（图6D）。磷酸化和寡聚体/聚集形式的tau蛋白通过自噬途径在体内清除Tau蛋白可以通过UPS和自噬溶酶体途径（ALP），通过巨自噬、伴侣介导自噬（CMA）和内源性微自噬（e-MI）被降解和清除。一般认为，溶解的单体Tau主要通过UPS、CMA或e-MI降解，而不溶的Tau聚集体则通过巨自噬清除。尽管具体的Tau降解路径可能取决于其突变和后转译修饰（PTMs），这些变化导致在病理条件下形成配对螺旋丝（PHFs）和神经纤维缠结（NFT）。在本研究中，过表达带有高磷酸化和聚集倾向的常染色体显性突变人类TAUP301L在斑马鱼模型中导致pTau异常积累（图1），在小鼠模型中导致聚合物/聚集Tau的出现（补充图17和18）。有趣的是，UPS在我们的研究中没有促进Tau的清除（补充图4），而自噬通路在清除pTau（斑马鱼和小鼠模型；图2，补充图7、8和18）及潜在的聚合物/聚集Tau（小鼠模型，补充图17）方面发挥了重要作用，这一作用在自噬抑制条件下表现得尤为明显。这些结果与在Tet-off Tau过表达细胞培养中化学抑制自噬后Tau蛋白的积累增加相符以及在Atg7敲除小鼠前脑皮层神经元中pTau包涵物的积累相符。在Tau病的进展过程中，致病性Tau蛋白的积累可能是由于自噬过程失效，随后导致衰老或遗传突变影响自噬时“蛋白质稳态”紊乱。因此，激活自噬可以通过海藻糖或mTOR抑制剂促进野生型Tau或突变Tau蛋白的清除，这与我们动物模型和细胞培养中通过增加VCP表达和自噬介导的Tau清除过程相似，可以被视为针对Tau病的基于Tau降解的治疗的一种有前景的方法。VCP在神经退行性疾病中受到强烈影响，之前的观察表明：携带VCP突变的MSP的一大主要表型是肌萎缩侧索硬化症（ALS）/额颞叶变性（FTLD），而在与外周神经病相关的Charcot–Marie–Tooth病类型2中也发现了一种不同的VCP突变。此外，与正常受试者相比，AD患者大脑皮层中的VCP表达显著降低并且在Tau、α-突触核蛋白、亨廷顿蛋白（HTT）和TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）的清除/传播中起功能性作用。尽管之前有许多研究，但VCP在通过自噬介导的Tau清除中的作用尚未在体内证明。在本研究中，我们提供了证据表明分子伴侣VCP，其表达在Tau积累时上调，是在体内通过自噬调节Tau清除的关键因子，这基于vcp表达与Tau积累以及自噬标志物LC3-II和p62水平的相关性（图3d）、vcp野生型表达对vcp耗竭表型的救援能力以及斑马鱼模型中自噬标志物LC3-II/p62的增加（图4c；补充图13d、e），以及小鼠模型中Tau聚合物/聚集体的清除和VCP对与Tau病相关的行为缺陷的救援，这些效果被CQ处理抑制（图5；补充图17和18）。VCP通过自噬对Tau蛋白的清除在成年斑马鱼大脑中似乎依然活跃：14个月大的成年斑马鱼尽管持续表达Tau mRNA且没有明显的与Tau病相关的行为表型，但在大脑中几乎检测不到总Tau和磷酸化Tau蛋白，同时vcp表达上调且自噬水平增加，与对照组相比（补充图20），这意味着我们转基因鱼在成年阶段的自噬流仍然保持上调。在不同的病理背景下，VCP被认为在调节自噬中发挥作用：与疾病相关的VCP突变或VCP敲低在细胞中导致自噬功能障碍，同时形成不成熟的自噬体，LC3和p62的积累，导致无法降解聚Q和TDP-43等致病聚集物。VCP可能通过保护Beclin-1和磷脂酰肌醇3激酶复合物I的组装来调节自噬并清除积累的Tau，从而增强自噬的启动；通过直接结合LC3/Atg8加速吞噬体延长和/或招募结合底物来加快自噬流；增强受损溶酶体的清除和启动新的溶酶体生物发生；或促进自噬体和溶酶体的膜融合，类似于细胞周期中高尔基体膜的重组（图6d）。然而，VCP如何感知积累的Tau并增强自噬以清除Tau的确切机制，以及在特定情况下VCP所参与的Tau清除路径，还需要进一步研究。MSP的VCP突变似乎在tau清除方面表现为功能减弱在MSP中已经鉴定出许多VCP突变，其中泛素阳性包涵体和蛋白质聚集物位于肌肉、大脑和骨骼，并且还与ALS、PD和FTLD相关联。在本研究中，我们展示了在空泡性tau病中发现表达的VCPD395G变异成功地挽救了vcp耗竭引起的自噬功能障碍和tau病相关的轴突缺陷，而MSP中发现的两个代表性VCP突变VCPA232E和VCPR155H未能做到这一点（图4c，d）。这些结果有些出乎意料，因为虽然VCPD395G变异显示ATP酶/分离酶活性降低导致tau清除失败，但VCPA232E和VCPR155H在体外实验中显示出增加的ATP酶/展开酶活性和对辅因子NPLOC4/UFD1L和p47/Npl4的亲和力增加，支持它们获得功能性特征。有趣的是，尽管具有获得功能的ATP酶/展开酶活性，VCPA232E和VCPR155H变体未能降解细胞系中自噬缺陷的聚集蛋白，并且表达VCPR155C变体的实验未能挽救依赖ALP的FTLD-TDP表型，包括在神经元特异性vcp敲除小鼠模型中的TDP-43积累，揭示了它们在自噬途径中的功能丧失特性。我们的研究表明，VCP在tau蛋白清除中的功能可能因降解途径而异，但其确切的体内机制，特别是通过自噬作用与各种适配蛋白协作的机制，显然非常复杂，需要进一步研究。斑马鱼饲养和胚胎固定
鱼类在恒定的28.5摄氏度系统中保持14小时光照，10小时黑暗。胚胎被收集并在28.5摄氏度的孵化器中培养，用1-苯基-2-硫脲（PTU）处理以防止色素沉着，并用4%的甲醛（PFA）固定。斑马鱼的饲养和动物护理遵循韩国生物科学与生物技术研究所（KRIBB）的指导方针，并得到了KRIBB-IACUC的批准（批准号：KRIBB-AEC-21121）。根据制造商的说明（Invitrogen）和Tol2试剂盒[30]进行了Gateway重组。简而言之，使用attB4-F RattB1、attB1-F R-attB2（补充表2）扩增了elavl3启动子、人类TAU-P301L（hTAUP301L）和2A-mCherry序列，分别生成了5'和中间入口克隆。3'入口克隆来自Tol2试剂盒。然后使用带有Tol2位点的目的载体进行LR反应，以生成最终表达克隆elavl3-hTAUP301L-2A-mCherry。还生成了一个对照表达构建体，使用相同的策略，除了使用mCherry作为中间入口克隆。VCPWT-EGFP和VCPDKO-EGFP由Nico Dantuma赠送（Addgene质粒编号分别为#23,971和#23,974），并被亚克隆到pCS2+载体中用于体外转录。基于pCS2+VCPWT构建体，使用NEB Gibson Assembly Cloning Kit（NEB #5510）制作了VCP的突变形式（D395G，A232E，R155H）。为了构建TAUWT或TAUP301L融合可转换荧光蛋白Kaede表达质粒，使用了Tol2 13×QUAS模拟载体（p13xQUAS-MCS，α-cry:mCherry）作为骨架。TAUWT或TAUP301L与Kaede通过NEB Gibson Assembly Cloning Kit融合到13×QUAS模拟载体的多个克隆位点中。来自pME-Kaede（Addgene质粒编号#132,972）的Kaede由Nathan Lawson博士赠送。Tol2转座酶mRNA通过mMESSAGE mMACHINE试剂盒（Ambion）合成并储存在-80°C。在注射当天，表达构建体质粒与Tol2转座酶mRNA混合，最终浓度分别为100 ng/ul和50 ng/ul，混合物中1 nl被注射到胚胎的单细胞阶段。在受精后24小时（hpf），选择红色荧光阳性胚胎并培养至成年。三个月后，这些鱼与AB野生型鱼交配，通过筛选红色荧光的表达来鉴定稳定系。全胚免疫荧光染色根据《斑马鱼：一种实用方法》一书中的描述进行。简而言之，胚胎首先用4%的多聚甲醛（PFA）固定，并通过依次用丙酮（100%）、0.1%胰蛋白酶和0.5%透明质酸酶处理来通透。对于冷冻切片，胚胎被嵌入1.5%琼脂糖/5%蔗糖混合溶液中，并在4°C下于30%蔗糖溶液中孵育过夜。切片厚度为20微米，并与以下一抗孵育：Znp1（1:100，DSHB，AB_2315626）、HuC（20 mg/ml，Invitrogen，16A11）、抗切割型Caspase-3（1:50，Cell Signaling Technology，9661S）、Vcp（1:50，Cell Signaling Technology，#2648）和T22（1:100，Invitrogen，ABN-454）。蛋白质印迹法（Western blotting）按照标准的SDS-PAGE协议进行，使用的一抗包括：T46（1:3000，Invitrogen，13–6400）、AT180（1:3000，Invitrogen，MN1040）、PHF（1:3000，Invitrogen，44-752G）、AT8（1:3000，Invitrogen，MN1020）、p62（1:1000，Cell Signaling Technology，5114S）、LC3（1:1000，Novus，NB100-2220）、β-actin（1:1000，DSHB）、Vcp（1:1000，Cell Signaling Technology，#2648）和抗泛素（1:1000，Cell Signaling Technology，#3933）。每个泳道上样10微克蛋白质。信号强度通过SuperSignal West Pico PLUS或West femto PLUS化学发光底物（ThermoFisher）进行显影。印迹图像由ImageQuant™ LAS4000机器捕获。数据通过每个印迹上的β-actin表达进行归一化处理。斑马鱼胚胎中的整体原位杂交链反应-荧光原位杂交（FISH-HCR）FISH-HCR实验按照先前报道的方法进行。HCR试剂，包括探针、发夹结构和缓冲液，购自Molecular Instruments（洛杉矶，加利福尼亚州，美国）。将2.5天受精后（dpf）的胚胎用1×PBS中的4%多聚甲醛（PFA）固定，用甲醇（MeOH）脱水，并在-20°C下储存直至使用。用于HCR-FISH的样本通过1×PBS与0.1%吐温-20/MeOH溶液逐步复水，并在-20°C下用100%丙酮孵育12分钟以进一步通透。为了进一步增强胚胎的通透性，将胚胎在1×PBS中用蛋白酶K处理20分钟，并用4%PFA后固定。处理后的胚胎转移到新的1.5毫升管中，在37°C下用预热的杂交缓冲液预杂交30分钟。将2皮摩尔的vcp-B1 HCR探针组（2微升1微摩尔/升储存液）转移到100微升37°C的杂交缓冲液中，制备探针溶液。将杂交缓冲液替换为探针溶液，并在37°C下孵育样品16小时。为了去除未结合的探针，将胚胎在37°C下用500微升预热的探针洗涤缓冲液洗涤4次，每次15分钟。随后，在室温下用5×SSCT洗涤胚胎3次，每次5分钟。接下来，通过在室温下将样品置于250 μL扩增缓冲液中孵育30分钟来进行预扩增。同时，分别准备6 pmol的发夹B1-488 h1和6 pmol的发夹B1-488 h2（3 μM储备液中的2 μL），通过在95°C下孵育发夹90秒并迅速冷却至室温（在暗处进行）来制备。冷却后，通过将h1和h2发夹转移到100 μL扩增缓冲液中制备发夹溶液。移除预扩增缓冲液，并将样品在含有发夹的扩增缓冲液中于室温下避光孵育16小时。第二天，使用5×SSCT在室温下洗涤胚胎3次，每次20分钟，以去除未结合的扩增剂。为了观察详细的表达模式，将使用HCR-vcp FISH染色的胚胎嵌入含有1%低熔点琼脂糖的玻璃底成像皿中。使用共聚焦显微镜（FV1000，Olympus）获取全胚胎的共聚焦荧光图像。使用Direct-zol™ RNA MiniPrep Kit（Zymo Research）提取胚胎/幼鱼全体的总RNA。使用SuperScript™ III Reverse Transcriptase（Invitrogen）合成cDNA，并使用HelixAmp™ Premium-Pfu Polymerase（Nanohelix）进行扩增。反转录PCR（RT-PCR）的温度循环如下：95°C，10分钟；28个循环（95°C，1分钟；55°C，30秒；72°C，1分钟）；72°C，5分钟。使用CFX connect实时PCR系统（Bio-rad）进行定量PCR（Q-PCR）。在三个重复样本中重复实验三次。使用β-肌动蛋白作为内参以标准化表达水平的变异。数据采用2−ΔΔCT方法进行分析。从GeneTools（http://www.gene-tools.com/）订购了翻译阻断atg5 MO（5ʹ-CAT CCT TGT CAT CTG CCA TTA TCA T-3ʹ）和vcp MO（5ʹ-AAG CCA TAT TGC TT CTC CCG CAA AA-3ʹ）。注射4.06 ng atg5 MO或4.87 ng vcp MO以瞬时敲低基因表达，同时不会引起发育中幼鱼的明显形态缺陷。使用标准对照MO（5ʹ-CCT CTT ACC TCA GTT ACA ATT TAT A-3ʹ）作为阴性对照。化学处理（CPT、NH4Cl、氯喹、MG132）和生存分析将喜树碱（Camptothecin, CPT）（1 µM, Sigma, C9911）、氯化铵（NH4Cl, 50 mM和90 mM, Sigma, A9434）、氯喹（5 mM, Sigma, C6628）和MG132（50 mM, Sigma, M8699）溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，并按指示的工作浓度进行处理。在受精后24小时去壳后，将6孔板中的25个胚胎与这些化学物质一起孵育，并每天更换溶液。对于生存分析，每天计算处理后的幼鱼数量，直至所有幼鱼死亡，实验重复三次。使用mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit（Ambion, AM1340）根据说明书，在体外合成人VCPWT、VCPDKO、VCPD395G、VCPA232E、VCPR155H的功能性mRNA以及作为阴性对照的mCherry，这些mRNA来源于含有相应全长cDNA的NotI线性化pCS2+载体中的质粒。在挽救实验中，将每种mRNA的0.4 ng与吗啉代共同注射。所有注射均在受精卵处于1或2细胞阶段时进行。将受精后2.5天（dpf）的胚胎全身在Trizol溶液中均质化后进行测序。原始数据由Ebiogen公司提供。该过程简要概述如下：（1）RNA质量控制（使用Bioanalyzer 2100系统进行质量检测）；（2）cDNA文库构建（使用NEBNext UltraII Directional RNA-Seq试剂盒）；（3）测序（Illumina HiSeq X10双端测序，每个样本读取量为4G）；（4）修剪（使用BBDuk进行平均Q20修剪）；（5）比对（使用TopHat将测序数据比对到参考基因组，使用Cufflinks计算FPKM值）；（6）标准化（使用EdgeR进行分位数标准化）；（7）差异基因分析（使用ExDEGA生成差异基因主文件）；（8）报告撰写。基因同源体分析通过DAVID网络工具（https://david-d.ncifcrf.gov/）进行。火山图通过Ebiogen公司的内置软件和GraphPad Prism（版本8）生成。为了比较在VCP敲低情况下，野生型Tau（TAUWT）和P301L突变型Tau（TAUP301L）的清除差异，我们采用了先前报告中描述的QF3/QUAS二元系统。表达载体是通过将野生型Tau或P301L突变型Tau与光转换荧光蛋白Kaede的编码基因融合到p13xQUAS中构建的。为了生成VCP敲低情况下的马赛克转基因斑马鱼，将20 pg的pTol2 13xQUAS Tau-Kaede质粒与50 pg的转座酶mRNA以及Ctrl MO或vcp MO一起注射到Tg(elavl3:QF3)稳定品系的1-2细胞阶段胚胎中。对于Tau-Kaede清除实验，选择2 dpf时荧光Tau-Kaede阳性的幼鱼，并在2.5 dpf时对脊髓神经元进行光转换。幼鱼在1×三卡因中麻醉并安装在1%低熔点琼脂糖中。使用Leica DMi8荧光显微镜，通过紫外线照射（355±28 nm，DAPI通道）10秒来进行Kaede的光转换（绿色到红色荧光）。使用Leica荧光成像系统，在16小时内每隔30分钟拍摄一次幼鱼中Tau-Kaede马赛克表达神经元的红色荧光图像，每次拍摄5 µm的Z堆叠，总厚度为200 µm。然后使用3D渲染IMARIS®软件（Oxford instruments）的Surface工具分析荧光图像的体积。为了监测Tau-Kaede的清除情况，在每个时间点量化每个细胞的荧光体积，并将其表示为初始体积的百分比。硫黄素S染色是在2.5 dpf的Tau转基因品系的横向冷冻切片上进行的，方法如先前所述。按照上述程序使用AT8抗体进行免疫染色后，将冷冻切片在黑暗中室温下用含有0.1%硫黄素S的50%乙醇溶液孵育5分钟。然后，将切片依次用50%乙醇溶液和水冲洗，并用DAPI复染。这样，硫黄素S能够特异性地结合并标记含有β-淀粉样蛋白的纤维结构，而DAPI则用于标记细胞核，以便在显微镜下观察和分析。斑马鱼幼鱼行为学实验使用DanioVision观察室进行，并通过EthoVision XT软件（Noldus）进行分析，遵循《斑马鱼神经行为研究协议》一书中的描述。简而言之，将含有6 dpf（受精后6天）斑马鱼幼鱼的6孔板置于观察室中，在黑暗条件下放置5分钟以适应环境。然后开灯，记录幼鱼的运动情况，持续5分钟以进行贴壁行为（thigmotaxis）分析，或进行30秒记录，期间灯光每3秒交替开关一次以进行暗光闪烁（dark-flash）分析。为了检测成年Tau转基因品系的行为，按照先前描述的方法进行了新水箱实验。简而言之，将14个月大的成年斑马鱼转移到标准1升水箱中，并使用普通尼康相机记录其游泳情况，持续10分钟。使用EthoVision XT软件分析游泳模式，将水箱分为两半以区分区域1（底部区域）和区域2（顶部区域）。在视频的最后5分钟内测量鱼在区域2中的时间，同时在整个10分钟内测量鱼的总移动距离。固定的斑马鱼胚胎和幼鱼被嵌入1%低熔点琼脂糖中。使用Olympus SZX16体视显微镜获取明场图像，使用Zeiss LSM800和Olympus FV1000共聚焦显微镜获取共聚焦图像。使用ImageJ（NIH）软件及其neuronJ插件测量运动神经元的轴突长度和分支点（从前端到卵黄延伸的末端）。首先测量感兴趣区域（ROI，由黄色绘图面板定义）内所有轴突（包括主轴突和分支）的总长度，然后除以ROI内主轴突的数量，得到代表主轴突及其分支组合长度的平均值。统计分析使用GraphPad Prism（版本8）进行。误差条代表平均值的标准误差（SEM），并使用学生t检验或单因素方差分析（ANOVA）计算统计显著性，标记为表示p < 0.05；表示p < 0.01；表示p < 0.005；NS表示不显著。为了进行体内研究，如先前所述，准备了9个月大的野生型小鼠。对照组小鼠使用立体定位微量注射器（Stoelting Co.）双侧注射AAV-pSyn1-GFP病毒，而实验组小鼠则注射AAV-pSyn1-TauP301L-GFP和AAV-pSyn1-VCP病毒。小鼠被饲养在光暗周期为12:12小时的环境中，温度维持在18-23°C，湿度在40-60%之间，位于韩国科学技术研究院的无菌设施中。在注射后4周，对小鼠进行行为学和神经病理学检查。所有动物实验均按照韩国科学技术研究院的《实验动物护理和使用指南》进行，并获得韩国科学技术研究院动物护理委员会IACUC的批准（批准号：2020-128）。被动回避笼被分为两个等大的隔间：亮室（白色，由灯泡照明）和暗室（黑色，无照明）。这两个隔间被一个包含自动滑动门的隔板隔开。为了评估小鼠在光暗条件下的基线行为，在实验的第一天，将每只小鼠最初放置在亮室中，背对着暗室（门打开，电击关闭），并允许其在两个隔间中自由探索5分钟。24小时后，当小鼠进入暗室时，门会自动关闭，并向其施加0.5mA的电击，持续2秒。一小时后进行保持试验，测量小鼠进入暗室的潜伏期，最长不超过600秒。每次测试前以及每次试验之间，都会使用70%的乙醇清洁行为装置的所有部分，以确保测试环境的清洁和一致性。从小鼠脑组织或脑组织切片中提取蛋白质。每个脑组织切片单独冲洗后，在Tissue Protein Extraction Buffer（Qiagen, #37623）中孵育。离心后，回收上清液中的提取蛋白，使用Bradford法测定蛋白浓度，并与样品上样缓冲液混合进行采样。最终，将样品加载到SDS-PAGE凝胶上进行电泳。Western Blot分析按照标准的SDS-PAGE协议进行，使用以下一抗：AT8（1:1000，Invitrogen, MN1020），S396（1:10,000，abcam, ab109390），以及β-actin（1:10,000，Santa Cruz, sc-47778）作为内参。使用SuperSignal West Pico PLUS或West femto PLUS化学发光底物（ThermoFisher）进行显色，并通过ImageQuantTM LAS4000机器捕获发光信号。最后，将每个条带的数据通过β-actin的水平进行归一化处理。目标蛋白的免疫荧光染色过程如先前所述。简而言之，大脑用4%多聚甲醛（PFA）固定，并用0.3%Triton X-100渗透。为了进行冷冻切片，大脑在4°C下于30%蔗糖溶液中孵育过夜。切片厚度为30微米，并与一抗孵育，包括针对S202/T205的AT8（1:200，Invitrogen，MN1020），针对S396的抗体（1:200，abcam，ab109390），以及针对S199的抗体（1:200，abcam，ab81268）。荧光信号通过共聚焦显微镜（Olympus，日本）观察。使用NIH Image J软件对图像进行定量评估。在HT22细胞系中的自噬激活剂（雷帕霉素）处理与验证分析雷帕霉素（250 nM，Selleckchem，S1039）、冈田酸（OA）（60 nM，Thermo，J60155）和SMER28（20 μM，Selleckchem，S8240）均溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，并按指示的工作浓度进行应用。将HT22细胞接种于6孔板和24孔板中，然后瞬时转染TauP301L 12小时。冈田酸（OA），一种蛋白磷酸酶抑制剂和内源性Tau磷酸化的诱导剂，与雷帕霉素同时给药24小时。VCP激活剂SMER28在细胞收获前12小时给药。随后，收集细胞进行蛋白质印迹分析或免疫细胞化学分析，以测定磷酸化Tau的水平。使用来自对照组受试者和阿尔茨海默病（AD）患者的死后脑组织进行免疫组织化学和qPCR分析根据波士顿大学阿尔茨海默病中心（BUADC）先前建立的程序，对脑捐赠者（N=20）进行了神经病理学检查：其中十人（N=10）无显著神经退行性疾病（对照组），另外十人（N=10）根据NIA-Reagan标准具有中度或高度AD可能性。对神经病理学进行了评估，包括Braak分期[6]、阿尔茨海默病注册机构联盟（CERAD）β-淀粉样蛋白神经突触斑块评分、边缘系统为主的年龄相关TDP-43脑病神经病理学改变（LATE-NC）分期、海马硬化和路易体病（表1）。除一例以杏仁核为主的路易体病例外，所有病例的路易体均为阴性，而四例病例有LATE-NC（表1）。在图6b中，用于磷酸化Tau（pTau）免疫染色的病例编号为1-3（“对照组”）和11-13（“AD组”），而在图6c中用于VCP mRNA表达的病例编号为4-10（“对照组”）和14-20（“AD组”）。近亲属提供了参与和脑捐赠的知情同意书。通过BUADC中心获得了机构审查委员会的伦理许可批准。本研究由波士顿大学医学院机构审查委员会（协议号H 28974）审查，并获得豁免批准，因为本研究仅包括来自未归类为人类受试者的死后受试者的组织。本研究符合机构监管指南和《赫尔辛基宣言》中的人类受试者保护原则。对于免疫组织化学（IHC），首先将脑组织切片与TBS中的3%过氧化氢孵育30分钟，以淬灭内源性过氧化物酶的活性。用2.5%正常马血清（Vector Laboratories）封闭切片1小时，然后与VCP特异性抗体（Cell Signaling Technology，#2648）孵育24小时。用PBS洗涤三次后，用Vector ABC试剂盒（Vector Laboratories，Inc.，美国）处理组织载玻片。VCP免疫反应性信号用DAB显色剂（Thermo Fisher Scientific，美国）进行显色。接下来，为了验证VCP和pTau的共定位，将抗pTau（S202/T205）抗体（Invitrogen，MN1020）在VCP染色的组织切片上孵育过夜。用TBS洗涤三次后，切片在室温下与ImmPRESS-AP抗小鼠IgG（碱性磷酸酶）聚合物检测试剂（Vector Laboratories：MP-5402）孵育2小时。pTau信号用Vector Red碱性磷酸酶底物试剂盒（Vector Laboratories）进行显色。将双染组织切片通过递增的乙醇梯度[70%、80%和95%（一次）和100%（两次）]返回到二甲苯中，然后进行封片。此外，VCP和pTau染色的切片用苏木精进行复染。神经病理学评估按之前描述的方法进行。使用NIH ImageJ分析神经元中VCP和p-Tau免疫反应性的强度。为了验证人类阿尔茨海默病（AD）患者皮层中VCP mRNA的水平是否发生改变，我们进行了qPCR实验，并将VCP mRNA表达水平标准化为GAPDH。此外，我们还检索并分析了我们在正常受试者和AD患者死后皮层组织的全RNA测序中已发表的数据（欧洲核苷酸档案库（ENA）编号ERP110728）。原文地址：https://link.springer.com/article/10.1007/s00401-024-02804-z#Tab1
注：因文章篇幅有限，所有相关引用文献，以及补充素材可以点击至原文查阅。
苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过六年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。![]()
![]()
