【文献解读】Prox1a通过抑制Cdx1b介导的肠道细胞命运来促进和保护斑马鱼的肝脏发育
文摘
科学
2024-10-22 17:00
江苏
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文献：Hu Y, Luo Z, Wang M, Wu Z, Liu Y, Cheng Z, Sun Y, Xiong JW, Tong X, Zhu Z, Zhang B. Prox1a promotes liver growth and differentiation by repressing cdx1b expression and intestinal fate transition in zebrafish. J Genet Genomics. 2024 Sep 27:S1673-8527(24)00248-0. doi: 10.1016/j.jgg.2024.09.010. Epub ahead of print. PMID: 39343095.
杂志：Journal of Genetics and Genomics
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肝脏是消化系统中一个关键的内胚层衍生多功能器官。Prospero同源盒基因1（Prox1）是肝脏发育的重要转录因子，但其具体功能尚不清楚。本研究表明，prox1a突变的斑马鱼肝脏发育，包括肝内胆道和血管网络的形成，严重受损。我们发现Prox1a对肝脏生长和适当分化至关重要，但并不影响早期肝细胞命运的确定。有趣的是，prox1a缺失会导致异常启动Cdx1b介导的肠道程序，并在肝脏中形成肠腔样结构。通过Morpholino敲降cdx1b可以缓解prox1a突变斑马鱼的肝脏缺陷。最后，染色质免疫沉淀分析显示Prox1a直接结合cdx1b的启动子区域，从而抑制其表达。总体而言，我们的研究表明Prox1a通过抑制Cdx1b介导的肠道细胞命运来促进和保护斑马鱼的肝脏发育。内胚层衍生的消化系统最初形成于一个新生的肠管，该肠管通过动态且高度调控的过程最终发育成消化道和附属器官。肝脏、胰腺和肠道是主要的前肠消化器官，它们在未分化的肠管内共享共同的内胚层祖细胞。包括GATA（如Gata4/5/6）和叉头框A（FoxA）家族成员（如FoxA1/2/3）在内的全内胚层转录因子对于前肠消化系统的发育至关重要。不同消化器官的进一步发育主要由器官命运决定因子引导，这些因子在促进特定器官的形成和维持其身份中发挥关键作用，包括用于肝脏发育的Hhex和Prox1，用于胰腺发育的Pdx1和Ptf1a，以及用于肠道发育的Cdx1b。这些器官命运决定因子之间的潜在相互作用尚未得到广泛研究。肝脏发育可分为两个广泛阶段，这两个阶段在哺乳动物和斑马鱼中是保守的：芽生和生长。芽生阶段包括三个阶段：肝脏祖细胞（肝母细胞）特化、增殖和肝管形成。生长阶段则是通过细胞增殖和分化来迅速增加肝脏的体积。肝核因子（HNFs），包括HNF1、HNF3、HNF4、HNF6和C/EBPs，被确认为维护肝脏发育的可塑性和复杂性的核心转录因子。HNF4A是一个关键的肝核因子，调控一系列对肝细胞（成熟肝细胞；从肝母细胞分化的主要实质性肝细胞，完成肝脏内的各种细胞功能）功能必需的基因，尽管它并不影响早期肝母细胞的特化。由于斑马鱼的外部受精机制和胚胎发育过程中的透明性，使其成为研究内脏器官形成的理想模型。此外，由于斑马鱼的肝脏执行与哺乳动物肝脏相同的所有代谢功能，它也是分析肝脏发育和功能的理想模型。值得注意的是，斑马鱼的肝脏并不是造血器官，因此肝脏发育的功能分析不会受到贫血的影响，而贫血通常是由哺乳动物肝脏缺陷引起的一种致命状态。同源盒转录因子Prox1被认为是小鼠中多种器官和组织细胞分化与形态发生的重要调节因子，包括淋巴系统、晶状体、肝脏、视网膜、胰腺、中枢神经系统、心脏以及主动脉瓣。在Prox1缺失的小鼠中，肝脏命运特化并未受到影响。然而，肝脏的体积显著减少，因为间质侵入受到损害；肝母细胞从肝囊的剥离也严重受阻。这一现象表明Prox1在肝细胞迁移中的作用，但并不涉及肝母细胞的特化。不过，Prox1缺失小鼠在妊娠中期的致死性妨碍了对Prox1在肝脏发育中进一步的功能分析。此外，Prox1缺乏小鼠的肝脏中，肝母细胞对胆管细胞类型的过度承诺也很明显，显示Prox1作为分配肝前体细胞命运的分子开关的新作用。斑马鱼的prox1a在ZFIN数据库（zfin.org）中得到了良好的注释，并且在从一细胞阶段到5天后胚胎发育中在多种组织和器官中表达。研究还表明它参与了缓慢肌纤维的终末分化、肾间器官的成熟、下丘脑神经元的成熟、侧线系统的发育以及淋巴管生成。近期研究还表明Hhex和Prox1a协同作用，决定肝母细胞向肝细胞的分化。尽管prox1a被广泛视为早期肝母细胞标记，且其表达从胚胎肝芽持续到成年肝脏，但其在肝脏发育过程中的具体功能和详细机制仍待探索。在本研究中，通过使用CRISPR/Cas9系统生成prox1a突变的斑马鱼，我们证明了Prox1a对肝脏生长和适当分化是必需的，尽管它并不影响肝脏命运的特化。prox1a的缺失严重破坏了肝脏的结构和功能。有趣的是，prox1a突变的斑马鱼在发育中的肝原基中，早在受精后48小时（hpf）就显示出Cdx1b介导的肠道程序的异位诱导。进一步的研究表明，Prox1a在肝脏中发挥作用，通过直接抑制cdx1b的表达来促进和保护肝脏命运，抑制肠道命运的转变。结果
在斑马鱼中，prox1a在肝脏中持续表达，并且对胚胎发育至关重要
我们首先使用整体原位杂交（WISH）分析了胚胎发育过程中prox1a的表达模式（图1A）。在18小时后胚胎发育（hpf）时，prox1a mRNA主要在晶状体、后侧线原基和体节中被清晰检测到。到24 hpf时，prox1a在晶状体、前脑-中脑边界的条带、后脑的腹部、迁移的侧线原基、肝原基和胰腺原基中被检测到。到36 hpf，prox1a在晶状体、前脑-中脑边界、后脑、胰腺和肝脏中被发现。在发育的后期，prox1a在肝脏中的表达持续存在，但在其他区域逐渐减弱（图1A），这与之前的研究一致。免疫荧光染色还显示Prox1a蛋白在60 hpf时在肝脏中的水平很高（图S1）。我们利用CRISPR/Cas9系统生成了一个prox1a突变等位基因，该基因在第二外显子中有一个7 bp的缺失；这一缺失导致了一个早期终止密码子，可能产生一个仅包含N端146个氨基酸残基的截短蛋白（即缺少同源盒DNA结合域）（图1B和1C）。Western blotting实验确认该突变体几乎完全缺乏野生型Prox1a蛋白（图1D）。尽管在受精后4天（dpf）之前胚胎发育正常，但在prox1a突变体中，约在4.5 dpf时观察到晶状体和消化道周围出现明显水肿（图1E），与之前的报告一致。我们的prox1a突变体在约6 dpf时死亡。![]()
图1 斑马鱼prox1a的表达模式和prox1a突变体的生成我们进行了多个组织特异性标记物的整体原位杂交（WISH），以探究prox1a突变表型的潜在原因。WISH结果显示，在prox1a突变体中，30 hpf时肝原基标记物hhex（血液表达同源盒）的表达水平没有变化，而34 hpf时早期内胚层标记物foxa3（叉头盒A3）和gata6（GATA结合蛋白6）的表达水平也未见变化（图2A），这表明prox1a并不影响肝脏命运的特化。2 dpf时hhex的表达水平以及3 dpf时分化肝细胞标记物cebpa（CCAAT/增强子结合蛋白，alpha）和hnf4a（肝细胞核因子4，alpha）的表达水平在prox1a突变体与其兄弟（包括野生型和杂合型）之间也相似（图2B），暗示肝母细胞的初步分化大致正常。然而，3 dpf（图2C）和4 dpf（图S2A）时，分化肝细胞标记物cp（铜蓝蛋白）、fabp10a（脂肪酸结合蛋白10a）和tfa（转铁蛋白a）的表达水平在prox1a突变体中显著降低。此外，参与肝脏代谢功能的基因gc、uox和ttr在4 dpf时几乎没有表达（图S2B），这表明成熟肝细胞的数量严重减少。有趣的是，胆管细胞标记物krt18（角蛋白18）在prox1a突变体的肝脏区域特异性丧失，而在其他区域的表达未受影响（图2D）。相比之下，胰腺标记物try（胰蛋白酶）和ins（胰岛素）在prox1a突变体中没有受到影响（图2D）。综合来看，这些结果表明，prox1a突变体中的肝细胞扩展和肝脏生长受到抑制，尽管早期肝细胞命运特化是正常的。![]()
图2 在prox1a突变体中，分化肝细胞标志物表达、肝脏结构和代谢功能均受到影响我们使用Tg(fabp10a:DsRed)转基因报告系，该转基因鱼在肝脏中特异性表达DsRed，以监测prox1a突变体的肝脏发育。在4 dpf时，prox1a突变体的肝脏比其同胞的肝脏小得多。令人惊讶的是，prox1a突变体的肝脏还出现了多个腔体（图2E）。肝脏切片的苏木精-伊红（HE）染色证实在4.5 dpf时prox1a突变体肝脏中存在异常腔体（图S3）。接下来，我们使用BODIPY-FL-C5，这是一种绿色荧光染料标记的短链脂肪酸，通过直接喂食追踪脂肪酸的分布并监测消化系统的结构和功能。在5 dpf时，在胚胎喂食BODIPY-FL-C5 4小时后，同胞斑马鱼的荧光脂肪酸分布在胆管网络中；然而，prox1a突变体的荧光染料则大量沉积在肝脏的腔体中，且未观察到肝内胆管结构（图2E）。这些发现表明，prox1a突变体的肝脏无法形成功能正常的 胆管网络。总体而言，以上结果揭示了Prox1a在促进肝细胞分化和成熟中的重要作用。prox1a突变体中的肝脏缺陷很可能是由于2 dpf后肝母细胞的分化和成熟受损，而不是早期肝细胞命运特化的变化所导致的。除了构成每个肝小叶大部分的肝细胞外，功能性肝脏的基本组成还包括含有胆管细胞的肝内胆管网络，以及由血管内皮细胞组成的肝窦。在prox1a突变体中，几乎未检测到胆管细胞，肝内胆管网络（标记为Tg(tp1bglob:hmgb1-mCherry)）在肝脏（标记为MP760:GFP）中完全缺失，这与krt18的WISH结果一致（图2D）。此外，通常在66 hpf时，血管（标记为Tg(flk:mCherry)）围绕肝脏，但在prox1a突变体中，肝脏内的血管侵入被中断。与兄弟斑马鱼肝脏中形成的良好组织化血管网络不同，prox1a突变体的肝脏中血管仅沿着异常腔体的边缘排列（图S4B），这可能是由于肝脏结构组织不良所致。总之，这些结果表明，Prox1a对于肝内胆管和血管网络的正确形成也是必需的。在3 dpf时，肝细胞标志物在prox1a突变体肝脏中的表达显著减少，而由cebpa和hnf4a标记的肝区域，这两者是在分化中的肝细胞中表达的，基本上未受影响。这些看似矛盾的观察结果暗示这个区域存在其他类型的细胞。由于cebpa和hnf4a也在发育中的肠道中表达，我们评估了fabp2的表达，这是成熟肠上皮细胞（即肠上皮细胞）的标志。令人惊讶的是，我们在4 dpf的prox1a突变体肝脏中发现fabp2的异位表达，除了其预期的肠道表达模式（图3A）。这一现象通过针对几个额外的肠道标记物的WISH（原位杂交）得到了确认，包括claudin 15-like a (cldn15la)、溶质载体家族15（寡肽转运蛋白）成员1b (slc15a1b)和 annexin A2b (anxa2b)（图3A）。anxa2b的表达模式特别引人关注，因为它清楚地揭示了prox1a突变体肝脏中的几个气泡，这让人想起了图2E中描绘的异常腔体。![]()
为了深入了解在prox1a突变体中导致肝脏缺陷的分子机制，从4.5 dpf的突变体和同窝胚胎中手动分离了肝脏（这是最早出现可辨识形态缺陷的阶段）（图S5）；提取了总RNA进行RNA测序的转录组分析。与WISH结果一致，肠道标志物在prox1a突变体肝脏中显著上调（图3B）。使用DAVID软件进行的基因本体论分类显示，参与肠道形态发生和肠道发育的基因在prox1a突变体肝脏中显著上调（图3C）。总体而言，上述发现表明肠道细胞命运在prox1a突变体肝脏中被激活，并且肠上皮样细胞在其中异位形成。我们推测Prox1a通过抑制肝脏内肠道命运的指定来促进和维持肝脏身份。在prox1a突变型肝原基中，肠道命运特征被错误地启动为了理解肠道细胞命运是在何时启动的，以及它如何与prox1a突变体肝脏中的原生肝细胞系相互作用，使用了Tg(fabp10a:DsRed)和肠道特异性膜定位转基因报告基因TgBAC(cldn15la-GFP)pd1034（以下简称，Tg(cldn15la-GFP)）来同时监测早期肝脏和肠道发育。令人惊讶的是，在2天后，绿色的肠上皮样细胞出现在prox1a突变体的肝脏区域，尽管在同窝的斑马鱼肝脏中没有发现肠上皮样细胞，这表明在这一阶段，prox1a突变体的肝原基中肠上皮和肝细胞的命运都已启动（图4A）。有趣的是，在2.5 dpf（胚胎发育天数）时，大多数位于prox1a突变体肝脏区域的绿色肠细胞样肠细胞也显示出红色的肝细胞荧光信号，表明存在肝肠混合细胞（图4B；视频S1和S2）。然而，这些混合细胞似乎只是暂时存在，作为肝脏区域的某些中间状态细胞，因为在3.5 dpf和4.5 dpf时，观察到的混合细胞很少，相反，单色荧光细胞（红色或绿色）占主导。在3.5 dpf时，肝发育几乎停止，红色的肝细胞主要存在于prox1a突变体肝脏的外层，而绿色肠细胞样细胞逐渐占据了肝脏区域的中心部分，异常腔体变得明显（图4C）。这些类似肠上皮细胞的细胞继续进行肠道发育的过程，并组织形成一个类似于肠腔的空腔；它们将残留的肝细胞推向肝脏区域的边界，表明肝系谱被肠系谱所竞争（图4D）。总的来说，这些结果说明了在prox1a突变体肝脏中腔体的肠源性，并确认了Prox1a在斑马鱼肝脏发育中起着关键作用，通过促进和维持肝系谱，同时抑制肠系谱的特化。值得注意的是，在prox1a突变体肝脏中观察到的类似肠腔的结构并未与相邻的发育中的肠相连。![]()
cdx1b敲低缓解了prox1a突变体中的肝脏缺陷有相当多的证据表明，Cdx1b是哺乳动物Cdx2的功能等效物，是斑马鱼肠道发育的关键因素。实际上，WISH结果显示，早在48小时后，prox1a突变体的肝脏中就出现了异常的cdx1b表达；其表达持续存在并逐渐增加（图5A）。双色WISH显示prox1a突变体的肝脏区域中fabp10a和cdx1b共表达（图5B），证实了这些肠上皮样细胞的肠道命运。由于cdx1b的异常表达很可能是prox1a突变体肝脏获得肠道命运的最可能原因，我们推测抑制cdx1b表达（例如，通过morpholino [MO]敲低）将能挽救prox1a突变体的肝脏缺陷。当注射低剂量（3纳克）的cdx1b MO时，肠道形态和发育大多未受影响，但肝脏缺陷部分得到缓解，这通过抑制异位anxa2b表达和在prox1a突变体中恢复肝脏大小得到证明（图5C）。抑制cldn15la异位表达和恢复tfa表达确认了cdx1b敲低在prox1a突变体肝脏中的救援效果（图S6；视频S3和S4）。总之，这些结果表明，cdx1b的异位激活是prox1a突变体肝脏区域肠命运启动和肠腔样结构形成的主要原因。![]()
图5 cdx1b敲低部分挽救了prox1a突变体的肝脏表型Prox1a通过结合其启动子区域直接抑制cdx1b的表达因为cdx1b在prox1a突变体的肝脏中异位表达，我们假设Prox1a通过抑制cdx1b的表达来维持肝脏身份。先前的研究表明，Prox1a结合到启动子区域可以负向调控其靶基因的表达；因此，我们推测Prox1a直接结合到cdx1b启动子上以抑制其表达。在斑马鱼cdx1b基因转录起始位点（TSS）周围的序列中预测了潜在的Prox1a结合位点（P1和P2）。将三个片段（包含P1和P2的seq1，包含P1的seq2，以及包含P2的seq3）分别克隆并插入到萤火虫荧光素酶报告载体的上游区域，以测试Prox1a对cdx1b的潜在抑制效应（图6A）。当与prox1a全长编码序列表达质粒共转染到HEK293T细胞时，cdx1b的seq1、seq2和seq3的相对荧光素酶活性分别降低了76.3%、71.5%和66.1%（图6B）。这些结果表明，这两个假定的结合位点由Prox1a调控。相比之下，当与编码来自prox1a突变等位基因的146-氨基酸截短Prox1a蛋白的质粒共转染时，萤火虫荧光素酶报告载体没有显著的抑制效应（图6B）。接下来，我们探索了Prox1a是否能在体内结合到cdx1b启动子区域。使用抗-Prox1a抗体或抗IgG抗体（作为对照）进行染色质免疫沉淀（ChIP）-定量聚合酶链反应（qPCR）实验，实验对象为4天pf的prox1a突变体或野生型胚胎。结果显示，与抗IgG对照抗体相比，野生型胚胎中抗-Prox1a抗体对含有P2的cdx1b启动子区域的结合显著增强（约四倍）；而在prox1a突变体中这种增强现象缺失，表明Prox1a蛋白可以直接结合到cdx1b启动子区域（图6C）。综合我们的发现，Prox1a通过直接抑制cdx1b的转录并防止肠命运转变，促进肝脏生长并维持肝脏发育（图6D）。![]()
图6 Prox1a通过抑制Cdx1b的转录来抑制其表达在这项研究中，我们展示了Prox1a通过抑制Cdx1b介导的肠道命运来促进和维持肝脏发育。根据我们的观察，肝脏与肠道命运转变的最早时间点很可能发生在大约2天后，当时在prox1a突变胚胎的肝脏区域仅能检测到几个异位的肠道细胞，这一点通过Tg(cldn15la-GFP)转基因鱼标记的几个绿色荧光肠道细胞的出现得到证实（图4A）。这一观点也得到了在2天后prox1a突变胚胎肝脏区域检测到弱的异位cdx1b表达的支持（图5A）。肝脏-肠道杂交细胞的短暂存在强烈暗示了由于prox1a的破坏，从肝脏命运到肠道命运的转变过程及其中间状态的存在（图4B）。Hhex和Prox1a是调控肝脏发育的两个最重要的转录因子。同样，在我们的prox1a突变斑马鱼和之前报道的hhex-空突变斑马鱼中，肝脏细胞命运的指定未受影响，但肝脏的生长严重受损，伴随着肠样细胞和结构的异位形成，表明肝脏生长过程也需要被严格调控，以确保肝脏身份的正确维持。在hhex-空突变体中，肠管向前延伸至肝脏形成一个肝内肠管；这些突变体还表现出外分泌胰腺的缺失和pdx1异位表达。然而，在我们的prox1a突变体中，胰腺发育并未受到影响。尽管在我们的prox1a突变体的肝区异位地启动了肠道命运，形成了类似肠腔的结构，但肝脏和肠道保持了它们适当的位置并保持物理上的分离（图4C和4D）。这两种突变体之间的表型差异可能反映了与Hhex和Prox1a相关的肝发育促进功能的相似但不同的水平。尽管如此，hhex突变体和我们的prox1a突变体中都存在残留的肝细胞，这表明这两个基因可能协同作用以维持肝身份并抑制错误的异位肠道命运转变。在最近发表的一篇论文中，Jin等人证明了hhex和prox1a的同时功能丧失导致严重的无肝表型，这证实了这两个主要调控基因在保护斑马鱼肝母细胞向肝细胞分化和扩增中的基础且可能部分冗余的作用。从机制上讲，hhex和prox1a基因都可以被Wnt信号通路激活；然而，它们是否以及如何相互作用以促进肝脏发育尚不完全清楚。有报告称Hhex可以直接调控cdx1b的表达，我们证明了Pox1a也可以通过结合其上游调控序列直接抑制cdx1b的转录。换句话说，cdx1b很可能是Hhex和Prox1a的直接靶基因，这两个因素是协同作用还是并行作用以限制cdx1b的表达需要进一步研究。由于hhex或prox1a突变体中仍然存在残余的肝细胞，但在双重突变体中不存在，因此很可能Hhex和Prox1a在肝脏区域以部分冗余的方式直接抑制cdx1b的表达。有趣的是，在hhex基因缺失突变体中，prox1a的表达被下调，而我们的prox1a突变体中hhex的表达基本上保持正常（图2），这表明hhex在遗传上位于prox1a的上游，尽管prox1a的表达并不完全依赖于Hhex（prox1a的表达并未因hhex的破坏而完全阻断）。胰腺发育在hhex突变体中受到影响，但在prox1a突变体中没有受到影响，这也支持了这一观点。因此，除了直接抑制cdx1b转录外，Hhex还可能通过促进prox1a的表达间接抑制cdx1b的表达。由于消化器官共享共同的内胚层衍生的祖细胞和紧密的空间位置，细胞命运的确定是通过中胚层衍生的指导信号、对器官特异性关键主转录因子的响应以及对来自邻近器官错误诱导信号的抵抗之间微妙的平衡来实现的。在斑马鱼中进行的单细胞谱系追踪揭示了存在双潜能的肝胰腺祖细胞，它们响应来自周围Wnt、Bmp和Fgf信号通路的诱导信号，以促进在14至20小时后肠内胚层前区正常的肝脏和胰腺命运的确定；这些信号的过度表达会增加肝脏发育，以牺牲胰腺发育为代价。在肠道后区过度表达前部特异性的Sox2会导致向胃样表型的前体化，导致小鼠从肠上皮向早期胃上皮的同源转化；相反，在胃粘膜中过表达肠特异性同源框基因Cdx2的转基因小鼠会诱导肠上皮化生，支持其作为肠主控基因的主导作用。hhex功能的丧失会在斑马鱼中诱导形成肝内肠管，并在假定的肝胆管区域异位表达cdx1b和pdx1。斑马鱼中的cdx1b基因（哺乳动物Cdx2的等效功能基因）的无效突变会导致Hhex/Prox1a介导的肝化肠表型，而cdx1b的过度表达则会导致肝脏中肠标记物的异位表达。Prox1a和Cdx1b以细胞自主的方式作用，以促进它们独特的细胞谱系；它们还抑制错误的诱导信号，以保护正常的肝脏和肠发育。肝脏和肠之间存在相互可转换的细胞命运决定，这证实了消化器官之间存在内在的可塑性，并提供了一个协调的前肠内胚层器官发生的理想例子。尽管斑马鱼和小鼠之间的Prox1角色高度保守，但存在一些物种特异性特征。Prox1也是小鼠胰腺外分泌发育的关键调节因子，但我们发现我们的prox1a突变斑马鱼的胰腺发育大多未受影响（图1和图2）。值得注意的是，Prox1对于小鼠和斑马鱼的肝脏发育都是必需的，但这些物种中与Prox1相关的肝脏缺陷具有不同的潜在机制。当在小鼠肠道内胚层条件性失活Prox1时，肝细胞基因表达显著减少，多余的肝母细胞被引导进入胆管细胞谱系，导致突变体肝脏实质中过早出现异常的肝内胆管形成，这表明Prox1在肝细胞/胆管细胞命运决定中充当肝脏分子开关。然而，在我们的prox1a突变斑马鱼的肝脏中，胆管细胞和肝细胞的数量严重减少，表明Prox1a在促进和维持斑马鱼肝脏身份中扮演着更为中心的角色。我们的研究表明，在prox1a突变的斑马鱼的肝脏区域错误地激活了肠道命运，并观察到了肝肠混合细胞的存在（图4B，视频S1和S2），但是异位的肠上皮样细胞与原生肝细胞之间的确切关系仍然不明确。需要精确确定肠上皮样细胞的具体来源，以及在prox1a突变肝脏中两种细胞谱系竞争的机制。更精心设计的谱系追踪和其他遗传操作实验可能会为这些问题提供答案。有趣的是，仅用3纳克MO敲低cdx1b就能部分缓解prox1a突变体肝脏中的异位肠命运，而不影响肠道发育。我们推测，在肝脏中完全抑制异位cdx1b表达可能会改善prox1a突变体的肝脏形成恢复。因为较高剂量的cdx1b MO可能会干扰肠道发育，从而影响对救援效果的评估，因此在探索肠道细胞调节因子异位表达的影响以及消化系统发育期间肝脏-肠道命运决定机制时，肝脏中条件性敲除cdx1b可能是一个更优的方法。肝脏是哺乳动物和斑马鱼中少数几个能够再生的器官之一。高肝脏再生潜力、易于操作、最先进的活体成像技术以及适合大规模化学筛选的特点，使得斑马鱼成为研究肝脏再生及相关疾病的理想模型。在斑马鱼肝脏再生模型中，肝内胆管细胞能够转分化为肝细胞；在严重肝组织损失后，它们在肝细胞恢复中发挥了重要作用。在再生的肝细胞中也观察到了prox1a的重新激活，确定其潜在的分子机制以及与cdx1b表达和/或在肝脏再生期间肠道命运转变的任何关系将是非常有趣的。斑马鱼品系
斑马鱼在标准条件下于28.5°C下饲养和维护。胚胎根据标准方法进行分期。本研究中使用的野生型品系是Tübingen，使用了以下转基因品系：Tg(flk:mCherry)用于标记血管内皮细胞；MP760:GFP用于标记肝细胞；Tg(fabp10a:DsRed)是从中国斑马鱼资源中心购买并用于标记肝细胞；Tg(tp1bglob:hmgb1-mCherry)用于标记肝内胆管网络；TgBAC(cldn15la-GFP)pd1034由杜克大学医学院的Michel Bagnat教授提供，并用于标记肠上皮细胞。体外合成Cas9 mRNA/sgRNA、微注射和突变体的生成斑马鱼密码子优化的Cas9表达质粒被XbaI线性化，并使用T7 mMESSAGE mMACHINE（Ambion，AM1344）进行体外转录，以产生加帽的Cas9 mRNA。针对prox1a基因外显子2的sgRNA是手动设计、合成和纯化的，如之前所述。将400纳克的Cas9 mRNA和100皮克的prox1a sgRNA共注射到单细胞阶段的斑马鱼受精卵中；胚胎被培养用于靶向效率分析和进一步的生殖系传递筛选，以确认prox1a突变体的生成。在所有相关实验中，野生型和杂合子胚胎被用作同胞对照，以确认纯合突变体。使用地高辛标记的反义RNA探针进行全胚原位杂交（WISH）和免疫荧光染色，按照之前描述的方法进行。简要来说，特定阶段的胚胎在4°C下用4%的多聚甲醛固定过夜，然后用100%的乙醇脱水。经过再水化和蛋白酶K处理后，胚胎被转移到预杂交缓冲液中，并在65°C下孵育2到5小时。然后将探针加入缓冲液中，并在65°C下孵育胚胎12到16小时。在胚胎被清洗后，它们在4°C下用抗地高辛的碱性磷酸酶偶联抗体（Sigma, 11093274910）孵育过夜。接下来，胚胎用NBT（Promega, S380C）-BCIP（Promega, S381C）进行染色。信号发展后，胚胎转移到甘油中，并使用配备有AxioCam MRc5电荷耦合器件相机（Zeiss）的Zeiss Stemi 2000C立体显微镜进行拍照。如Jowett（2001）先前描述的那样，进行了双色原位杂交（ISH），使用了标记有地高辛的cdx1b探针和标记有荧光素的fabp10a探针。本ISH实验中用于扩增探针的引物序列在表S1中提供。免疫荧光染色按照先前描述的方法进行。简而言之，胚胎在4°C下用4%的多聚甲醛固定过夜，然后用丙酮渗透，接着用磷酸盐缓冲液加Tween多次冲洗。之后，胚胎在4%的山羊血清中阻断，并在4°C下过夜与抗Prox1抗体（1:200，GeneTex，GTX128354）孵育。胚胎用磷酸盐缓冲液加Tween冲洗5次后，在室温下用抗兔IgG-FITC（1:1,000；Invitrogen，65-6111）孵育4小时。使用荧光显微镜（Zeiss，Imager A1）获取荧光图像。Western blotting实验按照先前描述的方法进行。使用了以下抗体：抗-Prox1兔多克隆抗体（GeneTex，GTX128354）和抗-β-Tubulin小鼠单克隆抗体（Abbkine，A01030）。胚胎用4%的多聚甲醛固定后，用磷酸盐缓冲液清洗，并在10%、20%和30%的蔗糖溶液中分别孵育。接着，胚胎在Tissue-Tek OCT中孵育并冷冻在冷冻模具中。获得连续的6微米厚的冷冻切片，并在北大分子医学研究所的实验动物中心进行HE染色。共聚焦图像使用蔡司LSM 710 NLO共聚焦激光显微镜获取，三维投影使用Imaris图像分析软件生成。Tg(fabp10a:DsRed)与prox1a杂合突变体杂交，以促进肝脏标记和分离。将prox1a杂合体杂交的后代收集起来，并在4.5 dpf时用三卡因（Sigma, A-5040）麻醉；每个胚胎肝脏在立体显微镜下使用带有细针头的注射器移除，然后在荧光显微镜下转移到TRIzol（Thermo Fisher, 15596026）。prox1a突变体或兄弟姐妹的三十个肝脏被合并为一个组；收集了三个组作为生物学重复，然后使用RNeasy Micro Kit（Qiagen, 74004）进行RNA提取。使用NEB Next Poly(A) mRNA磁性分离模块（New England Biolabs, E7490）和NEB Next Ultra定向RNA文库制备试剂盒（New England Biolabs, E7420）为下一代RNA测序准备了微尺度RNA文库。RNA测序数据使用DAVID软件（https://david.ncifcrf.gov）进行了基因本体分类分析。MO反义寡核苷酸溶解在水中，浓度为1毫摩尔。将cdx1b MO（2-4ng v；Gene Tools）注射到由prox1a杂合突变体杂交产生的单细胞阶段斑马鱼胚胎的细胞质中；在4天后收集胚胎进行双色原位杂交实验。cdx1b ATG MO的序列为5’-CATTTTTTCTGGTGGCTCCAGTGC-3’。HEK293T细胞在含有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中培养，条件为95%空气和5% CO2的湿润环境，温度保持在37°C。细胞接种于24孔板中，并使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）共转染适量的质粒。转染后24小时收集细胞，然后按照制造商的说明使用双荧光素酶报告基因检测系统（Promega, E1910）进行荧光素酶报告基因检测。为了构建报告质粒，将cdx1b TSS周围的三个不同片段（seq1、seq2和seq3）克隆并插入到pGL3-荧光素酶载体中。对于表达质粒的构建，将斑马鱼prox1a全长和146个氨基酸截短的cDNAs分别克隆到pcDNA3.1(+)载体中。同时共转染了一个海肾荧光素酶表达质粒作为内对照。以下是用于扩增这三个片段的引物序列：seq1和seq2的正向引物：5’-GCTATACGGGCTTGTAGTCCC-3’，seq1和seq3的反向引物：5’-CGCATCCAGTCGTAAGGGTT-3’，seq2的反向引物：5’-GGTGGCTCCAGTGCATAGTT-3’，seq3的正向引物：5’-AACTATGCACTGGAGCCACC-3’。
胚胎在4 dpf时被收获并用2.2%的甲醛交联。使用0.125 M的甘氨酸停止交联反应；在胚胎用磷酸盐缓冲液洗涤后，通过在细胞裂解缓冲液中破碎胚胎来分离核（10 mM Tris-Cl，[pH 7.5]，10 mM NaCl，0.5% IGEPAL（CA-630，Sigma，I8896）和蛋白酶抑制剂）。将核沉淀并溶解在核裂解缓冲液中（50 mM Tris-Cl，[pH 7.5]，10 mM乙二胺四乙酸[EDTA]，1%十二烷基硫酸钠[SDS]和蛋白酶抑制剂），然后使用超声波破碎（Bioruptor Plus Diagenode，B01020001）以产生200至600 bp的DNA片段。在预清除步骤之后，每个ChIP实验使用25 µg的染色质片段；每个样本的10%被保存用于输入分析。染色质片段与3微克抗-Prox1抗体（GeneTex, GTX128354）在4°C下孵育过夜，然后在室温下用蛋白A Sepharose孵育1小时；以染色质-IgG免疫复合物作为对照。蛋白-DNA复合物在4°C的旋转平台上用以下溶液连续洗涤8分钟，每次使用1毫升：低盐洗涤缓冲液（150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl [pH 8.0], 2 mM EDTA, 1% Triton X-100, 和 0.1% SDS），高盐洗涤缓冲液（500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl [pH 8.0], 2 mM EDTA, 1% Triton X-100, 和 0.1% SDS），LiCl洗涤缓冲液（250 mM LiCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 1 mM EDTA, 1% Na-deoxycholate, 和 1% NP-40），以及两次用Tris-EDTA缓冲液（10 mM Tris-HCl [pH 8.0] 和 1 mM EDTA）洗涤。Chelex 100悬浮液（Bio-Rad）被用来逆转染色质交联。将附着在珠子上的DNA在100微升的10% Chelex悬浮液中煮沸10分钟。随后，通过在55°C下用蛋白酶K消化30分钟来去除蛋白质，然后煮沸10分钟以灭活蛋白酶K。大约70微升的上清液被转移到一个新的管中。上清液中的DNA被用作qPCR分析的模板。用于扩增P2（cdx1b启动子中的潜在Prox1结合位点P2）的正向和反向引物分别是5’-TTCCGTAAGACACCCAAGCC-3’和5’-TAATTCCCGGGACGTGATGG-3’。进行了双侧未配对的Student's t检验以进行统计分析，结果以平均值 ± 标准差（SDs）表示。误差条表示至少三次独立实验的标准差。星号表示统计显著性（*, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001）。原文地址：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1673852724002480?via%3Dihub注：因文章篇幅有限，所有相关引用文献，以及补充素材可以点击至原文查阅。
苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过六年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。
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