影响因子：8.1
C9orf72基因中的六核苷酸重复扩展是肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）的最常见遗传原因。大量证据表明，二肽重复（DPR）蛋白是导致细胞和动物模型中神经损伤的重要因素之一。我们构建了一个基于C9orf72基因的ALS/FTD纯RAN翻译斑马鱼模型。通过分析转基因斑马鱼胚胎及成体的样本，检测RAN翻译的DPR蛋白的存在，并评估成体斑马鱼的运动缺陷。采用C9orf72细胞模型和胚胎斑马鱼模型，进一步探讨了低温治疗性温度管理（TTM）作为治疗C9orf72-ALS/FTD的潜在方案。
我们首次报告了一个纯RAN翻译的C9orf72-ALS/FTD斑马鱼模型，表现出明显的DPR病理和渐进性的运动功能下降。我们还发现，低温TTM能显著减少C9orf72-ALS/FTD细胞模型和胚胎斑马鱼中的DPR蛋白。
本文描述的转基因模型为进一步研究RAN翻译在C9orf72-ALS/FTD中的作用提供了一个中等通量的体内研究工具，并帮助我们更好地理解神经保护策略的机制。低温TTM显示了作为治疗C9orf72-ALS/FTD的一个潜在方案的前景。
**肌萎缩侧索硬化症（ALS）**是一种致命的神经退行性疾病，其主要特征是大脑皮层中上运动神经元和脊髓中下运动神经元的渐进性退化。疾病起初表现为骨骼肌退化，并最终因呼吸衰竭而导致死亡，通常在症状发作后的2至4年内。绝大多数ALS病例是散发性的（sALS），占90%至95%。另外5%至10%的病例则有家族史（fALS），并具有明显的遗传倾向。C9orf72基因被认为是目前与ALS发病机制最相关的基因。2011年，一篇具有里程碑意义的论文指出，C9orf72基因中位于外显子1a和1b之间的第一个内含子的多态性六核苷酸重复扩展（HREs）是ALS的主要遗传原因，约40%的家族性ALS（fALS）病例或总体ALS病例的10%由此引起。C9orf72基因的HREs也是家族性额颞叶痴呆（FTD）的主要原因。FTD是一类神经认知障碍，其主要表现为由于额叶和/或颞叶皮质的退化而引发的认知或语言障碍。由于FTD和ALS在发病机制、临床表现和遗传学上有诸多相似之处，因此C9orf72-ALS/FTD被作为C9orf72相关疾病的统称，用于描述同时表现出ALS和FTD症状的患者。
尽管健康个体的C9orf72基因中通常有30个以内的六核苷酸重复，C9orf72-ALS/FTD患者则通常有几百到几千个重复扩展。C9orf72-ALS/FTD的病理机制涉及功能丧失和功能获得的多种途径，主要分为三类：1）C9orf72基因转录减少导致的C9orf72蛋白功能丧失；2）由于正义链和反义链重复RNA的积累或对RNA结合蛋白功能的改变引发的有毒功能获得；3）通过非AUG（RAN）翻译产生的有毒二肽重复（DPR）蛋白。虽然RAN翻译的具体机制尚不完全清楚，但它通常涉及高度结构化的RNA，并且通过CUG或GUG等近似起始密码子在缺乏经典AUG密码子的情况下在多个阅读框架中进行。
近年来，随着C9orf72-ALS/FTD新型动物模型的发展，临床前研究人员得以深入研究导致ALS发病和进展的复杂病理机制。斑马鱼（Danio rerio）作为一种有潜力的临床前工具，越来越多地被用于研究包括C9orf72-ALS/FTD在内的人类疾病中的基因功能。与传统啮齿动物模型相比，斑马鱼模型具有成本低、通量高的优势。此外，斑马鱼胚胎发育快速、透明且易于进行基因操作，为中高通量的治疗筛选提供了理想的条件。斑马鱼基因组与人类基因有70%的同源性，超过80%与人类疾病相关的基因在斑马鱼中有对应基因，这突显了其在研究健康与疾病中的脊椎动物基因功能时的实用性。
低温治疗性温度管理（TTM），或称治疗性低温，已被确定为治疗神经退行性疾病的一种非侵入性替代疗法。低温TTM在多种急性神经和心血管疾病中展现出保护作用，包括中风、创伤性脑损伤（TBI）、缺氧缺血性脑病和心脏骤停等。通过这些研究，临床治疗方案得到了优化，并且与神经保护相关的机制得到了探索。尽管这些机制尚未完全阐明，但低温对细胞代谢、冷激蛋白/激素的生成、自由基的生成、突触可塑性以及血脑屏障（BBB）破坏等方面的影响已被确定为可能的作用机制。然而，低温TTM在C9orf72-ALS/FTD中的潜在治疗作用尚未被研究。
本研究旨在基于已有的工作，利用C9orf72-ALS/FTD的细胞模型和斑马鱼模型，探讨低温TTM在C9orf72-ALS/FTD中的作用。我们首先描述了一个新型的纯RAN翻译C9orf72-ALS/FTD斑马鱼模型，该模型表现出显著的RAN翻译DPR病理及渐进性运动能力下降，重现了临床组织的病理特征和临床表现。进一步研究表明，在C9orf72细胞模型和C9orf72-ALS/FTD斑马鱼胚胎中实施低温TTM后，DPR种类显著减少。
结果
C9orf72相关疾病中产生的五种DPR在多种中枢神经系统（CNS）的体内和体外模型中表现出毒性。因此，我们的首要目标是表征每个转基因斑马鱼系中产生的DPR种类。通过对受精后5天的斑马鱼胚胎裂解物进行Western blot分析，以确定三种2mer（对照组）、五种正义链（S）和四种反义链（AS）创始转基因斑马鱼系中是否存在RAN翻译的V5标记DPR种类。Western blot分析显示，不同转基因系之间的RAN介导的V5表达水平有所不同，范围从高表达、中等表达到低表达。在三种2mer（对照组）创始转基因系中未检测到任何V5表达。与其他转基因创始系相比，正义链S5和反义链AS1表现出最高水平的V5标记DPR表达，这与DsRed应激反应呈相关性。因此，正义链S5和反义链AS1被选定用于进一步表征胚胎和成年组织中的DPR种类。
V5免疫染色显示，在正义链S5和反义链AS1斑马鱼中，多个带有V5标签的DPR蛋白在不同分子量下被表达（图3A, B）。正义链S5主要表达poly(GP) DPRs，同时也有少量poly(GR) DPRs（见图3A）。相比之下，反义链AS1显著表达了poly(GP)和poly(PR) DPRs（见图3B）。
在受精后5天的胚胎中检测到DPRs，这为研究DPR病理机制以及筛选可能调节该有害途径的药物提供了宝贵的工具。然而，C9orf72引发的毒性主要集中在ALS患者的中枢神经系统（CNS）和肌肉组织中。因此，下一步的目标是检测并表征成年斑马鱼肌肉和脑组织裂解物中的DPR种类。在正义链S5和反义链AS1成年斑马鱼的脑和肌肉组织裂解物中均检测到了带有V5标签的DPR种类（见图3C, D）。在反义链AS1斑马鱼中，DPR的分子量较正义链S5更高，无论是在脑还是肌肉组织中。
总结来看，正义链S5和反义链AS1在受精后5天和12个月时均产生多种DPR蛋白。Western blot分析表明，核糖体滑动和移码可能导致了超出预测分子量的多种DPR蛋白生成。DPR的表达位置与C9orf72-ALS/FTD患者中的观察结果一致，进一步支持了该模型作为筛选工具在调节斑马鱼胚胎和成年体内DPR生成方面的应用价值。
为了评估成年转基因斑马鱼的神经肌肉完整性，测试了其游泳耐力。游泳通道表现分析显示，无论在6个月还是12个月时，正义链S5和反义链AS1斑马鱼的游泳耐力均低于转基因2mer（对照）组。耐力下降的量化结果显示，正义链S5和反义链AS1转基因斑马鱼在6个月至12个月之间游泳通道表现显著恶化。而在转基因2mer（对照）组中未观察到此类恶化，进一步证明了RAN介导的V5-DPR表达在正义链S5和反义链AS1转基因系中的神经毒性作用（图4A–C）。
总结来看，游泳通道表现的缺陷在斑马鱼6个月大时就已显现，并且这种游泳耐力的下降在12个月时加剧。成年斑马鱼游泳耐力下降为衡量疾病进展提供了重要的表型参数。
为进一步深化该研究，探讨了低温处理及其引发的冷激反应作为减少RAN翻译DPR生成的机制。为此，我们将45次正义链或43次反义链重复的RAN翻译报告载体转染入HEK293T、N2A和HeLa细胞中。Western blot分析显示，在所有细胞模型中，转染细胞的正义链和反义链细胞裂解物中均产生了显著的RAN翻译V5-DPR。在各对照条件下均未检测到V5-DPR。当细胞在32°C低温冷却时，与37°C常温条件相比，所有细胞模型中的正义链和反义链C9orf72-ALS/FTD细胞的V5-DPR表达均显著减少（图5A–D）。此外，冷激蛋白CIRBP和RNA结合基序3（RBM3）的免疫染色显示，在接受低温处理的细胞中这两种蛋白均显著增加，表明冷激反应被激活（图5E–G）。综上所述，低温冷却在三种不同的哺乳动物细胞系中减少了RAN翻译的V5-DPR表达，这与冷激反应的显著增强密切相关。
在此基础上，我们进一步将低温冷却方案应用于C9orf72-ALS/FTD转基因斑马鱼胚胎，以评估其在体内的疗效。胚胎在受精后2至5天内分别置于常温（28°C）和低温（22°C）条件下培养。对胚胎裂解物进行Western blot分析，结果显示，在低温条件下，正义链S5转基因斑马鱼的V5-DPR表达显著减少（常温组为100% ± 29.83，低温组为18.6% ± 13.93，***p = 0.0006；见图6A, B）。此外，低温处理的反义链AS1转基因胚胎相比常温对照组，poly(GP)表达也显著减少（常温组为100% ± 33.54，低温组为58.58% ± 23.16，*p = 0.0320；见图6E, F）。
我们进一步使用MSD ELISA平台分析了C9orf72-ALS/FTD正义链和反义链胚胎裂解物中的poly(GP)表达。与Western blot分析结果一致，MSD ELISA分析表明，低温冷却后poly(GP) DPR种类的表达显著减少。该效应在正义链S5胚胎（低温组为17.7% ± 1.32，****p < 0.0001；见图6C, D）和反义链AS1胚胎中均有所体现（低温组为53.1% ± 7.00，***p = 0.0003；见图6G, H）。综上所述，这些结果进一步证明了低温冷却对RAN翻译及随后的DPR生成的强大抑制作用。
我们描述了一种新型C9orf72-ALS/FTD转基因斑马鱼RAN翻译模型，该模型在胚胎和成年斑马鱼中均表达多种RAN翻译的DPR蛋白。这一模型成功重现了患者中观察到的主要细胞病理特征以及显著的运动功能下降。因此，该模型为进一步研究C9orf72-ALS/FTD中RAN翻译的病理机制，以及筛选和开发新型治疗方法提供了新的临床前研究工具。我们通过实验表明，降低环境温度的低温TTM能够减少C9orf72-ALS/FTD体外模型和斑马鱼模型中的RAN翻译DPR种类。这是首个研究表明低温TTM在C9orf72-ALS/FTD中具有潜在治疗作用的研究。
在受精后5天的正义链S5和反义链AS1斑马鱼胚胎中检测到了多种RAN翻译的DPR蛋白。通过在所有三个阅读框中引入V5标签，可以更高效地筛选体内RAN翻译的全局变化。这些纯重复扩展模型重现了在C9orf72-ALS/FTD患者中观察到的HRE RAN翻译机制，并将有助于进一步研究RAN翻译及其所产生的毒性DPR蛋白如何加速或加剧ALS的进展，从而为治疗干预提供新的靶点。
近年来，斑马鱼作为一种重要的临床前研究工具，特别是在神经科学领域中研究复杂脑部疾病的应用逐渐增多。斑马鱼与人类的基因组具有70%的同源性，其中枢神经系统结构包括哺乳动物大脑的主要区域，并且包含许多相同的神经递质。此外，斑马鱼的运动系统与人类高度相似，许多与家族性ALS/FTD发病风险相关的基因（包括C9orf72）在斑马鱼中也能找到对应基因。
此前已经开发出多个瞬时和稳定的ALS斑马鱼模型，用以模拟人类C9orf72-ALS/FTD的细胞病理和行为表型。例如，一个表达32和72次正义链（GGGGCC）重复的瞬时转基因斑马鱼模型在受精后24小时表现出凋亡标志物增加和DPR表达增强，而表达仅8次正义链重复的转基因胚胎中未见这些标志物。这表明产生DPR蛋白和诱发细胞死亡需要达到一定的重复次数阈值。其他研究发现，运动表现和重复扩展长度之间存在关联，拥有≤10次重复扩展的斑马鱼并未表现出运动轴突缺陷或运动能力下降，而含有37、70或90次重复扩展的转基因系则出现了显著的运动轴突异常。这些研究与我们之前的研究一致，我们曾在一篇论文中详细描述了表达89次六核苷酸重复的转基因斑马鱼表现出的运动能力下降和早期死亡。在本研究中，我们未在表达2次正义链重复（2mer对照组）的转基因斑马鱼中观察到RAN翻译的DPR蛋白表达或运动能力下降。然而，表达45次正义链（GGGGCC）或39次反义链（CCCCGG）重复的斑马鱼均表现出多种RAN翻译的DPR蛋白表达以及运动能力逐步下降，支持了此前的研究结果。
尽管本研究集中于疾病的RAN介导DPR的神经毒性机制，但尚未探讨其他C9orf72-ALS/FTD的疾病标志。此前的研究表明，C9orf72-ALS/FTD的功能获得性斑马鱼和细胞模型中，正义链或反义链HRE的表达均导致了运动神经毒性，然而并未报告TDP-43错位现象。值得一提的是，基于miRNA的C9orf72基因沉默在C9orf72-ALS/FTD的功能丧失性斑马鱼模型中引发了TDP-43错位和运动神经元丢失。对成年斑马鱼中枢神经系统和外周组织的运动神经元完整性及TDP-43蛋白病变的进一步表征，可能会揭示更多RAN翻译C9orf72-ALS/FTD斑马鱼模型中的疾病标志。
目标温度管理（TTM），即以前称为治疗性低温，是通过调节核心体温来预防发热、诱导低温或维持正常体温的干预措施。低温的神经保护作用已在多项针对急性神经疾病的临床前和临床研究中得到探讨。通过这些研究，治疗方案得到了优化，并且神经保护背后的机制也得到了深入研究。虽然这些机制尚未完全明确，但已发现多条神经保护通路。
RBM3是最早发现的冷激蛋白之一。在低温TTM后，RBM3通过BDNF-TrkB信号通路上调，抑制磷酸化ERK分支激活，这是神经元结构可塑性中的重要通路。此外，RBM3表达定位于树突，并通过结合核糖体亚基（特别是reticulon 3，RTN3）增加局部和全局蛋白合成。RTN3与突触形成和神经可塑性相关。In vitro研究表明，RBM3在低温TTM的神经保护作用中起重要作用。Chip等人使用PC12细胞表明，使用特定的短干扰RNA阻断RBM3可消除32°C低温的神经保护作用。此外，即使在没有低温的情况下，RBM3的过表达也能减少凋亡标志物。RBM3在神经退行性疾病动物模型中的作用也得到了进一步证实。低温TTM显著改善了阿尔茨海默病和朊病毒病小鼠模型的神经功能，但RBM3的敲低通过慢病毒介导后，神经保护能力下降。此外，RBM3过表达小鼠表现出更长的寿命、神经退行性疾病的发病时间延迟以及行为表现改善。最近的一篇论文指出，RBM3的前mRNA可通过温度变化发生可变剪接。未表征的外显子3a在34°C下不会被包含在mRNA中，但在38°C时出现。通过反义寡核苷酸靶向外显子3a，能够在朊病毒病小鼠模型中持续增加RBM3表达并提供神经保护。这些机制有望在C9orf72-ALS/FTD的背景下进一步探索。
CIRBP在低温TTM的神经保护作用中也发挥了关键作用。CIRBP是一种RNA结合因子，其表达在低温后增加。轻度低温可增加大脑皮层、下丘脑和海马体中CIRBP的表达。在in vitro研究中，使用大鼠原代皮层神经元表明，CIRBP对抗H₂O₂诱导的细胞凋亡具有保护作用。实验性脑缺血模型显示，与常温条件相比，轻度低温显著减少了活性氧（ROS）和颈静脉一氧化氮的释放。此外，在创伤性脑损伤的大鼠模型中，轻度低温的抗凋亡作用在CIRBP siRNA沉默后消失，表明CIRBP在低温TTM中的神经保护作用显著。
在本研究中，将C9orf72-ALS/FTD细胞模型冷却至32°C，显著增加了RBM3和CIRBP蛋白的表达，同时伴随DPR表达的显著减少。在C9orf72-ALS/FTD斑马鱼模型中也观察到了低温TTM对DPR表达的显著抑制作用。连接低温TTM与RAN翻译DPR减少的机制需要进一步研究。已有研究表明，冷环境可增强蛋白酶体活性并减少表达ALS相关FUS突变蛋白的秀丽隐杆线虫中的蛋白聚集。未来研究可进一步区分DPR生成减少与DPR清除增强，以阐明低温TTM后影响RAN翻译DPR表达的机制。
临床前研究揭示了低温TTM在治疗中的关键通路。该研究逐步推进至随机临床试验，揭示了低温TTM在人体疾病中的应用潜力。低温TTM主要应用于严重急性损伤，并且通常仅在短时间内使用。低温TTM最广泛应用于心脏骤停患者。在一项大规模多中心随机对照试验中，心脏骤停后低温组（HACA研究小组）发现轻度低温能够改善神经功能预后并降低心脏骤停患者的死亡率。如今，美国心脏协会（AHA）建议将核心体温降低至32°C至34°C作为心脏骤停患者的治疗方案。
低温TTM还被应用于缺氧缺血性脑病（HIE）的治疗。最近对28项随机对照试验的荟萃分析发现，低温TTM可降低中重度HIE新生儿的死亡风险，研究得出结论，医疗专业人员应考虑将此作为HIE新生儿的治疗手段。
低温TTM在缺血性中风的研究中也有所探索。van der Worp等人的荟萃分析得出结论，治疗性低温可在动物模型中改善约三分之一的脑缺血预后，并且这些条件可以在临床环境中实现。然而，尽管临床前研究取得了积极成果，但至今低温TTM尚未成功转化为缺血性中风患者的有效治疗方法。包含12项研究的荟萃分析未能在缺血性中风患者中发现低温TTM的额外益处。此外，接受治疗的患者不良事件更多，可能是由于患者共病增加了不良事件的风险。未来的研究需要解决共病对治疗结果的影响。
为了将临床前研究转化为安全且有效的治疗选择，研究人员需继续努力标准化治疗方案和结果评估，并进一步研究年龄、性别和共病对这些结果的影响。
为了改进低温TTM方案，已有研究尝试使用涂有水凝胶的水循环传导垫或冷流体静脉输注来替代更传统的冷却系统。在低温冷却期间的辅助治疗也可能减少不良事件的风险。这些替代和优化的冷却方法与辅助治疗方案相结合，使得低温诱导和维持更加可控，可能为未来临床研究提供更安全、实用的选择。这些不同治疗方法对实验和临床结果的影响需要在特定疾病背景下进行定义，精心设计的研究对于确保患者安全和确定临床疗效至关重要。
本文中描述的转基因模型提供了一种中等通量的体内研究工具，用于进一步研究RAN翻译在C9orf72-ALS/FTD中的毒性作用，并进一步理解支持任何神经保护策略的机制。与当前的小鼠C9orf72-ALS/FTD模型相比，所描述的斑马鱼模型提供了一个更高的通量前临床模型，可用于评估靶点疗效和在非哺乳动物系统中的运动改善。
未来的工作旨在进一步探索利用C9orf72-ALS/FTD细胞模型和描述的RAN翻译斑马鱼模型来研究低体温治疗（TTM）的机制。这将使我们更深入地理解低体温如何影响C9orf72-ALS/FTD组织病理学和运动表现。此外，结合低体温治疗方案与其他神经保护策略可能会产生协同效应，正如之前对神经退行性疾病的研究所强调的那样。这项研究的最终目标是最终将这些临床前数据转化为C9orf72-ALS/FTD的有效治疗方法。迄今为止已发表的大量安全性和有效性数据清楚地表明了低体温治疗在神经系统疾病中的潜在益处。
转基因构建体
使用表达45个重复的C9orf72正向六核苷酸GGGGCC（G4C2）和43个反向六核苷酸CCCCGG（C4G2）的RAN翻译质粒，并在所有3个开放阅读框中带有V5标签，将其用于在斑马鱼质粒中亚克隆重复表达卡匣，并在泛素（Ubi）启动子下。Sanger测序显示，45个正向和39个反向重复被亚克隆到斑马鱼质粒中，这些质粒共同表达红色荧光蛋白（DsRed），并在热休克蛋白Hsp70应激反应启动子下。将这些构建物或含有两个G4C2重复的质粒（2mer对照）注射到胚胎中，以生成转基因斑马鱼系，如先前所述。潜在的GUG起始密码子位于45个感觉重复序列上游的0和+1阅读框架中的第12和17个核苷酸处。潜在的GUG起始密码子存在于39个反义重复序列上游的0和-1阅读框架中的第10和5个核苷酸处。构建的示意图如图1所示。斑马鱼系按照既定做法进行维护。
在用MS-222（Sigma）进行最终麻醉后，对整个斑马鱼胚胎进行了Western Blotting的处理。Laemmli缓冲液以每只胚胎8微升的比例加入麻醉后的斑马鱼胚胎中，使用Precellys 24（Bertin Instruments）组织匀浆器（2,500转/分，2次×20秒）进行匀浆，然后在13,000 g下离心10分钟。收集上清液，并在进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western Blotting前，在95°C下煮沸10分钟。
使用的商业鼠源初级抗体包括α-V5（Sigma，R960）、α-微管蛋白（Abcam，ab6046）以及兔源初级抗体α-DsRed（Clontech，632-496）、α-冷诱导RNA结合蛋白（CIRBP；Proteintech，10,209-2-AP）和α-RBM3（Proteintech，14,363-1-AP）。所有针对多聚(GP)、多聚(GR)和多聚(PR)的DPR特异性兔源抗体都是定制生成的（Eurogentec），并在内部使用亲和膜层析法纯化。使用了物种特异性的HRP标记次级抗体，并通过LiCor Odyssey Fc成像系统对Western Blotting进行化学发光成像。
使用初始流速为6.6厘米/秒的游泳隧道测试斑马鱼游泳能力，每5分钟增加6.6厘米/秒，直到达到最大流速39.5厘米/秒。数据按照之前描述的方法进行分析。C9orf72-ALS/FTD转基因斑马鱼可能在游泳隧道评估后立即表现出恢复延迟，表现为游泳活动减少。
细胞在37°C的培养箱中以5% CO2维持。HEK293T和HeLa细胞在Dulbecco改良的鹰式培养基（Sigma）中培养，补充了10%胎牛血清（FBS；Gibco）和5 U ml−1青霉素-链霉素（Lonza）。Neuro-2a（N2A）（ATCC）细胞在Dulbecco改良的鹰式培养基（Sigma）中培养，补充了10% FBS（Gibco）、5 U ml−1青霉素-链霉素（Lonza）和5 mM钠丙酮酸。HEK293T、HeLa和N2A细胞使用3.5 μg PEI/ml培养基和OptiMEM的十分之一体积进行转染，使用的质粒量为700 ng，采用的是24孔板格式。大约每孔接种50,000个HEK293T细胞、50,000个HeLa细胞和75,000个N2A细胞。
转染后24小时，细胞被清洗并更换完全培养基。在37°C（正常体温）或32°C（低体温）下孵育48小时后，提取蛋白质。细胞用冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗，随后在冰冷的裂解缓冲液（50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 10%甘油, 0.5% Triton X-100, 和 1 mM EDTA, 蛋白酶抑制剂混合物[Sigma], 1 mM DTT）中裂解10分钟。然后将提取物在4°C下以17,000 g的速度离心5分钟。使用Bradford试剂（BioRAD）对提取物进行定量，通过SDS-PAGE分离，电转移到硝酸纤维素膜上，并用相应的初级抗体进行检测。
胚胎在受精后 2 天通过人工去卵黄囊处理，并依据 DsRed 表达来鉴定转基因阳性鱼。仅选择正常发育且外观健康的胚胎，并具有预期的荧光模式，用于筛选。胚胎在受精后2至5天在28°C（常温）或22°C（低温）下孵育。随后使用MS-222（Sigma）对斑马鱼幼鱼进行终末麻醉，并在Precellys 24组织匀浆器中以1X RIPA溶液（Merck-Millipore）匀浆，然后在17,000 g的条件下离心15分钟。收集上清液用于下游分析。
建立了一种基于定制兔α-GP抗体的多(GP) Meso Scale Discovery (MSD)酶联免疫吸附试验（ELISA），并基于先前描述的方法。简而言之，在1X tris缓冲盐水（TBS）中稀释的30μl多(GP)抗体（4μg/ml−1）被加入到每个孔的96孔SECTOR板（MSD）中，并在4°C下孵育过夜。用1X TBS-Tween-20（0.1%）清洗板子三次，然后在150μl 3%牛奶-TBS-T溶液中封闭1小时摇晃（RT，700转/分钟）。再次用TBS-T清洗板子，并向每个孔加入50μl GP(7)标准品（0-400 ng/ml）或斑马鱼裂解物，摇晃孵育2小时（RT，700转/分钟）。plates再次用TBS-T洗涤三次，每孔加入50微升MSD磺酸标签标记的链霉亲和素（1μg/ml−1）和生物素化的聚(GP)抗体（2μg/ml−1；Eurogentec)稀释在封闭溶液中，摇晃孵育2小时（室温，700转/分钟）。再次洗涤孔板，加入150微升2倍MSD读缓冲液-T，并使用MESO SECTOR 2400成像仪对板子进行成像。使用含有七个甘氨酸-脯氨酸重复序列（GP7）的人工合成聚(GP)肽作为标准曲线，在进行标准化之前内插测定反应值。
数据通过单因素方差分析（ANOVA）与Tukey事后检验或多因素方差分析（ANOVA）与Sidak事后检验进行多重比较分析，t检验或Kaplan Meier分析，如在适当的图例中所示。显著性表示为*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，以及****p < 0.0001。
原文地址：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/ana.27068
