影响因子：14.7
组织在形成相似形状的结构时，会经历不同的形态发生过程。在心脏中，心室和心房的心肌细胞都会构建内部结构，以实现高效收缩。心室壁的形成（小梁化）是通过心肌细胞脱落开始的，而心肌细胞如何构建心房壁目前还不清楚。通过对斑马鱼的长期成像研究，我们发现至少25%的心房心肌细胞沿着心脏的长轴伸长。这些细胞形态的改变导致细胞插入和会聚增厚，从而形成内部的肌肉网络。我们还测试了对心室小梁形成重要的Nrg/ErbB和Notch信号通路，但没有发现它们对心房肌肉网络形成有任何作用。相反，数据表明心房心肌细胞的伸长由Yap蛋白调控，而Yap并未参与心室小梁化的过程。总体来看，这些数据表明，心房和心室的内部肌肉结构由不同的细胞和分子机制构建。
脊椎动物的心脏由不同的腔室组成：心房负责接收血液，而心室则将血液泵出心脏并进入血液循环。心房和心室的肌肉壁都由复杂的内部结构组成，这些结构对各腔室的功能至关重要。然而，目前尚不清楚这些内部肌肉结构是在不同腔室中通过相似还是不同的过程形成的。
心室形成的复杂内部肌肉网络称为小梁，它增加了组织的厚度和收缩力，因而对心脏功能发挥关键作用。心房也形成了类似的复杂肌肉网络，其中大的终嵴分裂成较细的梳状肌和巴赫曼束。这些结构在动作电位的传播和心房收缩中发挥重要作用。由于心脏畸形是最常见的先天性缺陷之一，研究胚胎心脏如何发育以形成其结构一直是一个重点领域。此外，心房结构异常会引发如心律失常等严重症状。
已知心房和心室的心肌细胞在分化过程中具有不同的细胞和分子特征。在斑马鱼胚胎中，心房心肌细胞最初表现为较为扁平的形态，而心室心肌细胞则呈现为立方形。在分子水平上，心房和心室心肌细胞的特化和分化由不同的信号通路调控。例如，BMP信号通路促进心房心肌细胞的特化，而FGF信号通路则促进心室心肌细胞的特化。此外，在单细胞RNA测序数据中，心房和心室的心肌细胞分别形成不同的簇，且表达不同的基因，例如鱼类和哺乳动物中，心房心肌细胞表达MYH6基因，而心室心肌细胞则表达MYH7基因。然而，这些细胞和分子差异如何影响形态发生机制，目前尚未明确。
心室小梁化的发生已被广泛研究。当部分心室心肌细胞脱离极化的上皮结构并在心腔内形成多细胞簇时，小梁便开始形成。这个脱落过程需要Nrg/ErbB和Notch信号的参与。此外，血流和心脏收缩力也在促进心内膜中nrg2a基因的表达，从而部分调控心室小梁化。然而，心房壁形成的细胞和分子因素仍不清楚。研究表明，在小鸡的发育过程中，内壁心肌细胞与外壁心肌细胞在基因表达和增殖特性上逐渐表现出差异。此外，一项在斑马鱼上的克隆研究表明，受精后7天时，心房心肌细胞呈现扁平和圆形，而在14天时，心房出现由杆状心肌细胞组成的网状结构。然而，心房形态发生的确切机制仍不明确。在本研究中，我们利用斑马鱼模型对这一过程进行了研究，因为它可以进行高分辨率的长期成像。
在斑马鱼中，受精后24小时（hpf）心脏开始收缩，并可看到心脏管的形成，随后心脏开始弯曲，逐渐形成心房和心室，这两个腔室通过房室管（AVC）分隔。接着心脏经历一系列形态发生事件，包括从大约56 hpf开始的房室瓣形成，60 hpf左右开始的心室小梁形成，以及心房腔室的形态发生。
为了确定心房形态发生的开始时间，我们对心房发育进行了长期成像，记录了可能导致内部肌肉结构形成的细胞行为变化。借助Airyscan成像技术（图1a），我们获得了心房的清晰3D图像（图1b, b'; 补充视频1）。为了研究心房心肌细胞的行为，我们从100到148 hpf对斑马鱼幼体每24小时成像一次，发现部分心肌细胞在这段时间内逐渐延长（图1c–e’）。为了确定细胞延长的开始时间，我们对心房心肌细胞进行了3D分割，获得了描述细胞形状的3D形态指数，结果显示一些心房心肌细胞在76 hpf时开始延长，且随着时间推移，这种形态变化变得更加显著（图1f, g）；在100 hpf时，约有15%的心房心肌细胞在延长，而在124 hpf时，这一比例上升到约25%（图1g）。在这一过程中，心房心肌细胞沿着心脏长轴呈双向排列（图1b', h–h”’）。这些数据表明，心房心肌细胞的行为与心室小梁形成过程中心肌细胞的顶端收缩和脱落行为不同，且与之前提出的心房形态发生机制（细胞分裂、芽生和分支）也有所区别。
我们推测，心房心肌细胞的延长可能推动了组织结构的变化，从而对内部肌肉结构的形成至关重要。为了验证这一假设，我们对心房心肌细胞马赛克表达细胞质标记的幼体心脏进行了成像，这种方法能够可靠地追踪单个细胞（图2a–d）。然后我们在细胞延长前后对相邻和延长的心肌细胞进行3D分割。为了更好地展示，我们分别创建了不透明（图2a'–d'）和透明（图2a''–d''）的3D表面模型。通过这种方法，我们观察到细胞延长导致细胞嵌入，表现为mTagBFP-（白色表面）和mTagBFP+（紫色表面）心房心肌细胞的重叠（图2a–d'''）。为了理解这些跳动的心肌细胞在嵌入过程中如何保持连接，我们检查了在细胞嵌入区域心肌特异性钙黏蛋白N-cadherin的定位（图2a'''–d'''）。随着心房心肌细胞的延长和嵌入，N-cadherin从侧膜的连续分布重新定位到顶端和基底膜的点状分布（图2a'''–d'''; 补充图1a–b''），这与心室心肌细胞脱落过程中观察到的情况相似。此外，我们还注意到，延长的心肌细胞形成了顶端-基底的基于N-cadherin的黏附结构，而保持圆形的心肌细胞则保持侧面的N-cadherin黏附结构（补充图1a–g）。另外，与心室的致密层心肌细胞不同，一些心房心肌细胞与邻近细胞分离，表现为缺乏N-cadherin的肌动蛋白环（补充图1h, h'; 补充图1i, i'），这可能对应于成熟心房中已经描述的心肌缺失区域。综上所述，我们观察到心房心肌细胞的延长通过细胞嵌入导致了局部多层化，并伴随着细胞间黏附的变化。
我们接着探讨了由细胞嵌入驱动的多层化（也称为会聚增厚）是否会形成心房壁内的肌肉结构。通过构建心房心肌在心肌细胞延长前（图2e, e’）和延长后（图2f, f’）的3D表面模型，我们观察到7天孵化后（dpf）的心房内表面出现了脊状结构。因此，我们推测这些脊状结构的产生是心房内肌肉结构形成的第一步，这些结构在14 dpf时清晰可见（图3a, a’）。
为了验证延长的心肌细胞是否构建了这些复杂的心房肌肉结构，我们首先在14 dpf时将它们从其余的心肌组织中分离出来（图3a–c; 补充视频2）。我们发现，心房内部的肌肉结构完全由延长的心肌细胞组成（图3a'–c'）。接着，我们使用马赛克标记法追踪了从124 hpf（补充图2a–c）到14 dpf（补充图2a'–c'）的相同心房心肌细胞，观察到在124 hpf时延长的心肌细胞在14 dpf时形成了内部的肌肉结构。此外，通过将这种马赛克标记法与长期成像结合，我们对比了124 hpf和14 dpf时mTagBFP+心房心肌细胞的形态指数。分析结果显示，一部分在124 hpf时为圆形的心肌细胞到14 dpf时已经延长，导致了较高的F比值（补充图2d）。然而，延长的心肌细胞从未恢复为圆形，始终保持延长的形态（补充图2e）。在14 dpf时，心房内层的所有心肌细胞都已经延长，而外层则同时存在延长和圆形的心肌细胞（补充图2f）。综合来看，这些数据表明心肌细胞的延长和嵌入构建了斑马鱼心房内部的肌肉结构。
随后，我们进一步探讨了心房心肌细胞延长是否与肌原纤维组织的变化相关联。在14 dpf时，我们注意到由延长的心肌细胞构成的心房内肌肉网络中的肌原纤维均朝同一方向排列，而外层心肌细胞的肌原纤维则显示出随机分布（补充图3a–c’）。我们还追踪了延长的心房心肌细胞的肌原纤维，发现它们在细胞延长之前呈现随机取向（补充图3d, d’）。然而，在心肌细胞延长过程中，这些肌原纤维开始沿着细胞延长的方向排列，并且显著变厚（补充图3d–g）。这些数据表明，心房心肌细胞的延长可能调节了肌原纤维的组织结构，从而可能影响心脏的收缩能力。因此，我们推测心房心肌细胞的延长有助于增强收缩力。为了验证这一假设，我们首先测量了心肌细胞延长前（74 hfp）和延长后（124 hpf）心房的射血分数（补充图3h–i'），结果显示这段时间内射血分数显著增加（补充图3j）。综上所述，这些数据表明，心房心肌细胞的延长及其伴随的肌原纤维成熟对增强心房的收缩力至关重要。
膜突触的形成和稳定受细胞收缩力的调节，而细胞收缩力则依赖于非肌球蛋白的活性。为了检验非肌球蛋白活性在CM伸长中的作用，我们使用myl7启动子在CM中过表达了非肌球蛋白MYL9的组成型活性（CA）和显性负性（DN）形式。过表达MYL9CA显著增加了心房CM的伸长，而过表达MYL9DN则减少了其伸长（补充图4a-d）。由于myl7从15小时受精后（hpf）开始活跃，我们检验了心房CM伸长是否可以提前诱导开始，或者是否存在一种机制阻止其提前伸长。令人惊讶的是，尽管通过EGFP表达评估到MYL9CA在早期阶段就存在于CM中，但在对照和MYL9CA过表达幼鱼中，心房CM伸长仅在76 hpf后才开始观察到（补充图4e-k）。然而，与对照相比，在76 hpf和100 hpf时，MYL9CA过表达幼鱼中伸长的心房CM数量至少增加了一倍（补充图4e-k）。
接下来，我们假设在CM伸长之前形成的小膜突触对于出现较大的定向突触是必需的。为了验证这一假设，我们确定了野生型、CM特异性MYL9DN过表达（补充图5a-c，补充表1）和IRSp53DN过表达（补充图5d-f，补充表1）幼鱼在76 hpf时心房中每个CM的平均膜突触数量。在MYL9DN过表达幼鱼中，小膜突触的数量并未减少（补充图5a-c，补充表1），这表明CM特异性MYL9DN过表达并未通过抑制小突触的形成来损害心房CM的伸长。相反，IRSp53DN过表达似乎减少了小膜突触的数量（补充图5e，表1），这可能导致观察到的CM伸长和方向性受损（图4e-h''）。综上所述，这些数据表明心房CM伸长是一个由膜突触形成驱动的主动过程。
鉴于Notch和Nrg/ErbB信号通路在心脏形态发生的各个方面，包括心室壁形成中的重要性，我们旨在检验它们是否也参与心房壁的形成。我们首先在心房CM伸长过程中搜索了心房中的Notch信号通路活性，但在100至148小时受精后（hpf）期间，我们并未在心房中观察到Notch报告基因的表达（补充图6a-c）。与这些数据一致，在72至124 hpf期间使用Notch抑制剂处理后，伸长的心房CM数量和心房汇聚增厚的过程并未发生显著变化（补充图6d-f）。此外，尽管在幼鱼心房中存在nrg2a的表达，但与同基因型野生型同胞相比，在124 hpf的erbb2突变体的心房中，伸长CM的数量或内心肌脊的形成并未出现显著差异（补充图6g-i）。我们还测试了心脏收缩力的作用，因为它也是心脏形态发生各个方面（包括心室壁形成）所必需的，但在使用BDM处理从96至124 hpf导致收缩力降低后，心房中伸长CM的数量或内心肌脊的形成并未受到显著影响（补充图6j-l）。amhc/myh6突变体中缺乏心房CM收缩也并未阻断心房CM的伸长或交错，但稍微降低了伸长心房CM的百分比（补充图6m-o）。然而，BDM处理幼鱼和myh6突变体中心房腔的异常扩张本身可能导致心房CM的伸长，因此，需要单细胞分辨率的方法来进一步探讨心房CM收缩力在其伸长中的作用。综上所述，这些数据表明心室小梁形成的关键调节因子，如Notch和Nrg/ErbB信号通路，对于心房形态发生并不是必需的。
为了揭示心房肌细胞（CM）伸长的分子机制，这种伸长在100小时受精后（hpf）时清晰可见（图1），我们通过荧光激活细胞分选（FACS）分离了48和72 hpf的心房CM，并进行了批量RNA测序（补充图7）。对72 hpf与48 hpf相比显著上调的基因进行无偏见的通路富集分析，发现了促进细胞周期进程的基因（补充图8a）。我们使用从48、72、96和120 hpf开始的24小时EdU脉冲测定法，寻找大多数心房CM进入S期的时间点（补充图8b）。有趣的是，我们在96 hpf时发现了最高比例的EdU+心房CM（补充图8b）。此外，我们在124 hpf时观察到心房CM数量的显著增加（补充图8c）。综上所述，这些数据表明在72 hpf时，心房CM上调了促进细胞周期进程的基因表达，并随后增殖。因此，心房CM伸长的峰值（图1f）和心房CM增殖的峰值（补充图8c）在124 hpf时重合。
Hippo通路是众所周知的细胞增殖和组织形态发生的调节因子，而在72 hpf时显著上调的多个增殖基因，包括pcna、mcm基因、pola2、cdk1、ccna2、trip13、orc5、esco2和cdkn1a，都是已知的Hippo靶标（补充图8a）。在斑马鱼心脏发育过程中，通过lats1和lats2失活抑制Hippo通路会导致心房CM数量的增加。因此，我们假设在野生型幼鱼中74 hpf后观察到的心房CM增殖增加是通过Hippo通路活性的变化发生的。与这一假设一致，我们在48和72 hpf时的心房CM中观察到了Hippo通路基因的表达，包括转录效应子基因yap1和wwtr1（补充图8d）。然后，我们使用之前在斑马鱼心脏发育过程中验证过的Yap1抗体，并在76 hpf时观察到约10%的心房CM细胞核中有免疫染色，这一比例在100 hpf时增加到约25%，然后在124 hpf时减少到约15%（补充图8e-f’）。然而，在伸长的心房CM（在124 hpf时检查了6个心脏）中，并未明显观察到核内Yap1的免疫染色（补充图8g, g’）。
接下来，我们测试了Yap1是否对心房形态发生是必需的。我们从72到124 hpf将幼鱼与K-975或IWR-1这两种之前在斑马鱼中使用过的抑制剂一起孵育。K-975阻断了Yap与其共激活剂Tead之间的相互作用，而IWR-1是一种tankyrase抑制剂，它可以将Yap滞留在细胞质内。K-975和IWR-1处理都减少了心房CM的伸长（图5a-h’）。尽管IWR-1还可以抑制Wnt/β-catenin信号通路，但我们在心房CM中并未观察到Wnt/β-catenin报告基因的活性（补充图9a-c），并且在心房CM中过表达Wnt/β-catenin通路抑制剂Axin1也并未显著影响心房CM的伸长（补充图9d-f）。
在细胞水平上，心房CM的伸长是一个由细胞骨架变化驱动的活跃过程（图4）。为了研究Hippo通路是否位于这些细胞骨架变化的上游或下游，我们用K-975或IWR-1处理了过表达MYL9CA的幼鱼及其对照同胞，并观察到在两种处理条件下，伸长的心房CM数量都有所恢复（补充图10a-g）。然而，K-975或IWR-1处理似乎并未影响心房CM形成小膜突起的能力（补充图10h-k，补充表1）。综上所述，这些数据表明心房CM的伸长至少部分受Hippo通路的调控，且对CM伸长重要的细胞骨架变化（而非小膜突起的形成）发生在Hippo通路的下游。
Hippo通路的抑制对心房CM伸长产生了负面影响，因此我们测试了这种抑制是否也会影响心脏功能（补充图3）。K-975和IWR-1处理阻断了对照幼鱼中观察到的肌原纤维厚度和排列的增加（补充图11a-f）。对DMSO处理与K-975或IWR-1处理的幼鱼的心房内肌表面进行分析，结果显示在124 hpf时复杂的脊状结构消失（补充图11h-j）。此外，心房射血分数（补充图11g）在两种处理下均显著降低，而心率（补充图11k）则未受影响，这表明心房CM交错和肌原纤维组织的减少影响了心房腔的收缩。
为了探究Yap1如何在单细胞水平上调节心房CM的伸长，我们利用了一种带有核定位信号（NLS）的斑马鱼Yap1显性负性（DN）形式。我们将这个NLSYap1DN构建体克隆到热休克诱导型启动子（hsp70l:lox-TagBFP-STOP-lox-NLS-Yap1DN-t2a-mCherry，简称hsp70l:LSL-NLSYap1DN）的下游，并将得到的质粒注射到myh6:creERT2胚胎中，这使得在cre介导的重组后可以在心房CM中特异性表达（图6a-c）。在他莫昔芬处理和热休克后，通过mCherry的表达可以观察到Yap1DN的过表达特异性地存在于心房CM中，且呈现马赛克状（图6c）。值得注意的是，对野生型（TagBFP+）和Yap1DN阳性（mCherry+）的伸长CM百分比进行量化发现，过表达Yap1DN的伸长CM更多（图6d），这表明Yap活性受损的CM更有可能伸长。因此，全局抑制Yap活性减少了伸长的心房CM数量，而Yap活性受损的CM则更有可能伸长。为了探究这一明显矛盾的原因，我们更仔细地观察了心房CM的增殖情况，并发现全局抑制Yap活性也减少了心房CM的数量（补充图12a, b）。为了研究CM分裂和伸长之间的关系，我们将幼鱼从72到124 hpf与DNA复制抑制剂Aphidicolin一起孵育，这导致心房CM数量减少（补充图12c），这与之前的数据一致。然而，这种处理并未影响伸长心房CM的绝对数量，从而导致其百分比增加（补充图12d）。这些数据使我们提出，在76 hpf后，心房心肌变得异质，至少包含两种类型的心房CM：圆形的Yap1+ CM和伸长的Yap1- CM，且Yap1调节心房CM伸长独立于其对细胞分裂的影响。为了验证这一模型，我们使用与之前马赛克实验相同的构建体生成了一个稳定的hsp70l:LSL-NLSyap1DN转基因系（图6a-d）。使用这个新系在早期发育阶段全局过表达DNyap1会导致心脏环化缺陷（图6e, f），这与之前关于斑马鱼中Yap1功能早期丧失的研究一致。然后，我们在与myh6:creERT2转基因体进行重组后，在所有心房CM中过表达DNYap1，并在124 hpf时观察到伸长的心房CM数量显著减少（图6g-i），这与之前通过药理学方法抑制Yap1功能时观察到的结果一致（图5）。综上所述，这些数据表明Yap1参与心房CM的伸长。
鉴于Hippo通路活性在心房形态发生中似乎是必需的，而Taz/Wwtr1在心室壁形成过程中也发挥重要作用，我们假设Hippo通路在调节心房和心室肌肉结构形成中均发挥作用。为了验证这一假设，我们在124小时受精后（hpf）对wwtr1突变体和同窝野生型纯合子幼鱼的心房进行了成像，并观察到没有心房形态发生缺陷（图7a-c）。相反，使用K-975、IWR-1或Rac1抑制剂处理并没有阻止小梁化（trabeculation）的开始（图7d-h）。这些数据共同表明，心房和心室肌肉结构形成的开始是通过不同的细胞和分子机制发生的（图7i）。这一发现强调了心脏发育过程中不同区域（心房和心室）在结构和功能上的特异性，以及它们各自独特的调控机制。
我们的高分辨率3D活体成像显示，在早期幼体阶段，一部分心房心肌细胞开始延伸膜突起，导致其形态变长。这种细胞延长引发了细胞嵌入和心房心肌层的会聚增厚，最终形成了内部的肌肉网络。
心房心肌细胞的延长可能是腔室膨胀的间接结果，也可能是一种主动过程。我们的观察和对心房心肌细胞突起活动的操控表明，这实际上是一个主动过程。这些心房心肌细胞沿着心脏的长轴双向延长，向房室管（AVC）和窦房结方向伸展。因此，这些特殊的心脏细胞群体可能提供信号以刺激心房心肌细胞的突起活动或引导它们的方向性。基于此，我们测试了在心房心肌细胞延长中Wnt/β-连环蛋白活性的作用，该活性在AVC和窦房结中存在，但未观察到明显影响。有趣的是，只有一部分心房心肌细胞发生了延长，这引出了关于这些细胞如何被选择以及是什么限制了其数量的关键问题。此外，并非所有延长的心房心肌细胞都会进入内部肌肉结构，一些细胞至少到14天孵化后仍停留在外层。选择形成内部脊状结构的心肌细胞与形成外层的心肌细胞的细胞和分子机制，以及外层混合形态心肌细胞的生理意义，仍有待研究。可能的解释是，保持部分圆形心房心肌细胞对于在相邻细胞延长和嵌入时维持组织完整性是必要的。
尽管Notch信号在限制心室心肌细胞脱落数量方面很重要，但它似乎没有在心房心肌细胞选择中发挥类似作用。相反，抑制Yap活性减少了心房心肌细胞的延长，但并未阻止心室小梁的形成。然而，抑制Yap活性导致小梁单元数量减少，wwtr1突变体也表现出小梁形成缺陷，这表明Hippo信号通路参与了心室壁的形成，可能通过直接调节心肌细胞行为或间接通过心内膜或心外膜发挥作用。
在心房心肌细胞延长的同时，我们观察到了细胞的增殖；虽然这两个过程似乎是相互排斥的（正如Aphidicolin处理实验所表明的），但药理学抑制Yap活性同时减少了这两个过程。此外，我们在部分心房心肌细胞的细胞核中检测到了Yap1，并且马赛克式过表达Yap1DN自发地促进了这些细胞的延长，而在所有心房心肌细胞中过表达Yap1DN则抑制了细胞的延长。这些现象表明，心房肌层中需要异质性Yap1活性来促进心肌细胞的延长。Yap已被证明在多种发育过程中发挥作用，包括细胞增殖和细胞迁移，因此需要更复杂的工具和方法来深入研究其在心房形态发生中的作用。
在细胞延长之后，心房心肌层通过细胞嵌入和会聚增厚从单层上皮转变为复杂的结构。会聚增厚最早是在两栖类动物原肠胚形成过程中发生的，它在内胚层卷入之前出现。虽然会聚增厚的细胞和分子基础仍需进一步研究，但最近的研究表明，它独立于背腹模式化。值得注意的是，与心房心肌细胞嵌入相似，会聚增厚过程中涉及在细胞收缩性控制下形成定向的片状伪足，研究不同发育背景下这种现象的相似性将是一个有趣的方向。
最终，心室和心房腔室在功能上有显著不同；心室需要构建强壮的肌肉壁以将血液泵向全身，而心房需要提供一个快速传播动作电位的结构。一些心房心肌细胞的延长可能为实现这一快速冲动传播提供了条件。
斑马鱼处理
斑马鱼幼鱼在标准条件下饲养。所有转基因幼鱼均预先进行荧光筛选。在实验前，对非突变幼鱼进行发育缺陷（如心包水肿、内脏反位、心脏大小或形状异常）的筛查，若存在任何缺陷，则将其从样本池中排除。
成年鱼在3.5升的水族箱中以每升10尾鱼的密度饲养，饲养参数如下：水温：27–27.5°C；光照：黑暗周期：14:10；pH值：7.0–7.5；电导率：750-800 µS/cm。根据鱼的年龄，每天喂食3–5次颗粒饲料和活饵（卤虫）。每年至少进行一次健康监测。所有动物实验均遵循欧洲议会关于科学用途动物保护的第2010/63/EU号指令的指导原则，并获得达姆施塔特地区政府动物保护委员会（Tierschutzkommission）的批准（参考编号：B2/2057）。样本量根据3R原则（减少、替代、优化）和欧洲第2010/63/EU号指令进行计算，以尽量减少使用的动物数量。
为了构建膜定位的myl7:lck-mScarlet质粒，插入片段通过引物退火生成（正向引物：5’-GCGGCCATCGAATTGGGATCCCCACCATGGGCTGCGTGTGCAGCAGCAACCCCGAG-3’；反向引物：5’-GCCCTTGCTCACGGGTACCACCGGTCGCTCGGGGTTGCTGCTGCACACGCAGCCCAT-3’）。通过BamHI/AgeI限制性酶切制备Tol2质粒-0.8myl7:H2B-mScarlet，并将lck插入片段插入其中。为了生成心房心肌细胞（CM）胞质定位的-4.5myh6:mTagBFP2质粒，从-0.8myl7:mTagBFP2（由Rashmi Priya博士赠送）中通过PCR扩增mTagBFP2插入片段（正向引物：5’-TCTAGAGCGGCCATCGAATTGGGGATCCCCACCATGGTGTCTAAG-3’；反向引物：5’-GCCGCCAGTGTGATGGATATCTTAATTAAGCTTGTGCCCCAGTTTGCTAG-3’），并将其插入包含-4.5myh6启动子的Tol2载体中（由Thomas Juan博士赠送）。为了构建可诱导的Yap1DN质粒hsp70l:loxP-TagBFP-STOP-loxP-NLS-yap1DN-t2A-mCherry，首先使用XhoI/AgeI对Tol2质粒hsp70l:loxP-TagBFP-STOP-loxP-cxcl18b-t2A-mCherry（由Pinelopi Goumenaki赠送）进行酶切，以去除cxcl18b片段。然后，通过PCR扩增pCS2 NLSyap1DN质粒（由Virginie Lecaudey教授赠送）中的NLSyap1DN片段（正向引物：5’-ATTATACGAAGTTATACCGGTATGGCTCCAAAGAAGAAGCG-3’；反向引物：5’-GCCCTCTCCACTGCCCTCGAGCCTCAGTCTCTCCTTCTCTA-3’），并将其插入可诱导载体中。所有融合实验均使用5X In-Fusion HD Enzyme Premix（Takara, ST0345）进行。
为了研究斑马鱼心脏的发育和功能，我们使用了多种转基因质粒进行斑马鱼的转基因操作。这些质粒包括：-0.8myl7:mTagBFP2（心肌细胞胞质标记物）、myl7:PH-Akt1-tdTomato-PEST（心肌细胞膜突起标记物）和hsp70l:loxP-TagBFP-STOP-loxP-NLSyap1DN-t2A-mCherry（可诱导的Yap1DN过表达）。这些Tol2质粒与Tol2 mRNA一起被注射到单细胞期的野生型斑马鱼胚胎中。
对于成像马赛克心脏（Fig. 4a）的实验，我们同时注射了-0.8myl7:mTagBFP2、myl7:PH-Akt1-tdTomato-PEST和hsp70l:loxP-TagBFP-STOP-loxP-NLSyap1DN-t2A-mCherry质粒。这些质粒在胚胎中随机整合，导致不同细胞表达不同的荧光蛋白，从而允许我们观察心脏的不同结构和功能区域。
对于需要建立稳定遗传系的实验，我们注射了-0.8myl7:lck-mScarlet、-4.5myh6:mTagBFP2和hsp70l:loxP-TagBFP-STOP-loxP-NLS-yap1DN-t2A-mCherry质粒。这些胚胎被培养至成年，并通过两代杂交筛选出稳定表达荧光蛋白的后代。
为了进一步研究斑马鱼心脏中的蛋白质表达和定位，我们对幼鱼进行了免疫染色。与之前的描述类似，但省略了去卵黄步骤以保持心房的完整性。幼鱼在0.1%三卡因/卵水中孵育后，在4%多聚甲醛中4°C过夜固定，然后用PBS/0.1%吐温洗涤三次。经过1小时在PBS/0.1%吐温/5µg蛋白酶K中的处理后，幼鱼在PBS/1%BSA/1%DMSO/0.5%Triton-X（PBDT）中洗涤三次，并在PBDT/10%山羊血清中封闭至少1小时。然后，将一抗与新鲜封闭缓冲液混合，并在4°C下与幼鱼孵育过夜。为了提高信噪比，Yap多克隆抗体在4°C下与斑马鱼幼鱼预孵育。使用的一抗包括：抗Yap1（兔多克隆，由Virginie Lecaudey教授赠送，1:200稀释）和抗eGFP（鸡单克隆，ab13970 Abcam，1:200稀释）。使用的二抗包括：Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 647（1:500稀释，Thermo Fisher Scientific，山羊来源）。
为了研究斑马鱼心脏中的细胞增殖，我们使用Tg(myl7:H2B-mScarlet)转基因幼鱼进行了EdU染色。从48、72、96或120小时受精后（hpf）开始，幼鱼在含有500µM EdU和0.5% DMSO的1-苯基-2-硫脲（PTU）卵水中孵育24小时。EdU孵育后，幼鱼在0.2%三卡因中浸泡以停止心跳，然后在4%多聚甲醛中室温固定2小时。接下来，按照制造商的说明（Invitrogen, C10340）进行30分钟的click-it反应，并在洗涤后立即进行共聚焦成像。
斑马鱼幼鱼被置于6孔板中，每孔6-7条幼鱼，用4毫升含有PTU的卵水进行孵育，其中已加入相应浓度的储备试剂。孵育时间取决于具体实验。每24小时更换一次溶液，直至成像前幼鱼始终保持在溶液中。本研究中使用的浓度是基于浓度梯度测试选择的，我们使用了尽可能低的浓度来诱导心脏表型，该浓度始终低于触发整体毒性的浓度。对照组处理使用了含有与DMSO等效浓度的PTU卵水。
本研究中使用的药理学试剂包括：NSC23766（Rac1抑制剂，在受精后72至124小时（hpf）以150µM浓度孵育，或在受精后35至72小时以200µM浓度孵育，Selleck chemicals S8031），K-975（Yap/Tead抑制剂，在受精后72至124小时以4µM浓度孵育，或在受精后72至100小时以4µM浓度孵育，或在受精后35至72小时以3µM浓度孵育，Selleck chemicals E1329），IWR-1（tankyrase抑制剂，在受精后72至124小时以10µM浓度孵育，或在受精后72至100小时以10µM浓度孵育，或在受精后35至72小时以12.5µM浓度孵育，Selleck chemicals S7086），LY411575（γ-分泌酶抑制剂，在受精后72至124小时以2.5µM浓度孵育，Selleck chemicals S2714），2,3-丁二酮单肟（BDM）（非选择性肌球蛋白ATP酶抑制剂，在受精后96至124小时以7.5mM浓度孵育，Sigma-Aldrich B0753），阿菲迪霉素（DNA聚合酶α抑制剂，在受精后72至124小时以150µM浓度孵育，Sigma-Aldrich A0781）。
为了激活hsp70l启动子，幼鱼每天接受一次39°C热处理1小时。为了诱导CreERT2核转位，幼鱼用10µM 4-羟基他莫昔芬（4-OHT）（Sigma H7904，原液用乙醇稀释）处理，每24小时更换一次。
为了避免色素沉着，所有成像的胚胎/幼鱼均从受精后24小时（hpf）开始用PTU处理。为了获得整个心脏的3D Airyscan图像，将幼鱼置于含有1%低熔点琼脂糖和0.2%三卡因的溶液中，以在成像过程中麻醉并停止心脏跳动。对于纵向研究，幼鱼成像时间最长为10分钟，之后小心地将其从PTU卵水中取出并置于培养箱中，以恢复心脏跳动和发育。根据实验需要，同一批幼鱼可能会被多次成像（图1a）。为了纵向追踪从受精后124小时（hpf）到受精后14天（dpf）的心脏，在124 hpf时对幼鱼进行活体成像。之后，将幼鱼从琼脂糖中取出，并在标准条件下生长至14 dpf。在14 dpf时，将之前在124 hpf时成像过的同一批幼鱼用4%多聚甲醛固定，解剖出其心脏，再置于1%低熔点琼脂糖中进行成像。
使用Zeiss LSM880 Axio Examiner W Plan-Apochromat 20×/1.0镜头和Zeiss ZEN软件（ZEN 2.3 SP1 FP3 black），通过快速Airyscan模式获取整个心脏的3D活体图像。对于仅需要心房前部的固定或活体组织图像，使用Zeiss LSM880 Axio Examiner W Plan-Apochromat 20×/1.0镜头和Zeiss Zen软件（ZEN 2.3 SP1 FP3 black）的共聚焦模式，或使用Zeiss LSM700 Axio Imager W Plan-Apochromat 40×/1.0浸没式镜头和Zeiss ZEN软件（ZEN 2011 SP3 black）进行拍摄。
为了获取跳动心脏的活体图像，将幼鱼置于不含三卡因的2%琼脂糖中，以避免潜在的致心律失常作用。为了避免温度变化引起的心脏跳动波动，在成像前，将包埋的幼鱼在标准生长条件下再孵育20分钟，并使用预热至27.5°C的显微镜培养箱进行成像。使用Zeiss Spinning Disk共聚焦显微镜和40x/1.1 W镜头（ZEN 2.6 blue软件），以5毫秒的曝光时间记录20-30秒的心脏跳动。尽量保持光强度和持续时间最短。
图中的所有图像均为代表性图像。所有airyscan图像均使用ZEN (2.3 SP1 FP3 black)软件，以3D airyscan处理模式（强度自动，6.0）进行处理。所有3D渲染、裁剪和量化均使用Imaris软件完成。用于成像心房的设置导致心室信号饱和（图1b）；因此，为了更好的可视化效果，我们使用Imaris中的3D裁剪工具，排除了后续图像中的所有心室部分，除非需要分析心室。整个心腔和单个心房肌细胞（CMs）的3D分割是手动进行的，以心肌膜标记物为参考，并使用表面工具绘制，每10个平面绘制整个心房腔或分别绘制每个平面的细胞边界。通过使用手动渲染的心房腔表面作为掩膜来提取心房核信号，从而确定心房肌细胞的总数。利用点功能从提取的信号中分割出所有心房核，并获得心房肌细胞的总数。使用单个心房肌细胞的3D表面和Imaris中可用的椭球-扁球方程测量3D形状指数（补充视频1）。为了对心房内肌结构进行3D分割，手动绘制了每一平面的内膜和核信号，以创建一个3D掩膜，该掩膜用于从原始信号中提取外层和内层信号（补充视频2）。这两个视频均使用Imaris以这种方式进行渲染。
为了获得心房肌细胞的角度，首先使用Imaris对3D图像进行对齐。对于对齐，将心脏置于使房室结（AVC）肌细胞垂直于房室管中血流方向的位置，并保持心房和心室相互平行（图1b）。使用Imaris的截图工具获得此对齐的2D图像。这些2D图像在ImageJ中进一步分析。仅分析相对平坦的肌细胞，并排除任何位于心腔曲率上的肌细胞，以避免伪影。通过每个分析的肌细胞绘制最长的直线，并获取该直线相对于AVC肌细胞方向的角度作为细胞角度的度量（图1b’）。为了获得伸长肌细胞的平均数量，首先通过Imaris预对齐获得2D图像，并对远离曲率的肌细胞进行细胞形状评分。为了确定单个心房肌细胞形成的小膜突起的数量，在Imaris中对3D图像进行对齐，并使用ImageJ手动计算每个肌细胞的膜突起数量。在预对齐的2D图像上确定N-钙粘蛋白和膜重叠的纵向量化。在每个时间点绘制相同位置的线，并获取强度图。强度图揭示了膜连接处的高强度区域，并获取这些区域的直径作为N-钙粘蛋白或膜重叠大小的度量。将这些直径归一化为第一个测量的时间点，然后随时间绘制。
在Imaris中预对齐的2D图像上，如上所述，使用ImageJ进行肌原纤维量化，且仅针对未位于心腔曲率处的肌原纤维。通过绘制一条与肌原纤维平行的线，并获取该线相对于AVC肌细胞角度的角度，作为肌原纤维角度的度量。使用myl7:actn3b-EGFP Z带报告基因的信号，绘制一条垂直于肌原纤维方向的线，从而获得肌原纤维的厚度。对于每个野生型心脏，从圆形或伸长型心房肌细胞中的至少3个不同细胞中，大约选取40个肌节进行平均，以获得相应细胞类型的平均肌节厚度。对于缺乏心房肌细胞伸长的心脏，从至少6个不同细胞中测量大约60个肌节，并进行平均，以获得该心房的平均肌节厚度。通过计算具有与DAPI信号（核标记物）和CM膜标记物共定位的Yap信号的心房肌细胞数量，得到展示核Yap免疫染色的肌细胞百分比。然后将此数量与总DAPI和GFP阳性心房肌细胞核进行比较。还使用ImageJ确定了心率动态图和射血分数。由于同一人拍摄了其他实验（即野生型和药理学实验）的图像并进行了处理，因此仅能在突变体与野生型数据之间进行盲法数据分析。
为了分离心房心肌细胞，我们使用了标记心房（myh6:mTagBFP2）和心室（myh7:mCherry-NTR）心肌细胞的报告基因系，以及标记房室结（AVC）和静脉窦（sinus venosus）心肌细胞的Wnt/β-catenin报告基因（7XTCF-Sia:eGFP）（补充图5a-d’）。因此，我们能够通过分选mTagBFP2阳性且eGFP和mCherry阴性的细胞来可靠地分离心房心肌细胞（补充图5e-h”）。
大约150颗48和72小时孵化后（hpf）的心脏通过手动解剖提取，并使用Pierce心肌细胞分离试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号88281）进行解离，如先前所述。简而言之，心脏在补充了10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco's改良Eagle's培养基（DMEM）+GlutaMAX（Thermo Fisher Scientific，目录号10566016）中解剖，并在整个解离过程中保持冰上；心脏在4°C下以2300g离心5分钟；移除上清液，并用1ml Hank's平衡盐溶液（HBSS）洗涤心脏；通过将组织与100μl酶1和5μl酶2（来自Pierce心肌细胞分离试剂盒）在30°C下以300rpm的摇床上孵育，将组织解离成单个细胞；加入1ml含FBS的DMEM以停止消化，并在4°C下以800g离心3分钟后移除；加入新鲜的含FBS的DMEM以重新悬浮细胞，并通过40μl过滤的荧光激活细胞分选（FACS）样本管。加入2μl DRAQ7™染料（目录号D15106），并在室温下暗处孵育10分钟。细胞悬液通过35μm尼龙Falcon® 5mL圆底聚苯乙烯12×75mm试管（产品号352235）过滤。使用配备100μM喷嘴和20psi压力的BD FACSAria™ III（BD Biosciences）或Invitrogen Bigfoot Spectral Cell Sorter（ThermoFisher Scientific）对细胞进行分选。通过排除DRAQ7™染料（使用633nm激发与730/45nm带通滤波器配对）和eGFP荧光（使用488nm激发与530/30nm带通滤波器配对）来筛选活细胞和非AVC及非SAN心肌细胞。为了分选心房心肌细胞（myh6:mTagBFP2+），使用405nm激发与455/14nm带通滤波器或450/50nm带通滤波器配对来测量tagBFP荧光；为了分选心室心肌细胞（myh7:mCherry-NTR+），使用561nm激发与610/20nm带通滤波器配对来测量mCherry荧光。分选后的细胞重悬于500μl Trizol中，用于后续的RNA提取。细胞计数数据使用FACSDiva软件（版本8.0.1；BD Biosciences）和Sasquatch软件（版本1.19.2；ThermoFisher Scientific）记录。数据分析使用FlowJo软件（版本10.8，BD Biosciences）进行。
斑马鱼胚胎的心房心肌细胞（CMs）数量较少且对解离敏感，因此为了获得足够的细胞进行RNA测序，共完成了5次分选会话，每次分选获得1000-2000个细胞作为每个重复样本，每种条件下有3个重复样本。前两个重复样本包含使用BD FACSAria™ III和BigFoot分选的细胞，而第三个重复样本仅包含使用BigFoot分选的细胞。
对于门控（补充图5e–h”），在排除碎屑后，选择细胞群体（Cells），然后利用FSC-A与FSC-H参数从中筛选出单个细胞（Single cells）。在这个单个细胞群体中，通过排除DRAQ7™ Dye+群体和eGFP+的AVC及SAN心肌细胞来选择活细胞。使用高强度mTagBFP2信号且低或无mCherry信号的细胞来筛选心房心肌细胞。心室心肌细胞则仅根据mCherry阳性细胞进行筛选，因为心房中存在低强度的mCherry信号，而心室中存在高强度的mCherry信号（补充图5a–d）。
从分选的心房心肌细胞（CMs）中使用miRNeasy micro kit（QIAGEN）提取总RNA，并结合柱上DNase消化（DNase-Free DNase Set，QIAGEN，217084）。由于RNA量较低，跳过了质量控制步骤。测序是在NextSeq2000仪器（Illumina）上使用P3流动池和1×72bp单端设置进行的。使用Trimmomatic版本0.39对读取进行修剪，当质量下降到平均Q15以下时（在5个核苷酸的窗口内），仅保留长度超过15个核苷酸的过滤读取。使用STAR 2.7.10a将读取与Ensembl斑马鱼基因组版本danRer11（Ensembl发布104）进行比对。对齐结果进行过滤以去除：使用Picard 3.0.0（Picard：一组用于以BAM格式处理下一代测序数据的Java工具）的重复项、多映射、核糖体或线粒体读取。使用featureCounts 2.0.4通过聚合重叠外显子的读取（排除重叠多个基因的读取）来确定基因计数。使用DESeq2版本1.36.0对原始计数矩阵进行归一化。基于原始计数矩阵，使用DESeq2创建对比。将基因分类为在平均计数>5、多重测试调整后的p值<0.05和-0.585<log2FC>0.585时显著差异表达。Ensemble注释通过UniProt数据（Universal Protein Resource（UniProt）的活动）进行了丰富。
所有下游分析都基于归一化的基因计数矩阵。对于KOBAS的基因集富集分析，将差异表达基因（DEGs）分为上调/下调基因。通过FDR定义显著的基因集富集，并绘制前10个基因集或富集途径（虚线：p值=0.05）。对于仅分析72 hpf时上调的基因，我们使用了Metascape的KEGG途径富集分析。
除极性图和转录组分析外，所有统计分析和图表均使用Graphpad Prism v9.3.1获得。在选择统计测试之前，使用D’Agostino–Pearson综合测试和Shapiro-Wilk测试来检验高斯分布的正态性。所有通过正态性测试的参数数据，在比较两个条件时，使用双样本未配对Student’s t-test进行分析；在评估多个条件时，使用普通单因素ANOVA配合Tukey’s或Dunnett’s多重比较测试进行分析。所有未通过正态性测试的非参数数据，在比较两个未配对条件时，使用双样本Mann-Whitney’s测试进行分析；在比较两个配对条件时，使用双尾Wilcoxon测试进行分析；在分析多个条件时，使用Kruskal-Wallis测试配合Dunn’s多重比较测试进行分析。在补充图2中，Student’s t-test与F测试配对，以计算F比值。所有误差条均使用均值和标准差计算。极性图使用R进行绘制。对于所有图表，显著性使用的p值截断值为0.05。
