【文献解读】利用缺氧斑马鱼模型和多组学分析探讨苯丙氨酸在缺氧适应中的作用
文摘
科学
2024-10-15 17:01
江苏
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文献：Wu Y, Ma Y, Li Q, Li J, Zhang D, Zhang Y, Li Y, Li X, Xu P, Bai L, Zhou X, Xue M. Multi-omics analysis reveals phenylalanine enhance mitochondrial function and hypoxic endurance via LKB1/AMPK activation. J Transl Med. 2024 Oct 10;22(1):920. doi: 10.1186/s12967-024-05696-5. PMID: 39390477; PMCID: PMC11465566.
杂志：Journal of Translational Medicine
许多研究集中于小分子（如氨基酸）在缺氧条件下对代谢的影响。最近的研究发现，苯丙氨酸在慢性缺氧适应过程中显著升高，这提示苯丙氨酸的处理可能显著提高缺氧耐受性。然而，缺氧调控苯丙氨酸的具体作用尚不清楚。本研究通过缺氧斑马鱼模型和多组学分析，探讨了苯丙氨酸在缺氧适应中的作用。我们发现，与苯丙氨酸相关的代谢通路在缺氧条件下显著上调，增强了生物体的缺氧耐受性。苯丙氨酸处理降低了活性氧（ROS）水平，改善了缺氧细胞中的线粒体氧消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）。Western blot结果表明，苯丙氨酸通过L型氨基酸转运体（LAT1）摄取增加，激活了LKB1/AMPK信号通路。这一激活上调了过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子-1α（PGC-1α）和Bcl-2/Bax比率，同时下调了解耦联蛋白2（UCP2），从而在缺氧条件下改善了线粒体功能。这是首次通过综合多组学分析证明了苯丙氨酸在缺氧适应中的关键作用，为开发抗缺氧药物提供了新的见解。![]()
氧气对于哺乳动物的新陈代谢和生理功能至关重要，主要因为它在细胞能量生成中发挥关键作用。然而，当前的临床策略往往忽视了细胞对缺氧环境的多样化和明确的适应性反应。为了维持细胞在缺氧压力下的基本功能，细胞会调整核心代谢通路，从而实现代谢动态平衡并与环境协调。要开发有效的缺氧疾病生命支持策略，深入了解缺氧条件下生物能量功能和细胞生存的调控机制至关重要。在这方面，多维组学技术是探讨分子作用机制的有效方法。此前的研究已强调了氨基酸在缺氧条件下代谢重编程中的重要作用。研究表明，谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸和天冬氨酸等氨基酸通过参与三羧酸循环（TCA）进行能量生产、调节氧化还原反应并抑制线粒体损伤，在缺氧应激下可改善细胞生存。例如，谷氨酰胺在缺氧条件下驱动TCA循环，作为替代能量来源。甘氨酸通过抑制PKC-β2并增强线粒体健康，保护H9C2细胞免受缺氧/复氧引起的损伤。丝氨酸代谢在缺氧期间有助于维持线粒体氧化还原平衡。天冬氨酸被鉴定为缺氧条件下细胞增殖的关键限制性代谢物。最近的研究还表明，心力衰竭患者的血液中苯丙氨酸水平升高，提示其可能是缺氧应激的潜在生物标志物。在慢性缺氧条件下，血浆中的苯丙氨酸水平发生变化，其代谢通路被确定为抗缺氧策略的关键目标。然而，苯丙氨酸水平升高在缺氧耐受中的具体作用及其潜在的分子机制尚不清楚。我们假设，苯丙氨酸可能通过激活LKB1/AMPK信号通路，增强线粒体功能，从而促进缺氧耐受。斑马鱼（Danio rerio）与人类基因有89%的相似性，并对氧气变化高度敏感，能够更好地反映缺氧条件下内源性分子信号的多种变化，因此是研究缺氧应激和耐受的理想模型。本研究通过多组学的整合分析，鉴定了斑马鱼缺氧模型中的核心基因、蛋白质、内源性代谢物、代谢通路和调控网络。经过全面的生物信息学分析，我们比较了缺氧相关的分子特征。此外，核心靶点和通路也在缺氧细胞模型中得到了验证。这些结果突显了苯丙氨酸相关通路在缺氧适应中的重要性，强调了其在这一过程中的关键作用。为了评估缺氧条件下的分子代谢特征，首先建立并优化了斑马鱼的缺氧模型。斑马鱼暴露于不同氧浓度环境（21%、10%、5%和3%）下24小时。在相同的气压条件下，水中正常的氧浓度为6.5~7.0 mg/L，而在3%氧气条件下，水中溶解氧显著下降至2 mg/L以下，表明此时处于缺氧状态（图1A）。测量了斑马鱼大脑中的缺氧相关生物标志物，包括乳酸脱氢酶（LDH）、柠檬酸合酶（CS）和缺氧诱导因子1α（HIF-1α）（图1B-D）。随着氧浓度的降低，HIF-1α表达增加，表明缺氧应激的出现。在3%氧气条件下暴露24小时，LDH和CS水平显著升高，这与HIF-1α表达增加一致，证实了成功建立了斑马鱼的缺氧模型。在后续实验中，该模型被用于多组学研究，以鉴定与缺氧耐受性相关的靶点。为进一步探索缺氧耐受的分子机制，还建立了PC12和H9C2细胞的缺氧模型。在缺氧处理后的0小时、4小时、8小时、12小时和16小时，测量了LDH、活性氧（ROS）水平以及HIF-1α蛋白的表达。缺氧处理后，PC12和H9C2细胞中的LDH渗漏、ROS水平及HIF-1α表达均增加。值得注意的是，这些标志物在PC12细胞中于8小时达到峰值，而在H9C2细胞中于12小时达到峰值（图1E、F、H和I）。在接下来的实验中，分别选择1%氧气下暴露8小时和12小时，模拟PC12和H9C2细胞的缺氧条件。![]()
图1 斑马鱼、PC12细胞和H9C2细胞的缺氧模型多组学分析能够在多个层面上全面揭示斑马鱼对缺氧环境适应的分子机制。本研究通过整合转录组学、蛋白质组学和代谢组学的方法，鉴定了参与缺氧耐受各种生物过程的基因、蛋白质和代谢物。在这些数据中，与21%氧气组相比，3%氧气组中有298个基因上调、123个基因下调，272种蛋白质上调、123种蛋白质下调，42种代谢物上调、34种代谢物下调（P < 0.05；蛋白质组学/代谢组学的倍数变化（FC）> 1.2，转录组学的FC > 2）（图2A-F及表S1-3）。接着，基于GO和KEGG数据库对差异基因、蛋白质和代谢物进行了分析。转录组学的GO分析显示，经典糖酵解和果糖相关代谢显著上调，表明能量代谢发生了明显变化（图2G）。蛋白质组学分析表明，缺氧显著影响了诸如氧气运输和对缺氧反应等生物过程（图2H）。代谢组学的KEGG分析显示，缺氧影响了多种代谢通路，包括L/D-氨基酸代谢，如嘌呤、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的合成途径（图2I）。富集分析数据显示，为维持斑马鱼生存，能量生产和氧气运输等重要细胞功能被上调。氧气缺乏引发了一系列应激反应，包括代谢紊乱、氧化应激、组织损伤，甚至细胞死亡。同时，代谢通路分析（KEGG注释）显示，mRNA和内源性代谢物的水平均上调。更重要的是，氨基酸代谢通路（尤其是苯丙氨酸代谢通路）显得尤为关键。与常氧组相比，缺氧组中苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的合成代谢途径明显上调，且富集评分和-log P值较高。因此，我们推测，苯丙氨酸代谢调控可能在维持动物在急性缺氧环境中的生存中发挥了关键作用。![]()
通过对这些随氧气浓度变化上调的差异基因、蛋白质和代谢物进行进一步分析，研究发现多组学中存在同时上调的通路。缺氧组学的氧气浓度依赖性分析表明，多个组学中富集了氨基酸代谢通路，包括苯丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢等（图3A-C）。维恩图分析显示，有六条代谢通路在三种组学中上调（包括苯丙氨酸代谢、糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢以及甘油磷脂代谢），其中苯丙氨酸代谢通路的富集得分和–log P值最高，尤为显著（图3D和E）。这些结果表明，苯丙氨酸代谢与耐缺氧性有着强相关性。![]()
随着氧气浓度的降低，斑马鱼脑中的苯丙氨酸水平逐渐升高（图4A）。此外，在低氧条件下，苯丙氨酸羟化酶（PAH）的表达显著增加，这一结果通过RT-qPCR验证（图4B和4C）。这些结果进一步支持了苯丙氨酸代谢与缺氧之间的显著相关性。为测定缺氧条件下的苯丙氨酸水平，研究采用了稳定同位素13C标记的苯丙氨酸，并通过LC-MS/MS技术对细胞及培养基中的苯丙氨酸含量进行定量分析。结果显示，缺氧条件下PC12细胞中13C-苯丙氨酸的含量显著高于常氧组（图4D），而培养基中的13C-苯丙氨酸水平则明显下降（图4D），H9C2细胞中的结果也呈现相同趋势（图4E）。苯丙氨酸的转运蛋白L型氨基酸转运体1（LAT1）在PC12和H9C2细胞中，缺氧条件下表达显著上调（图4F）。选择性LAT1抑制剂LAT1-IN-1（BCH）能够显著抑制苯丙氨酸的细胞摄取（图4G）。另外，苯丙氨酸处理显著提高了PC12细胞在缺氧条件下的存活率，并表现出缺氧保护作用，而这种作用在BCH处理后被逆转（图4H）。这些结果表明，PC12和H9C2细胞在缺氧条件下对苯丙氨酸的摄取增加。![]()
为了研究苯丙氨酸的抗缺氧效果，研究使用不同浓度的苯丙氨酸来评估其对缺氧耐受性的影响。首先，在斑马鱼缺氧模型和小鼠缺氧预处理模型上验证了苯丙氨酸的保护作用（图5A和5B）。如图5A所示，结果表明苯丙氨酸能够显著延缓斑马鱼在3%氧气环境下的死亡时间。同时，小鼠的缺氧耐受时间也显著延长（图5B）。Hoechst-PI-Calcium AM混合染色结果表明，苯丙氨酸处理可以以浓度依赖的方式显著提高两种细胞的存活率（图5C和5D）。Edu染色实验显示，苯丙氨酸处理也能增加两种细胞的增殖活性（图5E和5F）。缺氧会导致活性氧（ROS）水平的升高，这是缺氧应激下细胞损伤的主要原因之一。实验结果显示，在无葡萄糖条件下，缺氧处理后两种细胞的ROS水平急剧上升，但在苯丙氨酸处理后显著降低。研究还发现，苯丙氨酸作为一种在原发性肿瘤中普遍存在的氨基酸，通过抑制NFκB/STAT3/Notch通路来降低ROS水平，这与本研究的结果一致。这些结果有力地证明了苯丙氨酸具有出色的缺氧保护作用（图5G和5H）。![]()
为了更深入地理解苯丙氨酸对PC12和H9C2细胞的保护机制，研究进行了代谢组学分析。主成分分析（PCA）显示，在两种细胞中，苯丙氨酸处理组与缺氧组之间存在明显分离，表明缺氧条件下苯丙氨酸处理后内源性代谢物的核心差异（图6A和B；表S4）。维恩分析和蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI）分析表明，苯丙氨酸处理显著上调了与能量代谢相关的通路，例如嘌呤代谢、甘油磷脂代谢和鞘脂代谢，尤其是腺苷单磷酸激酶（AMPK）信号通路（图6C和D）。通过Swisstarget和SEA数据库分别预测和筛选了苯丙氨酸的作用靶点（图6E），维恩分析确定了39个交集靶点（图6F）。KEGG通路分析揭示了前20条通路，其中包括与AMP相关的能量代谢通路，进一步证实了苯丙氨酸在缺氧条件下对能量代谢的影响（图6G）。![]()
AMPK信号通路作为关键的能量感应器和调节器，能够促进ATP的生成，并通过肝脏激酶B1（LKB1）激活，LKB1在能量代谢中发挥着重要作用。通过Western blot验证了整合分析中LKB1/AMPK信号通路的变化。与缺氧组相比，苯丙氨酸处理后AMPK蛋白的磷酸化水平（p-AMPK）及p-AMPK/AMPK的比例均显著增加（图7A和B）。同时，苯丙氨酸处理后，两种细胞中LKB1的表达在缺氧条件下明显上调，与AMPK磷酸化的结果一致。为进一步评估AMPK活性抑制对缺氧条件下细胞存活的影响，研究通过转染靶向AMPK基因的siRNA来敲低AMPK的表达，结果显示AMPK蛋白表达显著降低（图7C）。在1%氧气条件下，AMPK瞬时失活后，两种细胞的存活率显著下降（图7D）。这些结果表明，苯丙氨酸有助于通过激活AMPK信号通路来增强能量供给。苯丙氨酸显著提高了Bcl-2/Bax的比例，这是AMPK下游的作用靶点，负责调控线粒体膜的稳定性（图7E和F）。两种细胞中的解偶联蛋白2（UCP2）表达下调，而UCP2会使氧化磷酸化与ATP合成解耦，导致电子泄漏和ROS生成的增加（图7G和H）。此外，作为AMPK下游靶点的过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1-α（PGC-1α），是线粒体生物合成的关键调节因子（图7I和J）。这些结果表明，苯丙氨酸处理能够减少线粒体中的ROS生成，改善线粒体的稳态和功能，从而在缺氧条件下提升线粒体的能量代谢。![]()
图7 LKB1/AMPK信号通路及其下游靶点的Western blot结果Western blot结果表明，苯丙氨酸能够激活LKB1/AMPK通路，从而改善线粒体状态并降低ROS水平。ROS水平的升高主要是由缺氧引起的线粒体损伤导致的，研究使用Mito-Tracker Red CMXROS和电子显微镜实验来检测线粒体形态变化，以解释ROS水平增加的原因。Mito-Tracker Red CMXROS能够通过标记具有负膜电位的极化线粒体来指示功能性线粒体，缺氧条件下经过苯丙氨酸处理后，荧光强度显著增加（图8A和B）。电子显微镜实验结果显示，在常氧条件下，细胞内线粒体保持典型结构，并具有丰富的嵴（图8C）。缺氧会引起线粒体空泡化、结构紊乱和膜损伤，导致线粒体嵴的丢失，而苯丙氨酸处理能够缓解这些损伤，恢复线粒体的完整性。电子显微镜结果表明，苯丙氨酸有增强线粒体生物合成并减轻缺氧损伤的潜力。为了进一步验证苯丙氨酸与能量供应增加的相关性，研究评估了细胞的氧气消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR），以表征细胞的呼吸和糖酵解能力。OCR结果显示，缺氧条件下，随着苯丙氨酸浓度的增加，PC12细胞的最大呼吸水平显著提升（图8D-F）。ECAR结果则表明，苯丙氨酸在缺氧条件下略微增强了细胞的糖酵解能力（图8G-I）。总体而言，这些发现表明苯丙氨酸通过改变细胞呼吸，在缺氧应激下有效维持了较高的能量水平。![]()
理解缺氧适应的分子机制对于提高耐缺氧能力以及开发与缺氧相关疾病的治疗方法至关重要。研究结果表明，缺氧导致了大量内源性物质、各种生理和病理反应以及信号通路的变化，这些都与氧气供应的限制有关。尽管缺氧相关的信号通路及靶蛋白（如HIF-1α）在哺乳动物和非哺乳动物系统中已有较为详尽的研究，但缺氧调节的内源性物质的重要性仍未完全揭示。本研究通过建立斑马鱼和细胞缺氧模型，进行多组学分析，鉴定出低氧浓度下的关键节点。我们的数据表明，苯丙氨酸相关的代谢通路与缺氧适应具有密切关系。苯丙氨酸处理通过Bcl-2/Bax、PGC-1α、UCP2以及其他LKB1/AMPK信号通路的下游靶点，显著改善了线粒体的结构和功能。以往的研究已指出，缺氧预处理后，关键氨基酸（如苯丙氨酸）的代谢发生了显著变化，这为理解缺氧适应机制提供了新的见解。此外，代谢组学研究表明，苯丙氨酸在慢性缺氧适应中可能起着重要作用。苯丙氨酸代谢与维持能量代谢稳态密切相关。在生酮饮食中，苯丙氨酸通过三羧酸循环（TCA循环）参与能量供应。然而，苯丙氨酸在缺氧适应中的具体功能和分子机制尚未完全阐明。本研究首次通过多组学（转录组学、蛋白质组学和代谢组学）综合分析，证明了苯丙氨酸相关代谢通路在缺氧适应中的重要性。苯丙氨酸参与的两个关键代谢通路——苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，以及苯丙氨酸代谢——得到了显著富集。此外，苯丙氨酸水平在缺氧条件下持续升高，并与氧气浓度相关。我们的研究通过实验证实，缺氧条件下苯丙氨酸的摄取增加，进而激活AMPK信号通路。该激活改善了线粒体功能，增强了最大呼吸能力，从而促进了能量代谢和细胞在缺氧条件下的存活率。本研究观察到在缺氧条件下，PC12和H9C2细胞从培养基中摄取苯丙氨酸的能力显著增强，这一现象被证实是由缺氧诱导LAT1表达增加所致。此外，LAT1抑制剂BCH能够抑制LAT1介导的苯丙氨酸转运，从而抑制细胞在缺氧条件下的存活和生长。LAT1属于溶质载体（SLC）家族，负责将大型、中性、芳香族或支链型必需L-氨基酸（EAAs）转运到细胞内，如L-亮氨酸（L-Leu）、L-苯丙氨酸（L-Phe）、L-酪氨酸（L-Tyr）、L-蛋氨酸（L-Met）、L-异亮氨酸（L-Ile）和L-缬氨酸（L-Val）。它有三种亚型：LAT1、LAT2和LAT3，其中LAT1对苯丙氨酸的亲和力最高。LAT1在大脑和胎盘中高表达，调节营养物质和药物通过血脑屏障进入脑实质。研究表明，LAT1在多种癌症中表达上调，促进癌细胞存活，因此成为潜在的抗癌药物靶点。对于缺氧条件下LAT1表达增加的现象，有研究表明这一过程受HIF-1α和HIF-2α调控，尤其是HIF-1α，这与我们的研究结果一致。目前，关于缺氧条件下LAT1的研究较少，且其在缺氧条件下对苯丙氨酸代谢的影响尚未有相关研究。虽然我们的数据为LAT1在缺氧条件下调控苯丙氨酸代谢提供了实验依据，但仍需在哺乳动物模型中进一步验证。此外，探索LAT1抑制剂或苯丙氨酸补充在临床应用中的治疗潜力也具有重要价值。缺氧引起的线粒体功能障碍会严重破坏细胞代谢的稳态，进而导致细胞死亡。LKB1作为AMPK的关键上游激酶，负责激活这一能量代谢的核心调节器。我们的研究数据表明，苯丙氨酸诱导的耐缺氧机制主要涉及AMPK信号通路的激活，从而促进能量恢复。添加苯丙氨酸后，LKB1表达和AMPK磷酸化显著增加。AMPK激活了PGC-1α的转录及其活性，PGC-1α是调控线粒体生物合成的转录共激活因子。LKB1/AMPK/PGC-1α通路通过增强线粒体生物合成和抗氧化防御机制，缓解了缺氧引起的线粒体功能障碍和氧化应激，这已通过Mito-Tracker Red和Seahorse实验得到验证。Bcl-2在调节线粒体外膜通透性（MOMP）和线粒体通透性转换孔（mPTP）激活中发挥关键作用，是线粒体依赖性凋亡的核心开关。Bcl-2家族成员Bax在过度表达时促进细胞凋亡。缺氧条件下，Bcl-2/Bax表达比例降低、线粒体钙超载和mPTP开启进一步破坏了线粒体膜电位，导致线粒体外膜破裂，促凋亡分子释放到细胞质中。作为LKB1/AMPK信号通路的下游靶点，苯丙氨酸处理能够上调Bcl-2/Bax的比例，从而稳定线粒体结构并在缺氧条件下改善线粒体功能。线粒体解偶联蛋白（UCPs）会降低氧化磷酸化的效率，并参与调控线粒体ROS的产生，而这些蛋白在苯丙氨酸处理后下调。研究发现，苯丙氨酸的增加是大鼠的缺氧反应之一，支链氨基酸与芳香族氨基酸的比值（Fischer比值）的变化是评估急性缺氧相关病理的有效工具。在本研究中，我们同样观察到低氧条件下支链氨基酸的变化，如亮氨酸和异亮氨酸。然而，组学高通量分析中的代谢物变化数据为相对定量结果，支链氨基酸的缺氧代谢仍在进一步探索中。未来通过更精确的定量分析评估Fischer比值，这将对我们的研究工作有所帮助。缺氧是多种疾病中的常见过程，影响其病理进程。氨基酸在缺氧相关疾病中的作用多方面。本研究在理解缺氧适应机制方面取得了重要进展。通过揭示苯丙氨酸的作用及其对关键信号通路的影响，我们为开发新型治疗策略奠定了基础，旨在增强耐缺氧能力，并改善心血管和脑血管疾病、癌症以及代谢性疾病（如中风和心力衰竭）患者的预后。尽管研究结果很有说服力，但本研究受限于仅使用了斑马鱼和细胞模型，这些模型可能无法完全模拟哺乳动物或人类系统的复杂性。此外，组学方法的特异性和代谢反应的潜在变异性需要在不同的生物学环境中进行进一步验证。未来的研究应侧重于在哺乳动物模型中验证这些发现，并探索苯丙氨酸补充在缺氧相关疾病中的临床疗效。此外，对LKB1/AMPK通路激活的下游效应进行深入研究，可以提供更深入的机制见解，并确定其他治疗靶点。总体而言，本研究确定了苯丙氨酸在缺氧适应中的作用及其通过LKB1/AMPK信号通路发挥作用的机制，该机制进而改善了能量代谢并促进了缺氧条件下的细胞存活。苯丙氨酸激活LKB1/AMPK信号通路不仅改善了线粒体功能并降低了ROS水平，还增强了整体能量代谢，这对于细胞适应缺氧应激至关重要。这些发现强调了靶向该通路进行治疗干预的潜力。我们的研究结果为缺氧适应的分子机制提供了新颖见解，并提示了在治疗缺血性心脏病、中风和慢性阻塞性肺病等缺氧相关疾病中的潜在治疗应用。动物处理
苯丙氨酸（纯度>98%）购自中国北京索莱宝科技有限公司。成年雄性ICR小鼠（18–20 g）购自首都医科大学，并分笼饲养于光照-黑暗周期为12小时的环境中，自由摄食和饮水。野生型TU斑马鱼（雌雄混合，6月龄，体长5 cm，体重0.25 g）购自中国南京一树源生物科技有限公司。实验前，斑马鱼在光暗周期为14:10小时、饲养系统温度恒定（28 ± 0.5 ℃）、投喂卤虫（Artemia salina）的受控环境中至少驯养两周。动物饲养和实验均符合首都医科大学动物实验伦理委员会的要求（伦理审查批号：AEEI-2016-016）。对于缺氧处理，将斑马鱼和小鼠置于充有氮气的缺氧室中，该缺氧室配备有氧传感器。在整个实验过程中监测并控制氧气水平。使用液氮处死斑马鱼，并使用南京建成生物工程研究所的乳酸脱氢酶（LDH）和柠檬酸合酶（CS）试剂盒检测其脑组织的LDH和CS活性。具体操作如下：获取完全冷冻的脑组织样本，并在磷酸盐缓冲液（PBS）中匀浆，三条鱼的脑组织组成一个样本。使用同一研究所的酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒检测缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）蛋白表达。具体实验步骤参照试剂盒说明书。以阴性对照组校正这些结果。使用mirVana miRNA Isolation Kit（Ambion）从斑马鱼脑中提取总RNA，并使用Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent，美国圣克拉拉）评估其完整性。所有RNA完整性数（RIN）≥7且28S/18S≥0.7的样本均用于后续分析。使用TruSeq Stranded mRNA LTSample Prep Kit（Illumina，美国圣地亚哥）构建文库，并使用Illumina测序平台（HiseqTM 2500）进行测序。使用NGS QC Toolkit处理原始数据。然后，使用Tophat将清洁的读数映射到参考斑马鱼（Danio rerio）基因组。使用cufflinks计算每个基因的FPKM值，并使用htseq-count获得每个基因的读数计数。将P值<0.05且倍数变化>2或<0.5设为显著差异表达分析的阈值。进行层次聚类分析以探索差异表达基因（DEGs）中的基因表达模式。基于超几何分布，使用R v3.6.0软件分别对DEGs进行GO富集分析和KEGG通路富集分析。使用RIPA裂解缓冲液（Roche，瑞士）裂解斑马鱼脑组织。在冰上以200 kHz超声处理3分钟，然后以13,000 rpm离心15分钟，收集上清液。使用2-D Quant Kit（GE Healthcare，美国）测定蛋白质浓度。通过SDS-PAGE凝胶电泳和考马斯亮蓝染色评估蛋白质的质量（提取效率、杂质、完整性）。用尿素洗涤蛋白质，在37℃下用DTT还原4小时，然后用IAA烷基化30分钟。用碳酸氢铵重新溶解样品，并在37℃下用胰蛋白酶（酶:底物=1:50）消化16小时。从不同组别中取约85µg样品，用iTRAQ试剂（SCIEX，美国）进行标记。向每个样品中加入异丙醇，并在室温下避光孵育2小时。使用Sep-Pak HLB柱（Waters，美国）清洗和洗脱肽混合物，然后使用CentriVap浓缩器干燥。使用配备C18柱（300 Å）（Agilent，美国）的Agilent HPLC系统对样品进行分离。肽在流动相A（含0.1%甲酸的水）和流动相B（含0.1%甲酸的乙腈）中上样，并按以下分离梯度进行洗脱：0 ~ 30分钟, 5 ~ 35%B; 30 ~ 32 分钟, 35 ~ 95%B; 32 ~ 37 分钟, 95%B; 37 ~ 39 分钟, 95 ~ 5%B; 39 ~ 45 分钟, 5%B。共收集45个馏分，合并为9个馏分，并储存在-80℃直至进行LC-MS/MS分析。肽段在EASY-nLC系统上分离，并与Fusion Lumos Tribrid质谱仪（Thermo Fisher，美国）联用。质谱仪的操作参数设置为扫描范围350~1550 Da，m/z 200时的分辨率为15,000/30,000。MS的参数设置如下：归一化碰撞能量为31 eV；隔离宽度为1.6 Da；毛细管温度为300℃；动态排除持续时间为20 s；喷雾电压为2.0 kV。肽段在C18柱上用流动相A（含0.1%甲酸的水）和流动相B（含0.1%甲酸的乙腈）进行分离。分离梯度设置如下，流速为300 nL/min：4分钟内为8% B，45分钟内为30% B，30分钟内为90% B，3分钟内为8% B。使用MASCOT软件和Proteome Discoverer v2.2搜索MS/MS光谱。用于鉴定蛋白质的搜索参数设置如下：MS/MS容差为0.1 Da；肽质量容差为20 ppm；酶为胰蛋白酶；酶解位点为精氨酸（R）和赖氨酸（K）；漏切位点数为2；固定修饰为脲甲基化（C）；可变修饰为氧化（M）；假发现率（FDR）为1%。蛋白质数据通过Perseus v1.6软件进行转换。全局蛋白质表达模式和热图在MeV v4.9软件中绘制。差异表达蛋白质（DEPs）的热图也使用HemI v1.0软件绘制。功能注释和通路富集分析分别由DAVID v6.8和KEGG数据库进行。斑马鱼脑组织样本经称重后，与冰浴的80%甲醇（薄荷醇：H2O=4:1，体积比）混合匀浆。样本在冰上孵育20分钟，然后以13,000转/分钟的速度离心15分钟，以提取代谢产物。从所有样本中取出的部分样本混合作为质量控制（QC）样本。样本使用Waters Acquity UPLC系统结合SYNAPT G2-Si质谱仪进行分析，该质谱仪采用数据独立分析（DIA）和离子迁移率（HDMSE）模式。质谱的参数设置如下：正离子模式毛细管电压为3 kV，负离子模式为2.5 kV；采样锥孔电压为40 V；源偏移电压为80 V；锥孔气体流量为50 L/h；去溶剂化气体流量为600 L/h；源温度为120℃。代谢产物在HSS T3和CSH柱上用流动相A（含0.1%甲酸的水溶液）和流动相B（乙腈）进行分离。HSS T3柱的梯度洗脱设置如下：0~7分钟，0.1%~33%B；7~12分钟，33%~44%B；12~14分钟，44%~64%B；14~18分钟，64%~100%B；18~20分钟，100%B；20~20.1分钟，100%~0.1%B；20.1~22分钟，100%B。CSH柱的梯度洗脱设置如下：0~0.5分钟，25%B；0.5~3分钟，25%~44%B；3~15分钟，44%~80%B；15~18分钟，80%~100%B；18~20分钟，100%B；20~20.1分钟，100%~25%B；20.1~22分钟，25%B。使用Progenesis QI软件筛选出差异代谢产物（P<0.05；倍数变化>1.2）。通过HMDB、KEGG和LIPID MAPS数据库鉴定片段和前体离子。使用MeV v4.9软件进行热图和聚类分析。通路富集和分析使用Metaboanalyst v6.0进行。PC12细胞购自中国细胞株资源基础设施（北京，中国），H9C2细胞购自细胞生物科技有限公司（上海，中国）。PC12细胞在含有青霉素（50 U/ml）、链霉素（50 µg/ml）、5%胎牛血清（FBS）和10%马血清的RPMI 1640培养基中培养。为诱导分化，PC12细胞在含有大鼠神经生长因子（NGF）和1% FBS的RPMI 1640培养基中培养至少48小时。H9C2细胞在含有青霉素（50 U/ml）、链霉素（50µg/ml）和10% FBS的DMEM培养基中培养。使用分化的PC12细胞进行缺氧处理。两种细胞的缺氧处理均在37°C下，于充满1%或5% O2、5% CO2和其余为N2的加湿培养箱中进行。缺氧期间，细胞维持在低血清培养基（1% FBS）中。在处理后0、4、8、12、16和24小时测定乳酸脱氢酶（LDH）、活性氧（ROS）和缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）水平，以确认缺氧条件。ROS和LDH水平分别按照ROS检测试剂盒（叶森生物技术有限公司，中国）和LDH检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，中国）的说明书进行测量。HIF-1α的蛋白表达水平通过Western blotting检测。13C标记的苯丙氨酸（L-苯丙氨酸-13C9, 15N；L-苯基-d5-丙氨酸）购自Sigma-Aldrich（德国）。简而言之，使用13C标记的苯丙氨酸（L-苯丙氨酸-13C9, 15N）来评估氨基酸的摄取情况。在缺氧处理前，细胞在含有或不含有13C标记苯丙氨酸的培养基中培养。缺氧处理后，使用含有L-苯基-d5-丙氨酸作为内标的冰浴80%甲醇提取细胞的总代谢产物。使用Agilent 1290 UPLC结合Agilent 6490质谱仪对标记的苯丙氨酸进行定量。选用HSS T3色谱柱，并选择流动相A（含0.1%甲酸的水溶液）和B（乙腈）进行分离。通过BCA法测定细胞蛋白浓度。使用13C-苯丙氨酸与L-苯基-d5-丙氨酸的面积比计算每个样品中细胞从培养基中摄取的苯丙氨酸量，并将这些结果按蛋白浓度进行归一化处理。在缺氧处理前，分别为H9C2细胞补充了含0 mg/L（0×）、33 mg/L（0.5×）、66 mg/L（1×）和330 mg/L（5×）苯丙氨酸的培养基，为PC12细胞补充了含0 mg/L（0×）、7.5 mg/L（0.5×）、15 mg/L（1×）和75 mg/L（5×）苯丙氨酸的培养基。对于钙黄绿素AM-碘化丙啶-Hoechst 33,342染色测定，缺氧后在37°C下将细胞与含有钙黄绿素AM（5 µM）、碘化丙啶（20µg/mL）和Hoechst 33,342（40µg/mL）的混合染料溶液孵育30分钟。对于EdU染色测定，缺氧处理后，在37°C下将细胞与EdU溶液（10µM）孵育2小时，然后用Hoechst 33,342（40µg/mL）对细胞核进行染色。使用Celigo图像细胞仪（Nexcelom，美国）在不同荧光通道下检测细胞存活率。根据制造商的协议，执行了Cell Counting Kit-8试剂盒（CCK-8）（Dojindo，日本）、MTS细胞增殖比色测定试剂盒（MTS）（Bestbio，中国）和Mito-Tracker Red CMXRos试剂盒（碧云天生物技术，中国）染色测定。向每个孔中加入10µL MTS或CCK-8溶液，并将96孔板在37℃下孵育2小时。CCK-8在450 nm处测定OD值，而MTS在490 nm处测定。对于Mito-Tracker Red CMXRos测定，处理后洗涤细胞，并向每个孔中加入100µL 100 nM Mito-Tracker Red CMXRos。在37℃下孵育30分钟后，用新鲜培养基替换溶液，并使用显微镜在激发/发射=579/599 nm处检测荧光。结果根据阴性对照组进行了校正。缺氧处理后，弃去培养基，室温下用2.5%戊二醛固定细胞5分钟。将收集的细胞以3000转/分钟的速度离心2分钟，加入2.5%戊二醛固定液，然后在4℃下固定30分钟，以制备电子显微镜样品。随后，在电子显微镜核心设施进行后固定、包埋、切片和装片。使用日立H-7500透射电子显微镜（日立，日本）对超薄切片进行分析。PC12细胞和H9C2细胞均在缺氧环境下，分别用含5倍浓度苯丙氨酸的培养基和无苯丙氨酸的培养基进行培养。随后，使用冰浴的80%甲醇提取细胞代谢产物。样本经冰上超声处理和13,000转/分钟离心15分钟后，收集上清液作为样本。从所有样本中取部分混合作为质量控制（QC）样本。采用斑马鱼代谢组学方法获得代谢产物谱。使用HSS T3色谱柱，以0.4 mL/min的流速和流动相A（含0.2%甲酸的水）与流动相B（含0.2%甲酸的乙腈）对代谢产物进行分离。通过同位素和加合物去卷积验证峰检测，并使用总离子进行归一化处理。在偏最小二乘判别分析（PLS-DA）之前，使用Pareto缩放对具有显著差异的代谢产物进行分析[14]。使用Progenesis QI和EZ-info 2.0软件筛选出差异代谢产物（VIP>1，P<0.05，且倍数变化>1.2）。然后，基于人类代谢组数据库（HMDB）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）和脂质地图（LIPID MAPS）数据库对代谢产物进行鉴定。蛋白质-代谢产物的相互作用分析通过MBROLE v.2.0服务器（代谢物生物作用，http://csbg.cnb.csic.es/mbrole）进行，根据说明使用默认设置。使用HMDB ID导入化合物集，在依赖生物体的模式下选择家鼠（Rattus norvegicus，大鼠）作为背景集。标记关键节点以分析KEGG注释。蛋白质印迹分析（Western blotting assay）缺氧处理后，使用RIPA缓冲液收集细胞。经13,000转/分钟离心10分钟后，收集上清液，并使用BCA试剂盒测定蛋白质含量。将蛋白质样品在SDS-PAGE上进行分离，然后电转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。使用含有5%牛血清白蛋白（BSA）的TBST室温封闭膜1小时，然后在4℃下与针对以下抗原的一抗孵育：缺氧诱导因子-1α（HIF-1α，#14179）、纽蛋白（vinculin，#13901）、AMP活化蛋白激酶α（AMPKα，#5832）、磷酸化AMP活化蛋白激酶α（p-AMPKα，Thr172，#50081）、肝激酶B1（LKB1，#3047）、B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2，T40056）、Bcl-2相关X蛋白（Bax，T40057）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α（PGC-1α，#2178）、解偶联蛋白2（UCP2，#89326）。之后，将膜与二抗孵育1小时。使用化学发光Fluor Chem FC3系统检测免疫反应性信号。使用ImageJ软件量化目标条带的灰度强度。使用Seahorse分析法测定耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）使用XFe24细胞外流量Seahorse分析仪（美国安捷伦公司）测定细胞的耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）。将细胞以每孔20,000个细胞的密度接种于24孔XFe培养板中，在1%氧浓度条件下加入不同浓度的苯丙氨酸。缺氧处理后，将培养基替换为添加了谷氨酰胺、葡萄糖和丙酮酸的XF基础培养基，并在1%氧浓度条件下平衡1小时。随后，使用XF呼吸和糖酵解应激试剂盒对细胞进行呼吸和糖酵解测定。在氧气呼吸应激测试中，首先检测耗氧率的初始基线，然后加入寡霉素和FCCP以确定最大线粒体呼吸，加入鱼藤酮以测定OCR测量中的非线粒体呼吸。在糖酵解测定中，当细胞在ECAR培养基中孵育时记录初始细胞外酸化率。然后，在细胞与葡萄糖孵育后测定葡萄糖代谢。使用Wave v2.3.0软件（德国安捷伦科技公司）分析并可视化线粒体呼吸，并将其归一化为细胞数量。定量数据以平均值±标准差（mean ± SD）表示，统计分析使用GraphPad Prism v8.0软件进行。对于二元变量，采用卡方检验（Chi-square tests）；对于有序数据，采用秩和检验（rank sum tests）。在我们的组学数据中，采用Benjamini-Hochberg方法校正多重比较。对三个以上组之间的差异或两个组之间的差异进行分析时，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）或t检验方法，以p值<0.05作为具有统计学显著差异的界值。原文地址：https://translational-medicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12967-024-05696-5
注：因文章篇幅有限，所有相关引用文献，以及补充素材可以点击至原文查阅。
苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过六年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。![]()
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