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摘要
DNA修复和自噬是确保细胞存活的两个重要生物过程。尽管自噬有助于维持基因组稳定性，但尚未发现其直接参与DNA损伤修复的证据。我们在研究中发现，溶酶体能够处理脊椎动物中的拓扑异构酶1切割复合物（TOP1cc）DNA损伤。通过自噬选择性降解TOP1cc，可以在临床剂量的拓扑异构酶1抑制剂下，促进DNA损伤修复并增强细胞存活。TOP1cc通过细胞核膜的暂时性改变从细胞核转运到溶酶体，而这一过程与蛋白酶体无关。在机制上，自噬受体TEX264作为DNA复制叉上的TOP1cc传感器，触发p97 ATP酶介导的TOP1cc处理，并通过MRE11核酸酶和ATR激酶依赖途径将TOP1cc输送至溶酶体。我们还发现，选择性自噬在DNA修复中具有进化保守的作用，有助于细胞存活，维持基因组稳定性，并在结直肠癌患者的治疗中具有重要的临床意义。
介绍
过度的DNA扭曲应力必须被及时解决，以确保DNA复制和转录的顺利进行、基因组稳定性以及细胞存活。拓扑异构酶1（TOP1）在缓解DNA扭曲应力中起着关键作用。TOP1通过在DNA复制或转录前切割超螺旋结构的DNA单链，释放DNA上的扭曲应力，从而保证DNA合成和转录的连续进行。在其酶循环过程中，TOP1会在断裂的DNA 3'端和其活性DNA结合域中的一个酪氨酸之间形成暂时的磷酸酪氨酸共价连接。这种连接代表了典型的3'-DNA-蛋白质交联，是一种常见的有害DNA损伤，被称为TOP1切割复合物（TOP1cc）。通常，TOP1cc是短暂且可逆的，但内源性DNA损伤，如脱嘌呤位点、氧化核苷酸、核糖核苷酸或烷基化碱基，会阻碍TOP1的正常释放，导致TOP1cc的稳定化。这些稳定的TOP1cc阻碍了复制叉的进展，成为导致基因组不稳定性和细胞死亡的主要内源性原因。
TOP1cc的细胞毒性在癌症治疗中被利用，广泛使用的拓扑异构酶1毒药类药物，如喜树碱（CPT）及其衍生物，便是通过此机制发挥作用。伊立替康、拓扑替康、贝洛替康和曲妥珠单抗德鲁斯特坎等CPT类药物已被批准用于治疗结直肠癌、小细胞肺癌、卵巢癌和乳腺癌。然而，在结直肠癌患者中，发展出对TOP1毒药的耐药性已成为一个重要的临床挑战。因此，深入了解TOP1cc修复的分子机制对于维护基因组稳定性至关重要，同时也为改善使用TOP1毒药治疗的患者的临床疗效提供了关键的科学依据。
TOP1cc修复的关键步骤在于恢复DNA的完整性并清除受损的TOP1。DNA修复主要依赖于酪氨酸-DNA磷酸二酯酶1（TDP1）或核酸酶如MRE11。TDP1途径通过水解TOP1与单链DNA断裂的3′末端之间的磷酸酪氨酸键来完成修复。剩余的3′磷酸化DNA断裂位点通过碱基切除修复（BER）修复。另一种途径是通过核酸酶如MRE11，从3′到5′方向切割和重切DNA
TOP1cc修复的有效性与其蛋白质部分的降解紧密相关，这一过程使酶-DNA键暴露在修复机制下。早期研究显示，蛋白酶体能够降解与DNA共价结合的TOP1。然而，这一过程通常是在较高剂量下发生的，即微摩尔（μM）浓度的CPT剂量。这些剂量在临床中难以实现，因此该模型的生理相关性受到质疑。最近的研究表明，在临床相关的低剂量CPT（纳摩尔 [nM] 级别）下，TOP1cc的降解依赖于ATP酶p97和其辅因子TEX264对TOP1的展开。p97-TEX264复合物与金属蛋白酶SPRTN协同作用，在TDP1介导的修复之前切割TOP1。令人关注的是，TEX264最近还被确定为自噬的主要受体之一。
自噬通过降解多余、受损、错误折叠或聚集的蛋白质和细胞器来维持细胞的稳态。溶酶体是高度酸性的囊泡，富含各种酶类，可以将内容物分解为氨基酸、核苷酸、糖类和脂类。选择性自噬通过特定受体的作用实现，这些受体通常含有LC3相互作用区域（LIR），通过LC3将受体和底物连接到自噬膜上。E1样激活酶ATG7通过介导LC3的脂化来调控选择性自噬，而LC3的脂化对于其锚定在自噬膜上至关重要。在饥饿状态下，TEX264负责约50%依赖自噬的内质网清除。TEX264是一种嵌入内质网和核膜的单跨膜蛋白，具有LIR结构域，并在饥饿时通过自噬介导内质网的重塑。
自噬缺失会导致DNA损伤修复能力下降，并在应对基因毒性时增加细胞死亡，强调了自噬在维持基因组稳定性中的重要性。研究表明，自噬通过维持细胞的能量水平、提供核苷酸，并调控DNA修复蛋白的水平，确保DNA复制和修复的准确性。在酵母中，自噬清除核内成分有助于细胞在应激条件下的存活。在哺乳动物中，核成分如核纤层和RNA-DNA杂合物的降解已被发现。面对致癌压力时，核纤层蛋白B1会与LC3结合并从细胞核运送至溶酶体。核纤层蛋白B1的溶酶体降解会导致细胞衰老。此外，患有核纤层蛋白相关疾病的哺乳动物细胞依赖于自噬清除异常的细胞质DNA片段。另外，溶酶体核酸酶缺陷会导致细胞质中的核DNA无法有效清除，从而引发多种疾病。因此，哺乳动物细胞在长期应激条件下依赖自噬清除细胞质中的DNA片段。然而，自噬是否直接处理核DNA损伤以及如何调控这一过程仍不明确。至今尚无证据表明选择性自噬能够直接处理DNA损伤，从而调控DNA修复、基因组稳定性和细胞存活。
鉴于TEX264同时参与两个独立的细胞过程，分别是核中的DNA损伤修复和内质网的ER自噬，我们研究了TEX264是否通过自噬调控TOP1cc修复。我们采用了多种生物化学和细胞生物学方法，结合质谱、下一代DNA测序（NGS）、实时成像和电子显微镜，探讨自噬在人体细胞中对TOP1cc修复的作用。我们还通过斑马鱼模型和结直肠癌患者的数据，验证了DNA损伤选择性自噬在生物体水平及化疗反应中的相关性。我们的研究结果表明，TEX264在脊椎动物中调控选择性自噬，以修复核中的TOP1cc DNA损伤。
自噬与DNA复制在应对CPT处理时的协同作用
基于TEX264在内质网自噬（ER自噬）和TOP1cc修复中各自的独立功能，我们推测TEX264可能作为自噬受体，直接处理因TOP1与核DNA的共价结合所引发的DNA损伤。在TEX264-WT-V5的免疫共沉淀实验中，我们发现TEX264能够与DNA复制相关的蛋白质（如增殖细胞核抗原PCNA）和自噬蛋白形成复合物，这在非同步化和S期同步化的细胞中均有观察到（图1A）。类似结果也出现在对内源性TEX264的共免疫沉淀实验中。有趣的是，ATG7调节了内源性TEX264与TOP1、自噬蛋白LC3及DNA复制组分MCM7的相互作用（图S1A）。这些结果验证了TEX264确实参与了自噬和DNA复制过程。
为了探究其他自噬因子是否也参与DNA复制叉周围的过程，我们对在不同剂量的复制压力诱导剂（如CPT、羟基脲或紫外线）作用下的蛋白质质谱数据进行了深入分析。数据来自五项独立研究，涵盖了640个已知的自噬因子（图1B和S1B；表S1）。有趣的是，自噬因子占所有DNA复制相关蛋白质的约5%。在DNA复制叉及其周围，涵盖了自噬各阶段的关键蛋白质均有发现（图1C）。在CPT处理后，自噬关键因子显著富集，包括调控自噬起始的USP13（Beclin-1的调节因子）、受体TEX264及囊泡成熟相关蛋白CHMP7和SNAP29。此外，多个溶酶体相关的蛋白质也在复制叉周围富集，如V-ATPases、伴侣蛋白、组织蛋白酶D和RAB39A（表S1）。为了进一步验证，我们在低剂量和高剂量CPT处理下进行了新生DNA上蛋白质的分离实验（iPOND）（图1D）。结果显示，在CPT处理后，多个自噬相关蛋白（如Beclin-1、TEX264、CHMP7、ATG7、SNAP29和LC3）在DNA复制叉处富集。临床相关的低剂量CPT（nM级别）比高剂量CPT（μM级别）在复制叉处诱导了更高水平的自噬蛋白招募。由此我们得出结论，自噬蛋白在DNA复制叉处被积极招募，特别是在TOP1cc稳定化后富集显著。
为了进一步验证我们的发现，我们构建了表达溶酶体标记蛋白TMEM192-HA的稳定细胞系（HeLa、HCT116和hTERT RPE-1），并通过LysoIP方法分离出完整的溶酶体（图1E）。这些溶酶体没有被其他细胞器污染，免疫荧光实验显示TMEM192-HA与晚期内体标记物LAMP1共定位良好（图S1C和S1D）。通过LysoIP方法从HeLa细胞中分离出的溶酶体内容物，利用定量质谱进行了分析。结果与之前的研究一致，溶酶体内的常驻蛋白如多种组织蛋白酶、V-ATPases和水解酶得到了分离。有趣的是，CPT处理诱导了许多DNA复制相关和核蛋白的溶酶体摄取，如DNA聚合酶、MCM复合物和核孔蛋白等（图1F；表S2）。在S期同步化细胞中的免疫印迹实验也验证了CPT处理后核心DNA复制蛋白的溶酶体摄取（图1G）。在低剂量CPT处理的HCT116和hTERT RPE-1细胞中，TOP1同样被作为溶酶体的底物（图S1E和S1F）。其他TOP1抑制剂如伊立替康及其活性代谢产物SN-38也诱导了TOP1的溶酶体摄取（图S1G）。综上所述，我们的研究表明，在应对TOP1cc细胞毒性稳定化时，自噬与DNA复制之间的相互作用得到了显著增强。
为了确定自噬在TOP1cc处理中的作用，我们使用特异性的TOP1cc抗体分析了CPT处理后TOP1cc的恢复情况（图2A，S2A，S2B）。研究发现，使用自噬增强剂mTOR抑制剂Torin处理细胞后，TOP1cc的修复速度显著加快。相反，当通过诱导性去除ATG7（选择性自噬的重要蛋白）抑制自噬时，TOP1cc的修复被完全阻断。在使用RADAR实验（该方法可分离共价结合于DNA的蛋白质）评估TOP1cc水平时，ATG7的去除对TOP1cc水平产生了类似的抑制效果（图2B和S2C）。同时，LysoIP实验结果显示，ATG7的失活显著阻止了TOP1进入溶酶体，进一步表明TOP1cc的修复依赖于选择性自噬（图2C）。
为进一步验证自噬在TOP1cc修复中的作用，我们在HeLa细胞中抑制了另外两个选择性自噬因子：syntaxin 17（STX17）和RB1CC1（也称为FIP200）。STX17是参与成熟自噬体与溶酶体融合的SNARE蛋白，而RB1CC1是ULK复合物的组成部分，负责调控自噬的启动。正如预期的那样，去除STX17导致了自噬体双层膜囊泡的累积（图S2D），并且去除RB1CC1和STX17均阻止了TOP1进入溶酶体（图S2E）。此外，STX17的去除完全阻碍了CPT处理后的TOP1cc修复（图S2F）。令人注意的是，ATG7和STX17的缺失都大大削弱了细胞在CPT处理下的存活能力（图2D）。同样，使用bafilomycin A1（BAF）抑制溶酶体酸化和功能增加了细胞对CPT的敏感性；相反，使用Torin增强自噬后，HeLa细胞在CPT处理中的存活率显著提高（图S2G）。这些结果表明，自噬积极参与了TOP1cc的修复，并促进细胞在CPT处理下的存活。
为了进一步验证TOP1在CPT处理下转运至溶酶体，我们使用改良版的mCherry-GFP自噬报告实验来追踪TOP1的转运。mCherry-TOP1-GFP报告蛋白在红色和绿色通道中均可检测到，但当其进入强酸性溶酶体时，GFP荧光会被淬灭，而mCherry荧光则保持不变（图2E）。如预期所示，未处理的细胞在细胞核中表现出明显的红色和绿色信号，反映了TOP1在细胞核中的正常定位（图2F）。值得注意的是，标记的TOP1保持了其原有的DNA结合活性，因为CPT能够稳定结合mCherry-TOP1-GFP和DNA，就像处理内源性TOP1一样（图S2H）。在低剂量CPT处理后（但不是高剂量处理），我们观察到细胞质中仅有红色的荧光点，且伴随GFP/mCherry共定位比例的下降（图2F）。通过bafilomycin A1抑制溶酶体酸化可阻止GFP淬灭，并恢复GFP/mCherry的共定位比例，进一步证明了该实验对检测蛋白进入溶酶体的特异性。此外，ATG7或STX17的失活也阻止了mCherry-TOP1-GFP在CPT处理下转运至溶酶体（图S2I），进一步表明自噬通路调控了TOP1cc的修复及其进入溶酶体的过程。
TOP1通过溶酶体处理的过程令人关注，因为TOP1cc的降解通常由蛋白酶体完成，尤其是在高剂量CPT（μM）处理下。然而，实验显示，高剂量CPT并未诱导mCherry-TOP1-GFP报告蛋白转运到溶酶体中（图2F），也没有观察到通过LysoIP分析的内源性TOP1摄取增加（图3A）。这表明，TOP1仅在临床相关的低剂量CPT（nM级别）下作为溶酶体的底物。
为了研究自噬和蛋白酶体在TOP1cc修复中的相互依赖性，我们使用了低剂量和高剂量CPT，并监测细胞的反应。首先，我们测试了TOP1的溶酶体摄取情况。正如预期的那样，低剂量CPT刺激了TOP1的转运至溶酶体（图3A）。然而，在高剂量CPT处理时，即使蛋白酶体被bortezomib抑制，TOP1也未显示出类似的溶酶体转运。
接着，我们评估了TEX264或RNF4失活对细胞在低剂量和高剂量CPT处理下存活的影响，分别针对自噬和蛋白酶体依赖的TOP1cc降解。TEX264失活特异性阻碍了通过自噬处理TOP1，而RNF4失活则阻止了高剂量CPT引发的蛋白酶体介导的TOP1cc降解。实验结果显示，TEX264失活使细胞对低剂量CPT高度敏感，而RNF4失活使细胞对高剂量CPT敏感（图3B和S3A）。两者同时失活并未进一步增强这种敏感性，表明这两条降解途径是相互独立的。
最后，我们检测了细胞总提取物中TOP1的降解情况（图S3B）。在低剂量和高剂量CPT处理下，TOP1均发生降解。然而，在低剂量CPT处理下，只有自噬抑制能够恢复TOP1水平，而在高剂量CPT下，只有蛋白酶体抑制才能恢复TOP1水平。因此，自噬和蛋白酶体都能降解TOP1cc，但这两条途径是独立运作的。
之前的研究表明，低剂量和高剂量CPT引发的DNA损伤类型不同。低剂量CPT主要引发DNA复制压力，表现为DNA复制叉进展缓慢以及γ-H2AX激活，但不会与双链断裂标记物53BP1共定位。相反，高剂量CPT会几乎完全阻止DNA复制叉，并导致双链断裂的形成。免疫荧光检测显示，低剂量CPT仅诱导γ-H2AX的激活，而高剂量CPT则激活了γ-H2AX和53BP1（图S3C）。基于这些结果，我们推测DNA复制压力信号可能触发自噬介导的TOP1cc处理。实际上，ATR激酶（负责复制压力信号传导）的抑制显著阻止了TOP1cc转运至溶酶体（图3C），而ATM激酶（负责双链断裂修复）的抑制则对此没有影响。此外，ATR抑制阻止了低剂量CPT处理后p97与TOP1的结合增强，这一过程依赖于p97的辅因子TEX264（图3D）。
综上所述，低剂量CPT诱导的DNA复制压力通过自噬途径处理TOP1cc，而这一途径与RNF4依赖的蛋白酶体介导的TOP1cc降解途径是相互独立的。
选择性自噬最初被描述为清除细胞内蛋白质聚集的途径。为了研究在复制压力下溶酶体降解TOP1的作用，我们在低剂量CPT后监测了蛋白质聚集的形成。简而言之，Proteostat染料在与蛋白质聚集体的淀粉样β-折叠三级结构结合时会发出荧光。抑制自噬结合低剂量CPT处理会导致蛋白质聚集物的急剧积累，主要与溶酶体和晚期内体标记LAMP1共定位（图3E）。使用洗涤剂对蛋白质聚集物进行生化纯化证实了在溶酶体功能被bafilomycin A1抑制时，低剂量CPT可导致TOP1聚集物的形成（图S3D）。相比之下，高剂量CPT不会诱导TOP1聚集物的形成。这一观察进一步支持了我们之前的发现，即在高剂量CPT（形成DSB的地方）中TOP1降解与溶酶体无关。这些结果表明，在低剂量CPT下，TOP1cc修复依赖于自噬来防止由聚集物形成引起的蛋白毒性应激。
在CPT的nM剂量下，全长TOP1成为自噬的直接底物，如mCherry-TOP1-GFP报告基因分析（图2F）和LysoIP分析（图1G、2C、3A和3C）所示。聚焦低剂量CPT，我们假设溶酶体处理整个DNA损伤，包括TOP1及其相关的DNA片段。如果是这样，TOP1cc应该通过DNA核酸酶进行切割以允许其被运输到溶酶体中。
我们研究了已知核酸酶和磷酸二酯酶在TOP1cc处理中的作用，包括MRE11、18、20 MUS81、83、84、85和TDP1。4、17有趣的是，无论是耗尽MUS81，它在修复DNA复制叉坍塌时促进DSB形成，86还是TDP1，它在上游蛋白水解后切割残余的TOP1cc肽段，都不能阻止TOP1cc运输到溶酶体（图4A和4B）。相反，MRE11核酸酶的失活强烈地消除了TOP1cc运输到溶酶体的能力（图4A）。
为了直接评估溶酶体是否处理与TOP1cc损伤相关的DNA片段，我们对完整溶酶体中纯化的DNA进行了定量和表征。在CPT和bafilomycin A1联合处理后，观察到溶酶体中的DNA片段小于500 bp（图4C、S4A和S4B）。这表明完整的DNA损伤、TOP1及其相关的DNA片段被运输到溶酶体进行降解。
NGS结果显示，从完整溶酶体中分离出的DNA片段超过98%来自细胞核（图4D）。TOP1在DNA上没有共识结合区域，并且发现在活性转录位点之前的超螺旋区域，如内含子87,88或复制性的着丝粒区域。28,89引人注目的是，分离的溶酶体DNA片段的序列分析主要代表内含子和着丝粒区域（图4E）。为了研究从溶酶体中分离出的DNA片段是否可能与TOP1共价连接，我们将三个已发表的TOP1染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）结果87,88与我们自己的LysoIP-seq数据进行了重叠。从溶酶体中分离出的测序DNA片段与三个已知的TOP1/TOP1cc ChIP-seq数据集重叠度为88.6%（图4F、4G和S4C）。三个独立的TOP1 ChIP-seq数据集之间的重叠相似（约85%）。这些数据证明，与TOP1共价结合的细胞核DNA区域响应低剂量CPT而被转移到溶酶体中。
使用针对TOP1cc的特异性单克隆抗体进行的免疫荧光染色，但不是单独的TOP1，69,70确认了在低剂量CPT处理下，细胞质中存在TOP1cc，但在高剂量CPT处理下不存在（图4H和S4D）。总的来说，我们得出结论，溶酶体积极地处理整个TOP1cc损伤，包括它们的蛋白质部分和相关DNA片段。
由于低剂量CPT直接招募自噬蛋白到DNA复制叉的压力位点（图1B-1D）以及溶酶体对复制蛋白的摄取（图1F和1G），我们假设自噬修复TOP1cc发生在S期。为了测试这一假设，使用胸腺嘧啶阻断同步化细胞在G1/S期，然后释放并处理低剂量CPT6小时以稳定S期的TOP1cc。确实，S期溶酶体中的TOP1摄取增加（图5A）。
为了研究TOP1是否能在间期退出细胞核，我们追踪了用LysoView染色的活细胞中的mCherry-TOP1-GFP报告基因（图5B；视频S1和S2）。在CPT处理后的30分钟内，一个mCherry/GFP阳性的突起从细胞核中出现，最终形成一个与溶酶体融合的新mCherry/GFP囊泡，由于GFP淬灭而主要变为红色。最后，随着消化过程的完成，仅呈红色的囊泡消失。这种活细胞成像，结合固定细胞中仅呈红色的胞浆斑点的定量分析（图2F和图S2I），证明了当核膜完整时，TOP1cc通过自噬途径在间期发生降解。
为了研究细胞周期蛋白（CPT）在间期对核膜状态的影响，我们通过活细胞成像技术监测了GFP标记的Lamin A/C后的核膜结构（图5C；视频S3）。间期核膜破裂（NERDI）是在严重应激条件下多种癌细胞系中观察到的屏障通透性暂时丧失的现象。NERDI与形成缺乏核膜结构的核膜突起倾向有关。值得注意的是，在暴露于CPT后的30分钟内，核膜会发生短暂的局部重塑。细胞渲染显示，核膜结构变薄，主要在溶酶体接触部位观察到。这表明，低剂量CPT会导致核膜发生短暂的局灶性破裂。
我们使用透射体积电子显微镜观察经CPT处理后的核膜（图5D和S5A；视频S4）。生理条件下，内层核膜（INM）与外层核膜（ONM）之间的距离约为50纳米，在我们的对照细胞中也得到了复制。然而，CPT处理后发现这一空间异常扩大至超过150纳米，形成了向细胞质突出的水泡状结构。为了排除固定过程中对膜结构的技术性伪影，我们通过高压冷冻确认了在CPT作用下水泡状结构的形成（图S5B）。冷冻聚焦离子束（FIB）磨削以及使用LysoTracker染料获得的冷冻荧光相关图像显示溶酶体与水泡状结构接近（图5E和S5D）。
有趣的是，在ER压力下，核膜上出现了类似的泡状结构。这些变化通过ONM的不对称自噬性消化得到解决。这与LysoIP质谱鉴定出的完整溶酶体中核膜蛋白的富集是一致的（图1F和1G）。此外，主要核孔运输受体exportin-1的抑制剂leptomycin B，它涉及核酸的输出，并没有影响TOP1cc对CPT反应的细胞质定位（图S5C）。
总之，通过活细胞成像和电子显微镜观察到的核突起以及观察到的层状结构的变化表明，溶酶体对TOP1cc的处理是通过核膜直接发生的。
为了确保细胞存活并允许增殖，溶酶体对遗传物质的降解和核膜的改变必须受到严格调控。到目前为止，我们的数据显示溶酶体对TOP1cc的处理依赖于由ATG7、syntaxin 17和RB1CC1介导的选择性自噬（图2和图S2）。选择性自噬是由特定的自噬受体紧密调控和协调的，这些受体可以结合到货物蛋白上。在已知的42个自噬受体中，有6个在CPT处理后完整溶酶体中富集（图6A；表S3）。在这六个已鉴定的溶酶体自噬受体中，有五个也存在于DNA复制叉处，由NCC-SILAC蛋白质组学鉴定，包括TEX264。鉴于TEX264最近被认为对于TOP1cc修复至关重要29以及细胞对低剂量CPT的存活（图3B），我们询问了TEX264是否是介导自噬性TOP1cc修复的自噬受体。
TEX264基因敲除的HeLa细胞TOP1cc修复功能受损，与野生型（WT）细胞相比，对CPT的敏感性增强（图3B、S6A和S6B）。通过TEX264-V5-WT对TEX264基因敲除细胞进行互补，完全恢复了细胞存活和TOP1cc修复功能（图S6A和S6B）。结构分析和先前的相互作用研究表明，TEX264中存在明确的结构域，如TOP1结合位点（TBS）、LIR、p97结合基序（SHP）、SUMO互作基序（SIM）以及一个磷酸化位点29,33,34,100（图6B）。为了直接研究TEX264在自噬降解TOP1cc中的作用，我们在TEX264基因敲除背景下创建了稳定的TEX264-V5 HeLa细胞系，表达TEX264-WT或TEX264变体。工程化表达TEX264变体的细胞得到了验证，显示出轻微的表达水平和核周适当的细胞定位（图6C、S6C和S6D）。
通过在TEX264的TBS、LIR或SHP结构域中引入突变，分别破坏了其与TOP1、LC3或p97的结合，与TEX264野生型（WT）表达相比，这消除了TOP1cc修复（图6C）。此外，表达TEX264变体的细胞，这些变异阻止了它们与TOP1、LC3、p97或SUMO1的结合，在将TOP1运输到溶酶体方面存在缺陷（图6D）。然而，在靠近TEX264的LIR结构域的磷酸化位点上的突变，对将TOP1运输到溶酶体没有影响。由于在饥饿状态下，TEX264临近LIR区域的两个丝氨酸残基的磷酸化调节了其在ER-自噬中的受体活性，我们得出结论：这些磷酸化位点调控了它在ER-自噬中的作用，而不是TOP1cc的自噬作用。
相比之下，TEX264的SIM结构域中的突变强烈降低了溶酶体中TOP1的摄取（图6D）。一致地，使用特定的E1-SUMO激活酶抑制剂（ML792，图S6E）完全阻断了TOP1cc向溶酶体的传递。这些数据表明，溶酶体对TOP1cc的处理依赖于SUMO。由于E3-SUMO连接酶PIAS4和针对SUMO的泛素连接酶RNF4对于直接将TOP1cc引导至蛋白酶体降解至关重要，我们研究了它们在调节TOP1传递到溶酶体中的作用。有趣的是，无论是PIAS4还是RNF4的耗竭都没有阻止TOP1摄取达到特定E1-SUMO激活酶抑制剂的水平（图S6E）。这意味着SUMO化调节了TOP1cc溶酶体处理，但以PIAS4独立的方式进行。最后，与TEX264-WT细胞相比，TEX264变体对于结合TOP1、LC3、p97和SUMO的功能缺陷对CPT治疗更敏感（图6E）。
ATG7调节TEX264分别与复制体和自噬机器、MCM7和LC3的结合（图S1A）。因此，我们使用TEX264-V5和LC3-GFP之间的邻近性连接试验（PLA）（图6F）研究了细胞中TEX264-自噬级联开始的位置。如前所述，TEX264-LC3相互作用存在于细胞质中。然而，PLA显示TEX264还与核内的LC3相互作用，靠近核边缘。重要的是，当TEX264-LIR结构域发生突变时，TEX264/LC3相互作用被消除。基于核内的TEX264-LC3相互作用、依赖LIR基序将TOP1传递到溶酶体（图6D）以及响应CPT处理在DNA复制叉位点招募这两种蛋白（图1C和1D），我们得出结论：TEX264是核内停滞DNA复制叉位点通过自噬降解TOP1cc的受体。
为了研究p97在通过自噬途径处理TOP1cc中的作用，我们使用了特异性p97抑制剂CB-5083，它不会影响自噬通量。同样地，与TEX264-SHP变体类似，p97的抑制消除了TOP1向溶酶体的转移和TOP1cc修复（图S6F和S6G）。SPRTN最近被确认为p97和TEX264在TOP1cc修复中的合作伙伴，因此我们研究了SPRTN在TOP1cc自噬中的作用。有趣的是，SPRTN的失活并没有影响TOP1cc向溶酶体的传递（图S6H），但在溶酶体功能被阻断时导致了细胞质聚集的形成（图S7A）。我们得出结论，SPRTN在S期处理内源性TOP1cc，并且其失活结合溶酶体失活会导致聚集形成增加。这些结果表明，p97-TEX264复合物独立于SPRTN蛋白酶功能协调TOP1cc向溶酶体的传递。
为了研究TEX264在个体水平上的作用，我们使用了斑马鱼模型。通过使用反义寡核苷酸（tex264MO）特异性地沉默斑马鱼胚胎中的tex264基因，然后通过共注射到1至4细胞期胚胎中，用tex264-WT或LIR∗序列进行互补。尽管有效地沉默了tex264并适当表达了tex264，但我们没有观察到2天大的斑马鱼胚胎中出现任何表型变化（图7A）。从2天大的胚胎中分离出总基因组DNA，并通过RADAR检测分析了TOP1cc水平（图7B）。tex264的失活导致内源性TOP1cc比野生型对照胚胎增加了近两倍。表达tex264-WT，而不是自噬途径缺陷变体tex264-LIR∗，防止了在tex264耗尽背景下的TOP1cc积累。这些数据表明，TEX264及其在TOP1cc修复中的自噬作用在进化上是保守的，并且在个体水平上也是相关的。
我们的发现表明，在脊椎动物中，选择性自噬直接参与了特定类型核DNA损伤（TOP1cc）的修复（图7D）。当选择性自噬处理核DNA损伤时，我们将这一过程称为核吞噬。本文描述的核吞噬机制可以处理内源性和化疗相关的TOP1cc损伤，这些损伤由核酸酶MRE11从DNA复制叉处切除。TOP1及其相关DNA片段通过暂时性和受限的核膜改变被挤出细胞核并输送到溶酶体中。有趣的是，除了TOP1cc外，我们还观察到在CPT诱导的DNA损伤后，复制体组分也出现在溶酶体中。这表明，很可能是在TOP1cc停滞的复制体被核吞噬切除和清除。我们专注于研究TOP1cc核吞噬的机械细节。然而，复制体或其组分被运输到溶酶体的原因尚不清楚，未来需要解决这个问题。
通过比较低剂量和高剂量的CPT（拓扑异构酶I抑制剂），我们能够阐明TOP1cc的核酸吞噬作用与停滞的DNA复制有关。这个过程在DNA复制叉崩溃并转化为双链断裂（DSBs）时被抑制。在高剂量CPT下，TOP1cc降解主要依赖于蛋白酶体活性。21,22,23,24,25我们假设细胞中TOP1cc降解途径的选择取决于损伤的拓扑可及性。DSBs在DNA损伤周围创造了更大的灵活性112,113，并且可能比DNA复制叉仅停滞时的更紧密构型更有利于招募蛋白酶体和下游DNA损伤修复蛋白。有趣的是，在受损线粒体（线粒体自噬）的降解中也观察到了类似的阈值概念激活选择性自噬。114响应线粒体应激，自噬调节去除有缺陷的线粒体。然而，慢性应激会导致线粒体自噬完全停止，以防止细胞内线粒体的潜在耗竭。
具体来说，我们鉴定出自噬因子TEX264是TOP1cc核内吞的受体。TEX264介导的核内吞促进DNA复制叉稳定性、基因组稳定性和细胞对CPT诱导的DNA损伤的存活反应。TEX264连接TOP1cc、停滞的DNA复制和溶酶体，并以ATR依赖但非ATM依赖的方式协调DNA损伤向溶酶体的输出，进一步支持了TOP1cc核内吞与DNA复制相关的模型。
问题出现了：其他降解系统，即蛋白酶体和SPRTN蛋白酶，在DNA复制叉停滞期间去除TOP1cc的过程中扮演什么角色，如先前报道的那样？29,30,31,115 蛋白酶体活性的失活对许多细胞功能产生了多效性影响，包括自由核泛素耗竭。116,117 通过失活促进蛋白酶体降解TOP1cc的E3泛素连接酶RNF4，25,76,77我们克服了蛋白酶体抑制的多效性效应，并证明了人类细胞在暴露于诱导DNA复制压力而非双链断裂（DSBs）的低剂量CPT时，对RNF4失活并不敏感。我们的实验还表明，低剂量CPT后，蛋白酶体不影响总的TOP1降解。我们得出结论，蛋白酶体在降解DNA复制位点周围的TOP1cc方面没有显著作用。相反，SPRTN蛋白酶被证明能够在DNA复制位点周围处理TOP1cc29,30,31,115，并且SPRTN被证明能够与TEX264和p97形成物理复合物以处理与复制相关的TOP1cc损伤29。然而，SPRTN蛋白酶在DNA复制叉进展过程中特异性地切割可溶性蛋白质，包括TOP1cc，它位于TDP1的上游。这种酶在SPRTN蛋白水解后从DNA中去除剩余的肽段29,30,31,115,118。无论是SPRTN还是TDP1失活都不能阻止TOP1运输到溶酶体，但SPRTN失活增加了聚集体的形成。基于这些事实和对SPRTN作用的先前了解，我们得出结论，p97-SPRTN复合物在DNA复制叉进展过程中移除可溶性TOP1cc。
这项工作提供了证据，表明p97-TEX264途径在DNA复制期间也在运作，并通过选择性核苷酸清除不可溶或聚集的TOP1cc。该途径依赖于MRE11对DNA损伤的核酸内切切割，并且独立于SPRTN-TDP1处理。我们的结论进一步得到了低剂量CPT诱导聚集形成的事实支持，但高剂量CPT则不会。
通过发现TEX264调控的核噬途径，我们直接证明了在脊椎动物中存在核噬作为专门的DNA修复途径。这条途径是否也作用于其他DNA-蛋白质加合物还有待进一步研究。在用低剂量CPT处理的TEX264失活细胞中增加的T>A突变谱导致了类似于SBS25104、105、106和SBS34107的突变特征，这两种特征的病因尚不清楚。这一发现强化了我们的观点，即TEX264调控的TOP1cc核噬途径是一种DNA修复机制，当其失活时会导致特定的单碱基替换（SBS）特征，不属于之前描述过的DNA修复途径。
通过发现TEX264调控的核噬途径，我们直接证明了在脊椎动物中存在核噬作为专门的DNA修复途径。这条途径是否也作用于其他DNA-蛋白质加合物还有待进一步研究。在用低剂量CPT处理的TEX264失活细胞中增加的T>A突变谱导致了类似于SBS25104、105、106和SBS34107的突变特征，这两种特征的病因尚不清楚。这一发现强化了我们的观点，即TEX264调控的TOP1cc核噬途径是一种DNA修复机制，当其失活时会导致特定的单碱基替换（SBS）特征，不属于之前描述过的DNA修复途径。
总之，我们报告了TEX264协调的TOP1cc损伤的选择性核噬作为脊椎动物中进化上保守的DNA修复途径，该途径在DNA复制位点或周围运作。这一临床相关的途径在用TOP1抑制剂伊立替康治疗的结直肠癌患者中提高了50%的无进展生存期（PFS）。我们认为这项工作为生物学、癌症治疗和衰老研究开辟了新的途径。
我们认为TOP1cc的核酸噬是一种在核周边缘的DNA复制位点发生的DNA修复过程。尽管我们展示了自噬和蛋白酶体分别基于低剂量（停滞的DNA复制）和高剂量（DSB）CPT诱导的DNA结构在TOP1cc修复中发挥作用，但仍然未知不同TOP1cc修复途径如何在低剂量CPT下协同工作。有趣的是，高剂量CPT也在DNA复制位点（或周围）招募自噬因子，但其程度低于低剂量CPT。停滞或断裂的复制叉（转化为DSBs）与溶酶体之间的交流应进一步研究。最后，暂时性的核膜改变是如何形成以及如何允许DNA损伤运输到溶酶体的尚未被发现。需要进一步的工作来解决上述问题，并可能将这一概念应用于临床。
细胞培养和转染
除非另有说明，否则所有实验均在HeLa细胞中进行。HeLa、HEK293T、HCT116和hTERT RPE-1细胞均来自ATCC，并在含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的Dulbecco改良的鹰式培养基（DMEM）中生长，温度为37°C，CO2浓度为5%。所有细胞系都定期使用MycoAlert™支原体检测试剂盒筛查支原体污染。使用胸腺嘧啶（2 mM）进行细胞同步化处理。用巴弗霉素A1（BAF，50 nM）、Torin-1（克隆形成实验为150 nM，免疫印迹和免疫荧光分析为250 nM）、莱普托霉素B（LTB，10 nM）、MG132（2 μM）、CB-5083（10 μM）、VE-822（贝佐塞替布，ATR抑制剂，1 μM）、KU-55933（ATM抑制剂，1 μM）、伊立替康（5 μM）、SN38（50 nM）、ML792（1 μM）或硼替佐米（5 μM）对贴壁细胞进行处理指定的时间。除非另有说明，否则使用50 nM的喜树碱（CPT）进行处理（100 nM或1 μM）。活细胞成像实验是在FluoroBrite™ DMEM中进行的。
用于报告分析的mCherry-TOP1-GFP构建体的克隆是通过将TOP1 DNA序列29插入到mCherry-GFP-pEGFP-N1（Addgene）骨架中进行的。由于将TOP1插入到慢病毒骨架中的克隆程序具有挑战性，因此使用上述构建体mCherry-TOP1-GFP-pEGFP-N1进行了瞬时表达。在成像之前，它瞬时表达了24小时。通过KpnI和BamHI对骨架进行线性化。使用Phusion Hot Start II高保真DNA聚合酶（Thermofisher）以及引物（KpnI_TOP1_F和BamHI_TOP1_R）来扩增TOP1序列。按照制造商的说明，使用NEBuilder®HiFi DNA Assembly克隆试剂盒（NEB）进行连接。
克隆TEX264-V5-pLX313质粒是通过使用先前生成的TEX264序列进行的，包括WT或TEX264 E194A（TBS*），F273A（LIR*），G280R，G282R，L284A（SHP*），I141A，S143A，W145A（SIM*）或S271A，S272A（P*）。pLX313-TP53-WT质粒（Addgene）被用作所有TEX264-V5-pLX313质粒的骨架。通过NHeI-HF和EcoRV-HF消化骨架以去除TP53。TEX264序列通过Phusion Hot Start II高保真DNA聚合酶（Thermofisher）和引物（TEX-pLX313_Fwd和TEX-pLX313_Rev）进行扩增。NEBuilder® HiFi DNA Assembly克隆试剂盒（NEB, E5520S）根据制造商的协议将TEX264序列插入到pLX313骨架中。使用EF1a_Fwd和WPRE_Rev引物（Invitrogen）对正确插入的序列进行了测序。所有质粒均由Source BioScience, Oxford, UK进行测序。
斑马鱼实验是通过tex264互补性进行的。全长tex264-WT基因片段通过引物（tex264_F和tex264_R）从受精后2天的胚胎cDNA中扩增出来，并使用XhoI和XbaI限制位点将其克隆到pCS2+HisMyc表达载体（Addgene）中，使用In-Fusion® Snap Assembly Master Mix（Takara Bio USA, Inc.）完成。使用QuikChange Lightning Multi Site-Directed Mutagenesis Kit（Agilent）和引物（tex264_F283A LIR mutagenesis）对tex264-pCS2+HisMyc质粒进行修改，以创建tex264 F283A LIR*突变体。使用NotI对质粒进行线性化处理，并通过HiScribe SP6 RNA kit（NEB）以及ARCA kit（NEB）体外转录生成带有帽的mRNA。随后使用Monarch® RNA cleanup kit（NEB）对mRNA进行纯化，以便后续注射。
使用聚乙烯亚胺（PEI）进行瞬时质粒转染，用于生化应用，或使用FuGENE®进行显微镜观察，均按照制造商的说明进行。所有siRNA转染均使用Lipofectamine™ RNAiMAX进行，根据制造商的协议进行，并在72小时后进行检测。
通过转染HEK-293T细胞和含有感兴趣的插入片段的转移质粒来产生慢病毒，该插入片段由病毒的LTR两侧夹持。然后将CMV-pAmphoR包膜质粒和CMV-Δ8.2R包装质粒与之结合。转染使用PEI（DNA:PEI比例为3微克:1微升）进行。转染后50小时，收集含病毒的超滤液并离心以去除细胞，然后用0.45微米PVDF滤器过滤。通过在6孔板中接种50万细胞，加入250微升DMEM培养基（其中含有10%胎牛血清、8微克/毫升多布瑞纳和750微升含病毒的培养基）来制备稳定细胞系。16小时后开始用抗生素选择。经过克隆扩增后，获得的克隆通过免疫印迹和免疫荧光检测正确插入情况。使用pLJC5-TMEM192-3xHA构建体在HeLa、HCT116和hTERT RPE-1细胞中生产稳定表达TMEM192-3xHA的细胞系。在HeLa TEX264KO细胞中使用pLJC6-3XHA-TMEM192构建体进行LysoIP实验，因为这些细胞已经对普利霉素具有抗性。
为了诱导ATG7的耗竭，在实验前4天和2天分别向细胞中加入了1微克/毫升的多西环素。为了诱导p97-Myc/Strep的表达，在实验前24小时向细胞中加入了1微克/毫升的多西环素。在TEX264KO背景下生成了稳定表达TEX264 WT及其不同突变的细胞系，并用于克隆形成实验和免疫荧光实验。使用相同的质粒进行了瞬时转染，并通过免疫沉淀验证了质粒，并提供了免疫荧光实验的代表性图像。在没有互补或瞬时siTEX264耗竭的新鲜制备的TEX264KO HeLa细胞中，LysoIP仍然显示出TOP1在内溶酶体中的摄取。大约经过10代后，细胞的定植阻止了TOP1的摄取。
AB品系的斑马鱼（Danio rerio）是从德国卡尔斯鲁厄的欧洲斑马鱼资源中心（EZRC）获得的，其饲养和护理遵循了伦理指南（欧盟指令86/609/EEC，克罗地亚联邦动物保护法），项目许可证号为HR-POK-023。根据既定协议，斑马鱼在28°C的温度下，每天14小时光照和10小时黑暗的环境中饲养。斑马鱼胚胎（雌性和雄性）在相同的温度和光照周期下，用E3培养基（5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2和0.33 mM MgSO4）培养，直到它们达到受精后第2天（dpf）。在进行实验之前，对胚胎进行了手动去卵黄囊处理。在6 hpf、30 hpf和48 hpf时观察并记录表型。使用具有f/1.9光圈的Samsung 1300万像素相机拍摄图像，该相机安装在双筒显微镜Motic SMZ-171的目镜上。
分析了来自参与随机对照MRC FOCUS试验的晚期结直肠癌患者的361个甲醛固定的石蜡包埋的原发性切除标本的转录组。所有关于患者特征、同意书和研究设计的数据均在此报告。患者需要通过组织病理学确诊为结直肠腺癌，伴有不可手术的转移性或局部区域性疾病。这些患者开始一线治疗时，非治愈性意图，在试验中随机分配接受单药5-氟尿嘧啶（每两周48小时给予左旋亚叶酸钙）或5-氟尿嘧啶联合伊立替康（FOLFIRI - 75名患者）治疗，直至疾病进展。该研究已注册为国际标准随机试验（ISRCTN 79877428）。
原文地址：https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(24)00911-5?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS0092867424009115%3Fshowall%3Dtrue
