【文献解读】通过Rad51DBD整合的单碱基编辑器提高斑马鱼基因组的精准碱基编辑
文摘
科学
2024-10-23 17:01
江苏
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文献：Zhong Z, Hu X, Zhang R, Liu X, Chen W, Zhang S, Sun J, Zhong TP. Improving precision base editing of the zebrafish genome by Rad51DBD-incorporated single-base editors. J Genet Genomics. 2024 Oct 18:S1673-8527(24)00280-7. doi: 10.1016/j.jgg.2024.10.006. Epub ahead of print. PMID: 39428086.
杂志：Journal of Genetics and Genomics
单碱基编辑器，包括细胞苷碱基编辑器（CBE）和腺苷碱基编辑器（ABE），能够精准地将C•G转化为T•A及A•T转化为G•C，具有用于精确建模和治疗人类遗传疾病的潜力。通过与Rad51 DNA结合域（Rad51DBD）融合的碱基编辑器，例如hyA3A-BE4max，在人类细胞中实现了高效的碱基编辑和扩展的碱基转化范围。在本研究中，我们展示了hyA3A-BE4max能够催化斑马鱼基因组中的C到T的替换，并扩展了编辑位置（C12–C16），接近原位邻接基序。我们开发了密码子优化的相应编辑器zhyA3A-CBE5，其C到T的转化效率相比于原始的hyA3A-BE4max提高了1.59至3.50倍。利用这些工具，可以更有效地在斑马鱼中产生与疾病相关的遗传突变。我们通过zhyA3A-CBE5引入了人类遗传突变rpl11Q42*和abcc6aR1463C，分别模拟了Diamond-Blackfan贫血和弹力纤维性假黄瘤。本研究扩展了针对斑马鱼基因组的碱基编辑平台，并推动了单碱基编辑器在疾病建模和基因功能研究中的应用。人类遗传疾病的主要致病突变来源于单核苷酸变异。G•C转为A•T和T•A转为C•G的突变分别占所有遗传变异的48%和14%。细胞苷和腺苷碱基编辑器（CBE和ABE）是通过将核苷酸去氨基酶与spCas9 D10A切割酶（spCas9n）融合开发的，能够催化单核苷酸替换而不引发双链DNA断裂（DSBs）。多种策略已被应用于提高编辑效率和特异性、扩展编辑窗口以及改变原位邻接基序（PAM）的兼容性。除了单碱基编辑器外，还开发了双碱基编辑器，能够同时实现A到G和C到T的转换。同时，针对A到C和A到T的腺苷转变碱基编辑器也已被开发。不断发展和改进碱基编辑工具系统对推进生物医学领域在疾病建模、谱系追踪、基因治疗和遗传多样性筛选中的应用至关重要。斑马鱼作为一种强有力的遗传模型，在阐明胚胎发育、器官形态发生和疾病建模方面发挥了重要作用。最初在斑马鱼中应用的单碱基编辑器利用了一种与rAPOBEC1去氨基酶和尿嘧啶糖苷酶抑制剂（UGI）融合的密码子优化spCas9n（zBE3），实现了一定程度的编辑效率。在此基础上，zAncBE4max是基于CBE4max优化的，包含一个双部分核苷酸引导信号（bpNLS）和两个UGI，其平均编辑效率较zBE3提高了2.45倍。此外，PAM独立的SpRY系统，包括SpRY-CBE4max和优化密码子的SpRY-ABE8e，揭示了斑马鱼基因组中无PAM位点的广泛碱基编辑活性。尽管几种经过密码子优化的单碱基编辑器能够有效催化斑马鱼胚胎中的核苷酸替换，但与人类细胞和植物相比，它们的效率和编辑窗口仍有限。人类Rad51DBD对DNA的识别和结合至关重要。在超活性细胞苷碱基编辑器hyA3A-BE4max中引入Rad51DBD可提高效率并扩展编辑窗口。我们之前的研究报告显示，将Rad51DBD与腺苷碱基编辑器（hyABE8e）融合，扩大了靠近PAM的编辑窗口，并在斑马鱼F0胚胎中生成完整的35A>G和rps14E12G突变，重现了骨髓异常综合症的贫血表型。然而，Rad51DBD整合的细胞苷碱基编辑器在斑马鱼基因组中的适用性尚待阐明。在本研究中，我们分析了Rad51DBD整合的细胞苷碱基编辑器（hyA3A-BE4max）在斑马鱼中对广泛基因靶标的编辑能力。我们开发了密码子优化的碱基编辑器zhyA3A-CBE5，其表现出强烈的C到T替换活性和更广泛的编辑窗口（C3-C16）。比较分析显示，zhyA3A-CBE5的最大编辑效率范围为18.86%至62.30%，显著高于原始的hyA3A-BE4max（12.17%–40.63%）。我们在斑马鱼中引入了人类遗传突变rpl11Q42*和abcc6aR1463C，分别重现了Diamond-Blackfan贫血和弹力纤维性假黄瘤的病理特征。因此，我们的研究为斑马鱼中精准基因组编辑提供了高效且经过密码子优化的碱基编辑器。结果
整合Rad51DBD的细胞苷碱基编辑器在斑马鱼基因组中实现了高效编辑
超活性细胞苷碱基编辑器hyA3A-BE4max包含几个关键成分，其特征是将Rad51DBD与spCas9n和人类APOBEC3A细胞苷去氨基酶（A3A）融合，并结合了两个UGI和一个bpNLS（图1A）。为优化hyA3A-BE4max在斑马鱼胚胎中的表达和编辑能力，我们根据斑马鱼的密码子使用偏好、GC含量以及最小化二级mRNA结构进行了密码子优化，而不改变氨基酸序列。经过优化的hyA3A-BE4max碱基编辑器被命名为zhyA3A-CBE5（图1A和1B）。![]()
图1 密码子优化的zhyA3A-CBE5在斑马鱼中高效诱导C至T碱基转换接下来，我们分析了引入Rad51DBD的hyA3A-BE4max和斑马鱼优化的对应物zhyA3A-CBE5的编辑能力。选择了12个靶基因，包括egfra、tyr、pspc1、ddx17、rps14、abcc6a、dmd、slc22a7a、gdf6、musk、abcc4和ntl，其中一些已被证明可以在斑马鱼中编辑。我们在斑马鱼一细胞阶段微注射了2 nL的hyA3A-BE4max或zhyA3A-CBE5 mRNA与每个靶sgRNA的混合液。注射后48小时（hpf）发育的6个胚胎池被取出，提取基因组DNA以构建高通量扩增子测序（HTS）文库（图1C）。结果发现，hyA3A-BE4max在12个靶基因的不同原位位置诱导了高效的C到T转换（图1D）。相比于hyA3A-BE4max，优化后的zhyA3A-CBE5显著提高了核苷酸编辑效率（图1D）。值得注意的是，zhyA3A-CBE5和hyA3A-BE4max都展现了更广泛的编辑窗口（C3–C16），与之前描述的zAncBE4max（C3–C7）相比（图1E）。通过分析每个靶基因中最有效的编辑位置的效率，我们发现zhyA3A-CBE5的C到T编辑效率范围为18.86%至62.30%，显著高于hyA3A-BE4max（12.17%–40.63%）（图1D）。我们进一步计算了zhyA3A-CBE5在每个靶位点的每个原位位置的平均C到T编辑效率（图1E）。特别是，在经典编辑窗口（C3–C11）内，zhyA3A-CBE5的编辑效率平均为C3的2.27%、C4的21.40%、C5的34.30%、C6的48.50%、C7的40.69%、C8的35.82%、C9的26.89%、C10的14.69%和C11的10.29%，相比于hyA3A-BE4max提高了1.99到2.62倍（图1E）。这些是没有插入或缺失（indels）或其他不期望突变的精确C到T转换效率。然而，在低频率下，indels偶尔与C到T转换同时发生。在12个靶位点中，包含indels和C到T转换的频率分别为hyA3A-BE4max的2.8%和zhyA3A-CBE5的3.1%（表S1）。有趣的是，在12个基因中，9个靶基因（gdf6、musk、rps14、dmd、pspc1、abcc6a、egfra、slc22a7a、abcc4）在TC基序位点上表现出高效的编辑活性，2个靶基因（ntl和tyr）在CC基序上，1个靶基因（ddx17）在AC基序上（表S2）。这一观察结果与之前的研究一致，表明人类APOBEC3A（A3A）和APOBEC3G（A3G）基础的CBE编辑器主要在TC和CC基序上催化C到T的转换。此外，我们观察到C到T的转换扩展到了靠近PAM区域的原位位置，zhyA3A-CBE5的编辑效率平均为4.27%–41.38%，几乎比hyA3A-BE4max（1.17%–21.39%）高出1.59到3.50倍（图1E）。另外，zhyA3A-CBE5生成的突变等位基因类型多于hyA3A-BE4max（图1F），这表明zhyA3A-CBE5的高编辑活性导致了丰富的等位基因类型。因此，优化后的zhyA3A-CBE5在经典编辑位置（C3–C11）和靠近PAM的原位位置（C12–C16）具有两个不同的编辑窗口，且效率高于hyA3A-BE4max（图1G）。重要的是，zhyA3A-CBE5与hyA3A-BE4max相比，indels的形成相当（图1H）。以往关于CBE的研究表明，在C到T转换的相同原位位置上，C到G和C到A的转化水平相对较低。我们分析了高通量测序（HTS）数据集，观察到在所有12个靶位点的编辑窗口内，C到A转化的水平非常低（zhyA3A-CBE5为0.6%–1.9%；hyA3A-BE4max为1.4%–4.7%），C到G转化的水平也很低（zhyA3A-CBE5为0.3%–4.8%；hyA3A-BE4max为0.4%–6.4%）（图2A和2B；表S3），这与之前在人类细胞和植物中的研究一致。接下来，我们测试了碱基编辑器mRNA的剂量效应，发现过量表达zhyA3A-CBE或hyA3A-BE4max在高剂量（300–400 ng/μL）下会导致生长缺陷和形态变化，但在正常剂量（100–200 ng/μL）下则没有出现这种情况（图S1A–S1C）。![]()
图2 zhyA3A-CBE5与hyA3A-BE4max的脱靶评估为评估zhyA3A-CBE5和hyA3A-BE4max在斑马鱼中的Cas9依赖性脱靶活性，我们分析了针对musk-sgRNA和dmd-sgRNA位点的6个潜在脱靶位点，这些位点由Cas-OFFinder预测。结果表明，除了主要的C到T转换外，zhyA3A-CBE5在这些潜在脱靶位点上的脱靶编辑几乎不可检测（图2C）。与原始的hyA3A-BE4max相比，优化后的zhyA3A-CBE5没有表现出更高的脱靶编辑效率（图2D），这表明zhyA3A-CBE5的密码子优化并未损害其基因编辑特异性。使用优化的基础编辑器zhyA3A-CBE5建模DBA突变Diamond-Blackfan贫血（DBA）是一种罕见的遗传性骨髓衰竭综合症，主要特征为先天性贫血和组织畸形，包括头颅、面部和上肢异常，影响大约每百万个体中的五到七例。目前，没有有效的治疗方法。DBA是由于20个核糖体蛋白基因中的一个突变导致的核糖体RNA（rRNA）成熟异常。RPL11是DBA致病基因谱中的代表性成员。人类基因突变数据库（HGMD）报告了与DBA相关的RPL11中谷氨酰胺位置42（Q42*）的无义突变（CM1819057）。该突变是由于RPL11中位于第二外显子内的121位置C到T的替换，该位置在人类和斑马鱼中是保守的（图3A）。![]()
图3 利用zhyA3A-CBE5在斑马鱼中构建DBA模型为了评估zhyA3A-CBE5在斑马鱼中生成DBA模型的效果，我们使用基础编辑方法在斑马鱼rpl11中引入与DBA相关的Q42*突变（图3A）。在rpl11基因中，编码谷氨酰胺（Q）的CAG位于靠近PAM的C13位置。我们采用zhyA3A-CBE5，它具有广泛的编辑能力，可以在C13位置催化C到T的替换，从而生成终止密码子（TAG），与人类DBA突变Q42相对应（图3A）。在一细胞阶段，我们向斑马鱼胚胎微注入zhyA3A-CBE5 mRNA和121C>T rpl11 sgRNA。通过对单个F0胚胎进行测序，我们发现8%的注射F0胚胎显示121C>T的完全转换（图3B），而44%和24%的F0胚胎分别表现出高嵌合和低嵌合的121C>T突变。此外，剩余的indel效率为24%（图S2A和S2B）。zhyA3A-CBE5还在高嵌合的115C>T突变中编辑了旁观者C7到T，但这一偶然编辑导致同义突变（CTG到TTG），未改变Leu（图S2A）。此外，通过HTS分析，rpl11内源性基因组位点的C到T编辑效率平均为C7的24.7%、C13的26.1%和C16的1.5%（图S2C）。因此，我们生成了具有RPL11中42位置无义突变（TAG）的F0胚胎，称为rpl11Q42*，显示出zhyA3A-CBE5在斑马鱼中进行C到T替换的高效率。显著的是，与野生型（WT）胚胎相比，rpl11Q42*胚胎表现出头部和眼睛较小（图3C），表型仿照rpl11突变体和DBA患者的颅面畸形。从3 dpf到5 dpf，rpl11Q42*胚胎的眼睛、头部或身体逐渐缩小，出现心包水肿和未充气的泳 bladder（图3D、3E、S3A–S3E）。O-二氨基苯胺染色显示rpl11Q42*胚胎中的红细胞生成缺陷（图3F和3G）。原位杂交进一步显示，rpl11Q42*胚胎在尾部造血组织（CHT）中的血红蛋白α胚胎1（hbae1）表达减少（图3H和3I），与DBA相似。以往研究报告称，由逆转录病毒插入生成的rpl11突变体引起p53上调，与DBA的发病机制相关。正如预期，我们检测到rpl11Q42*胚胎中p53和cdkn1a/p21的表达显著增加，同时rpl11的表达减少（图3J）。相反，凋亡基因puma和bax的表达增加，表明p53/p21的上调诱导细胞周期停滞和凋亡，可能是导致rpl11Q42*胚胎造血缺陷的主要因素。这些发现强调了rpl11Q42*突变在斑马鱼中造成的严重表型和分子后果，与DBA发病机制一致。在abcc6a位点进行碱基转换以模仿人类PXE突变弹力纤维性假黄瘤（PXE）是一种影响多个器官的遗传性疾病，主要特征是结缔组织的系统性钙化。PXE的临床患病率估计在每10万人中有1例到每25,000人中有1例之间。PXE被发现与ABCC6基因突变有关，该基因对于维持细胞外基质的矿物质平衡至关重要。在PXE患者中，通过HGMD（CM030403）报告了ABCC6中的错义4375C>T突变，其中在氨基酸1459处精氨酸（Arg）被半胱氨酸（Cys）所取代。我们在斑马鱼abcc6a中识别了同源位点（4387C>T, R1463C），并设计了靶向4387 C5位点的sgRNA（图4A）。为了介绍abcc6aR1463C突变，我们向单细胞胚胎中微注射了zhyA3A-CBE5和4387C>T sgRNA。单个F0胚胎测序显示，12.2%的F0胚胎表现出完全的4387C>T转换，而21.5%和19.5%的F0胚胎分别显示出高度和低度镶嵌的4387 C>T突变（图S4A）。接下来，我们专注于分析具有完全C>T转换的F0胚胎（图4B）。值得注意的是，在C7、C8、C10（图4B）处可以检测到旁观者C到T的转换，其中C7到T或C10到T的转换导致了同义突变，没有氨基酸变化。然而，C8到T的转换或C8到T和C10到T的组合替换产生了非同义突变（TTT），导致了L1464F的改变（图4B和S4A）。经过一代杂交和繁殖后，abcc6aR1463C PXE突变体在F1代中被分离并产生（图4B和S4B）。在F1突变体类型中，类型1（20%）携带C5突变和C10同义突变；类型2（20%）携带C5突变，以及C7和C10同义突变。类型1和类型2突变体均导致Abcc6a中的R1463C突变。类型3（18.7%）和类型4（17.3%）包含C5突变，以及C8和C10的组合替换，导致Abcc6a中的R1463C和L1464F突变。类型3还携带了C7中的一个额外同义突变。剩余的突变体（24%）包含插入/缺失突变（图4B和S4B）。![]()
图4 利用zhyA3A-CBE5系统构建PXE模型我们使用类型1的abcc6aR1463C突变体进行形态和表型特征分析。六个月大的abcc6aR1463C突变体显示出显著的身体异常，尤其是体长明显短于野生型（WT）斑马鱼（图4C和4D），这与TALEN生成的abcc6a突变体相似。阿利扎林红染色结果显示，abcc6aR1463C突变体的脊柱骨存在过度钙化（图4E和4F）。通过微CT扫描，我们还观察到abcc6aR1463C突变体椎骨的中心骨扩张异常（图4G），统计分析证实其中心骨体积显著增加（图4H），表明钙化现象。考虑到PXE可能导致心血管异常及心肌细胞功能障碍甚至死亡，我们通过透射电子显微镜（TEM）分析了abcc6aR1463C突变体心脏的超微结构和线粒体形态。结果显示，abcc6aR1463C突变体心脏的线粒体数量较少，并且形态发生明显变化，表现为基质不规则、嵴数量减少以及出现空泡和膜破裂（图5A–5C）。然而，肌节的结构和组织保持不变（图5A），表明该突变体特异性干扰了线粒体的生物发生和形态发生。我们进一步对abcc6aR1463C突变体眼睛的布鲁赫膜进行超微结构分析，发现其中有显著的电子密度材料沉积，表明矿化现象。此外，abcc6aR1463C突变体眼睛中这些材料的数量和面积显著增加，显示出与PXE患者类似的钙化表型。最后，我们观察到abcc6aR1463C突变体的生存率明显降低，21个月后约有50%死亡，21个月之后死亡率加速，30个月时几乎完全死亡（图S4C），这与PXE患者的生存情况一致。![]()
图5 abcc6aR1459C突变体中的心脏损伤和眼部钙化基础编辑技术是一种在复杂基因组中引入单个核苷酸突变的独特手段，在多种模式生物中已经证明了其适用性。然而，这项技术在斑马鱼中仍面临挑战，包括编辑效率低和编辑窗口狭窄。我们的研究通过应用和优化含有Rad51DBD的碱基编辑系统解决了这个问题。我们证明了基础编辑器hyA3A-BE4max在斑马鱼的12个靶向基因中展示了12.17%–40.63%的编辑效率。值得注意的是，经过密码子优化的zhyA3A-CBE5显著提高了编辑效率，与原始的hyA3A-BE4max相比，效率提高了1.59至3.50倍。我们还扩展了对之前报告的不包含Rad51DBD的zAcnBE4max和SpRY-CBE4max基础编辑器的编辑效率进行了比较分析。我们的发现表明，zAcnBE4max和SpRY-CBE4max的编辑效率远低于zhyA3A-CBE5（图S5A和S5B；表S4）。此外，zhyA3A-CBE5的插入缺失（indel）发生率与zAcnBE4max和SpRY-CBE4max相当（图S5C；表S4）。这些发现突显了在不增加插入缺失发生率的情况下，将Rad51DBD整合到单碱基编辑器中以提高其性能的重要性。我们发现zhyA3A-CBE5和hyA3A-BE4max在从原间隔序列位置C3到C16的范围内展示了一个扩展的编辑窗口。由于可编辑碱基范围的扩大，我们使用zhyA3A-CBE5在rpl11的C13位置诱导了C到T的转换，并在斑马鱼中产生了DBA突变（rpl11Q42*）。这个位置可能由于编辑位置（C13）靠近PAM，之前报道的zAcnBE4max无法访问或编辑。我们发现即使在斑马鱼F0嵌合胚胎中，通过zhyA3A-CBE5编辑的rpl11的完全121个C>T转换也能实现，反映了zhyA3A-CBE5碱基编辑器的极高效率。考虑到zhyA3A-CBE5的超编辑活性，我们还通过斑马鱼密码子使用优化了结合Rad51DBD的hyABE8e，命名为zhyABE8e（图S6A）。我们发现，在标准编辑窗口（A4–A6）处，经过密码子优化的zhyABE8e的平均编辑效率比原始的hyABE8e提高了1.13至1.22倍。而在PAM区域附近（A7–A14），两种腺嘌呤碱基编辑器的平均转换效率几乎相当（图S6B和S6C）。经过密码子优化的zhyABE8e效率的适度提高可能归因于ABE8e脱氨酶的高效性，这导致在密码子优化后效率提升不那么显著。尽管如此，与之前报道的斑马鱼碱基编辑器zABE7.10max相比，zhyABE8e的编辑效率明显更高（图S6D）。尽管zhyA3A-CBE5系统极大地提高了碱基编辑的效率，我们观察到与碱基编辑器相关的旁观者编辑活动。在碱基编辑过程中，旁观者编辑是不受欢迎的，这在某些情况下可以通过合理选择目标位点来避免。当它们与碱基转换同义时，也可以容忍旁观者编辑。一旦旁观者编辑导致氨基酸变化，这可能会造成问题。在斑马鱼中，通过杂交可以产生大量的后代。通过筛选大量的胚胎，可以分离出期望的突变体，而无需旁观者编辑。在我们寻找abcc6aR1463C突变体的过程中，尽管在C7、C8和C10处出现了旁观者C-T改变，但在F1代中成功分离出了C5处期望的4387C>T (R463C)突变。此外，我们评估了zhyA3A-CBE5的非目标编辑活性，并通过Cas-OFFinder和HTS分析发现了最小值。因此，密码子优化不会损害胞嘧啶碱基编辑器的基因编辑特异性。总的来说，我们在斑马鱼中优化并分析了包含Rad51DBD的碱基编辑系统，并证明了优化后的碱基编辑系统在斑马鱼基因组中生成点突变方面特别有价值，这对于疾病模型构建和基因功能研究具有重要意义，拓宽了这一模式生物的基因编辑平台和研究潜力。斑马鱼的维护
实验用的斑马鱼，包括从中国科学院水生生物研究所（武汉）获得的野生型AB品系，以及我们实验室开发的相关突变体，在一个维持在28°C的恒温循环水系统中饲养和繁殖。该系统确保了稳定的pH值在7.2-7.5之间，盐度为0.25%，溶解氧水平超过6.0 mg/L。斑马鱼在饲养期间经历了14小时的光照周期和10小时的黑暗周期。所有斑马鱼实验都是在伦理上进行的，并获得了动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（编号：KY-Z-2022-249-01）。hyA3A-BE4max中的bNLS、A3A、连接器、Rad51DBD、spCas9n和UGI域通过GenScript Inc.（中国）的GenSmart™密码子优化软件进行了密码子优化。使用PrimeSTAR Max DNA聚合酶（Takara Bio, 日本）通过PCR扩增了pT7-hyA3A-BE4max和pT7-zhyA3A-CBE5。通过双酶切获得了载体片段，并使用ClonExpress II One Step克隆试剂盒实现了重组。选择KpnI和HindIII作为克隆位点。优化前后序列的详细比较和质粒生成已包含在表S5中。使用EcoRI或BciVI限制性内切酶对质粒进行线性化，然后使用mMESSAGE mMACHINE® T7 Ultra试剂盒（Thermo Fisher Scientific, 美国）进行片段转录。sgRNA针对八个基因（ddx17, slc22a7a, pspc1, gdf6, ntl, rps14, dmd, musk）的目标序列是从先前的研究中选取的。其余四个目标（tyr, abcc6a, egfra, abcc4）是通过CRISPR软件分析（www.crisprscan.org）基于PAM位点识别的。所有gRNA都通过GenScript公司（中国）合成了2′-O-甲基-3′-磷酸（MS）修饰。合成的sgRNA经过严格的质控，包括ESI质谱和HPLC纯度测试。本研究中使用的所有目标位点列在补充数据1中。将100 ng/μL的hyA3A-BE4max mRNA和200 ng/μL的sgRNA或100 ng/μL的zhyA3A-CBE5 mRNA和200 ng/μL的sgRNA的2纳升混合物共注射入单细胞阶段的斑马鱼胚胎中。注射后的胚胎在25°C下孵育5小时后转移到28°C。在48小时后收集胚胎，并使用QuickExtract™ DNA提取溶液提取基因组DNA。使用2倍Hieff PCR Master Mix（中国上海翊森生物科技有限公司）进行PCR扩增，然后将扩增的样本进行Sanger测序（中国Qingke生物技术公司）。胚胎在84小时后收集，并用4%的多聚甲醛（PFA）在室温下固定2小时。经过PBS洗涤后，胚胎在暗处用0.6 mg/mL的O-二анизид染色溶液染色30分钟，然后用PBS洗涤。染色后的胚胎进行成像，并通过Sanger测序确认基因型。使用Pick-Primer工具设计PCR探针。使用Trizol提取斑马鱼全胚胎RNA，并使用Hifair III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒通过逆转录合成cDNA模板。通过T7 RNA聚合酶合成地高辛标记的hbae1探针，并用杂交缓冲液稀释。杂交在68°C下过夜进行，使用抗地高辛-AP Fab片段（Roche，美国）检测杂交探针。使用体视显微镜对胚胎进行染色和拍照。斑马鱼全胚胎的原位杂交操作如之前所述。通过PCR扩增指定的高通量测序引物对（见补充数据2），针对目标和非目标基因组区域进行了扩增。PCR扩增使用了KOD-Plus-Neo DNA聚合酶（Takara Bio, 日本），以100-150纳克基因组DNA作为模板，按照制造商的协议进行。引物详情在补充数据3中提供。HTS文库是通过包含5′端适配子序列的初始PCR扩增建立的（正向5′-GGAGTGAGTACGGTGTGC-3′; 反向5′-GAGTTGGATGCTGGATGG-3′）。随后，使用2倍的Hieff PCR Master Mix和带有不同条形码序列的引物进行了第二轮PCR。带有不同条形码的PCR产物被混合，并在Illumina HiSeq平台上进行了深度测序。对于FASTQ文件的批量分析，参考序列与之前记录的全长进行了比对。每个目标位点在与WT序列比对后产生了20,000到60,000个读数。包含组合（C到T和A到G）或仅限（仅C到T或仅A到G）转换的等位基因代表了精确、干净的碱基编辑结果。使用Trizol试剂（Thermo Fisher Scientific, 美国）从胚胎中提取总RNA。使用Hifair III 1st Strand cDNA合成SuperMix试剂盒合成cDNA。使用Hieff qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒（YEASEN, 中国）进行定量PCR分析。使用2-ΔΔCt计算规则，其中ΔCt = Ct（目标基因）- Ct（β-actin）；ΔΔCt = ΔCt（目标样本）- ΔCt（对照样本）。实时PCR中使用的引物列在补充数据4中。六个月大的斑马鱼骨骼样本在4°C下用3.5%的多聚甲醛固定7天。固定后，样本在室温下用丙酮处理48小时以去除脂肪，然后用PBST冲洗两次（每次10分钟）。接着，样本在硼砂钠溶液中浸泡1天，然后用10 mg/mL的胰蛋白酶（溶解在60%硼砂钠溶液中）过夜消化。使用0.04 mg/mL的茜素红（溶解在1% KOH中）染色7天，之后再用PBST冲洗两次（每次10分钟）。染色结果定期在立体显微镜下监测，并及时拍照。斑马鱼使用0.03%的三卡因麻醉后，它们的整个身体被仔细包裹在一个密封膜中以保持完整性。随后，使用SkyScan 1176高分辨率体内微CT成像系统对鱼体进行扫描。使用SkyScan CT Analyser软件（版本1.15.2.2）进行图像重建，并使用三维（3D）分析软件“CTvox”和“CTAN”对目标区域进行分析。参数是利用“双时间立方体”（Double Time Cubes）的3D重建方法确定的。使用GraphPad Prism 8 Project执行统计分析。数据以平均值 ± 标准差（SD）的形式呈现，以直观地表示中心趋势和数据分散。使用学生t检验评估组间差异。所有实验均至少进行三次或更多次。P值 < 0.05被认为具有统计学意义，表示为 *，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001；****，P < 0.0001。原文地址：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1673852724002807?via%3Dihub注：因文章篇幅有限，所有相关引用文献，以及补充素材可以点击至原文查阅。
苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过六年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。
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