【文献解读】斑马鱼可用于理解特定二叶主动脉瓣亚型和动脉瓣发育不良的发育机制
文摘
科学
2024-10-28 17:01
江苏
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文献：Derrick CJ, Eley L, Alqahtani A, Henderson DJ, Chaudhry B. Zebrafish arterial valve development occurs through direct differentiation of second heart field progenitors. Cardiovasc Res. 2024 Oct 26:cvae230. doi: 10.1093/cvr/cvae230. Epub ahead of print. PMID: 39460530.
杂志：CARDIOVASCULAR RESEARCH
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二叶主动脉瓣（BAV）是最常见的先天性心脏缺陷，影响至少2%的人口。BAV的胚胎起源仍然了解不足，用于验证患者变异的检测方法很少，这限制了BAV致病基因的识别。在人和小鼠中，动脉瓣膜的左右小叶起源于流出道缓冲层，间质细胞起源于神经嵴细胞，并通过内皮-间质转化（EndoMT）覆盖心内膜。相比之下，心脏前体细胞从第二心区（SHF）直接分化的心肌特化独立于EndoMT机制，负责形成前后瓣膜。这两种发育机制中的任何缺陷都可能导致二尖瓣畸形（BAV）。尽管已经提出斑马鱼作为人类变异测试的模型，但其天然的双叶动脉瓣并未被认为适合理解人类的动脉瓣发育。在这里，我们开始研究动脉瓣发育过程中涉及的程序在斑马鱼中有多大程度的保守性，最终确定是否可以进行二尖瓣畸形的功能测试。通过结合使用活体成像、免疫组化和Cre介导的谱系追踪，我们展示了斑马鱼动脉瓣原代细胞直接从SHF祖细胞发育而来，没有来自EndoMT或神经嵴的贡献，这与人类和鼠类的前后瓣膜相一致。此外，一旦形成，这些原基与所有三个主动脉瓣叶片的后续共同发育事件共享。我们的工作突出了动脉瓣叶从SHF形成的保守祖先机制，并确定动脉瓣的发育与斑马鱼的心房心室瓣的发育不同。至关重要的是，这证实了斑马鱼对于理解特定BAV亚型和动脉瓣发育不全的实用性，为高通量变异检测提供了可能性。对二叶式主动脉瓣（Bicuspid Aortic Valve，简称BAV）患者的大规模基因组学研究已经发现了许多预测为致病原因的变异。然而，由于缺乏合适的体内功能检测手段，这些变异很少得到验证。这意味着目前还无法广泛地对家族成员的风险和预后进行讨论。在这里，我们证明斑马鱼在动脉瓣发育方面与人类的交错瓣叶具有高度保守性，从而确立了斑马鱼作为研究BAV亚型的合适体内模型，该模型有助于开始弥合临床遗传学与发育生物学之间的鸿沟。主动脉瓣和肺动脉瓣分别确保血液从左心室和右心室单向流向全身循环和肺循环。这些瓣膜可能会受到先天性畸形的影响，最常见的是二叶式主动脉瓣（Bicuspid Aortic Valve，简称BAV），在至少2%的人群中会出现，其典型特征是存在两个瓣叶而不是三个。BAV可能单独存在，但也与其他先天性心脏畸形有关，如左心发育不良综合征，或与染色体疾病有关，如唐氏综合征。尽管BAV在出生时往往不易被发现，但它会使个体易患一系列进行性主动脉异常，并随着年龄的增长导致瓣膜退化，如果不进行治疗，最终会导致瓣膜狭窄或反流，进而导致心室衰竭。肺动脉瓣缺陷较为少见，但与不同的心脏畸形密切相关，如法洛四联症。半月瓣（semilunar valves）发育于动脉根部，位于心室心肌与其各自动脉干平滑肌之间的交界处，在羊膜动物中具有特定的结构：瓣叶通过铰链点附着于心肌壁，还有窦部和瓣叶间纤维三角区。瓣叶结构在脊椎动物中大致保守，具有明显不同的富含弹性和胶原的层次。尽管动脉瓣非常重要，但关于其瓣叶发育机制的了解却非常少，而且直到最近，人们还是通过对多种模型中房室瓣的研究来推断动脉瓣的发育过程。来自第二心区（Second Heart Field，简称SHF）的多能心脏前体细胞的添加对于动脉极的正常发育至关重要。这些细胞表达转录因子Islet1（Isl1），在添加到心脏后终端分化时，Isl1的表达会下调。在动脉极，SHF细胞的第一波会形成心肌细胞，随后形成平滑肌细胞。在远端流出道中，细胞通过过渡区，在该区它们共同表达Isl1和成熟心肌细胞标志物；该区域最终会形成动脉根部。在小鼠胚胎第10.5-11.5天（人类为卡内基分期14-16期），在未分隔的流出道壁中可以识别出两个Isl1+细胞舌状结构，这些细胞既不表达心肌标志物也不表达平滑肌标志物。这些未分化细胞中最靠近近端的形成了交错瓣叶肿胀（intercalated valve swellings，简称ICVSs），其余部分后来分化为动脉壁的平滑肌。与ICVS形成的同时，两个富含心脏胶质的流出道（OFT）垫沿着流出道（近端）心肌部分的全长分布，这些垫通过覆盖其上的内皮细胞（本身来源于SHF）经内皮-间充质转化（EndoMT）以及来自心脏神经嵴的细胞填充。这些垫会扩张并最终融合，导致流出道分隔。这些主要垫的远端形成了主动脉瓣和肺动脉瓣的右瓣叶和左瓣叶，而ICVSs则形成了前瓣叶和后/非冠状动脉瓣叶。这些瓣叶的不同起源反映在它们所含的细胞谱系中，这一点通过在小鼠中进行的基于Cre的谱系追踪得到了证实。这六个瓣叶原基内的所有间充质细胞都表达转录因子Sox9[20,24]。然而，值得注意的是，ICVS中的细胞直接从Isl1+ SHF前体细胞分化为表达Sox9的瓣膜间质细胞（VICs），这些细胞在短时间内同时表达这两种标志物。而在由OFT垫发育而来的瓣叶中则未观察到这一现象。在人类胚胎的卡内基分期13-16期之间，发育中的ICVS中也可见ISL1和SOX9共表达的相似模式，这表明这是一个保守的原基形成机制。尽管这些原基的起源不同，但一旦形成，所有原基都会经历相同的重塑过程。对这些不同原基形成机制的理解可能反映了二叶式主动脉瓣（BAV）亚型和主动脉疾病之间的关系。因此，有必要了解流出道发育、患者突变及其相关疾病之间的关系，以确定如二叶式主动脉瓣等动脉极畸形的发育起源。动物模型对于理解瓣膜形成的复杂过程具有不可估量的价值，传统上使用的是小鼠模型，而近年来斑马鱼也成为了一个重要的模型。斑马鱼的发育迅速且时间上可重复，非常适合进行体内活体成像，并且其过程和基因调控网络在高度保守，这使得它们成为了一个强大的模型，可以用来研究在小鼠中无法开展的心脏发育方面的课题。斑马鱼具有一个单一的、天然为二叶式的动脉瓣，位于单心室和动脉球之间的未分隔流出道中。这导致许多人认为斑马鱼不能用于模拟人类动脉瓣的发育或疾病。然而，动脉球是一个富含平滑肌和弹性蛋白的结构，而且动脉球和心室的远端都来源于SHF，这与羊膜动物的动脉根部相似。在少数对斑马鱼动脉瓣进行特征描述的研究中，并未探讨瓣叶的起源以及它们是否与人类动脉瓣的发育有任何相似之处。此外，与小鼠类似，许多人还假设动脉瓣的发育与房室瓣的发育相似。如果斑马鱼动脉瓣的形成机制与小鼠/人类相似，那么斑马鱼将成为一个强大的模型，可用于研究动脉极发育和疾病的关键方面。在本研究中，我们探讨了动脉瓣发育过程在斑马鱼中的保守程度。我们研究了斑马鱼的动脉根部和瓣叶在结构上是否与小鼠/人类相似；斑马鱼是否存在过渡区，以及这是否是动脉瓣形成的部位。然后，我们检查了斑马鱼的动脉瓣原基是通过SHF前体的直接分化还是通过富含细胞外基质（ECM）的垫的细胞化来发育的。通过确定导致斑马鱼动脉瓣原基形成的保守发育机制，我们确立了斑马鱼在研究特定二叶式主动脉瓣（BAV）亚型和动脉瓣发育不良的发育以及作为患者变异分析的工具方面的适用性。结果
成年斑马鱼动脉瓣结构的保守性
我们之前已经对小鼠和人类的动脉根部形态进行了描述。为了进行比较，我们进行了三维重建，以扩展对成年斑马鱼动脉瓣的描述（图1A-C）。与羊膜动物一样，斑马鱼的动脉瓣位于心室的远端末端，瓣叶延伸到心肌-平滑肌边界之外。瓣叶几乎垂直于胚胎的左右轴排列，并沿胚胎的前后轴有一个贴合面（图1B-E，图S1）。为了避免与小鼠/人类的动脉瓣叶混淆，我们根据它们在成年斑马鱼中的主要解剖位置，将这些瓣叶定义为右旋瓣叶和左旋瓣叶（图1B-C，图S1）。总的来说，这两个瓣叶没有可区分的形态特征，并且任何一个瓣叶与房室瓣之间都没有连续性（图1C）。在流出道的短轴切面中，可以清楚地看到瓣叶和壁之间的窦（图1A，D-E，星号）。瓣叶的尖端特别薄，在切面中通常很难观察到（图1B），但在多个平面中的评估表明，存在一个跨越心肌-动脉边界的广泛贴合区域（图1C）。![]()
图1 斑马鱼的动脉瓣在解剖结构上与其他脊椎动物的动脉瓣相似据广泛描述，成人人类的动脉瓣瓣叶具有细胞外基质（ECM）的三层结构：动脉侧的一层胶原纤维；富含蛋白聚糖的中间层；以及心室侧的一层富含弹性蛋白的层。考虑到这一点，我们研究了这些ECM成分在成年斑马鱼动脉瓣中的定位。Masson三色染色显示，动脉球中含有大量胶原，且胶原在瓣叶与壁接近的附着点（即交界区）处富集（图1F星号，S2A）。瓣叶间质中胶原含量较低，而面向管腔的表面（图1G箭头）和覆盖心室心肌的窦壁（图1H星号）上染色较强。整个动脉球和瓣叶间质均被阿尔新蓝强烈染色（图1I-K，S2B），表明存在大量硫酸化蛋白聚糖，而在交界区（图1I星号）没有信号，窦壁中的含量也非常低（图1J星号，S2B）。通过Miller染色确定的成熟弹性蛋白在瓣叶的交界区和尖端不存在（图1L星号），但在瓣叶的近端整个区域都存在，并且在面向管腔的一侧染色更强（图1M-N箭头），与胶原重叠（图1G）。弹性蛋白也存在于窦壁中（图1M-N箭头），尽管铰链区缺乏弹性蛋白（图1N，S2C）。动脉球也被弹性蛋白强烈染色，尽管我们没有检测到离散的弹性蛋白纤维（图1L-N，S2C）。由于大多数关于动脉瓣形成的数据都是从使用小鼠的研究中收集的，因此我们更密切地将斑马鱼动脉瓣与小鼠进行了比较，分析了90天龄成年小鼠（P90）的主动脉瓣。在P90小鼠的主动脉瓣中，胶原存在于整个壁、交界区和铰链区，但仅限于所有三个瓣叶的动脉侧（图1O-Q箭头，S2D-E）。与斑马鱼瓣叶一样，阿尔新蓝染色与胶原呈互补关系，主要存在于尖端和铰链区（图1R-T星号，图S2F-G）。与在斑马鱼中观察到的不同，阿尔新蓝在小鼠的交界区也存在（图1R），与胶原重叠（图1O）。此外，虽然动脉球富含硫酸化蛋白聚糖，但小鼠主动脉用阿尔新蓝染色非常弱（图1R，T，S2B，F）。与斑马鱼一样，小鼠的交界区缺乏弹性蛋白（图1U），但主动脉中清晰可见成熟的纤维（图1U-W，图S2H-I）。引人注目的是，我们在成年小鼠主动脉瓣瓣叶中检测到的弹性蛋白极少，仅存在微弱且稀疏的染色，局限于瓣叶的尖端（图1U-W，图S2I）。在小鼠主动脉瓣瓣叶中容易检测到黑色素细胞（图1O，R，U，S2E，G，I），但在斑马鱼动脉瓣瓣叶中则没有（图1B，D-H，I-K，L-N）。综上所述，这些数据表明，尽管斑马鱼和小鼠动脉瓣中的弹性蛋白含量和胶原定位存在差异，但动脉瓣具有明确且基本的特征。动脉根部为纤维状；瓣叶本身富含不与胶原共定位的硫酸化蛋白聚糖；交界区胶原染色强烈且缺乏弹性蛋白；流出道的动脉侧富含弹性蛋白和胶原。这些分析综合起来表明，成年斑马鱼动脉瓣与成年小鼠主动脉瓣在结构上具有一般性相似性。动脉瓣的形成是一系列关键事件的顺序：原基的建立、窦的形成和瓣叶的塑形。为了确定这些步骤是否也发生在斑马鱼中，我们检查了胚胎发育期间动脉极的组织切片。最初，在30小时受精后（hpf），胚胎的流出道（OFT）由单层心肌外层和内层的内皮细胞组成，两者被细胞外基质（ECM，即心胶质，呈灰色）分隔开（图2A-B’）。在46hpf时，通过第二心区（SHF）在远端添加，流出道延长，但没有动脉瓣结构的任何迹象（图2C-C’）。到54hpf时，在流出道的近端仍可以观察到清晰的外层-ECM-内皮层结构（图2D-D’）。然而，在远端，几乎看不到ECM（箭头，图2D'），并且细胞呈现多层排列（图2D，黄色），形成一个使血管腔变窄的隆起，且不同类型的细胞之间不再有明显区别。在62hpf时，流出道远端的细胞隆起看起来更大，而近端流出道和心室的ECM变薄（图2E-E’）。在70-78hpf之间，流出道明显变长，并且在与远端腹主动脉连接处逐渐变细（图2F-G’）。在86hpf时，首次在细胞隆起和流出道壁之间观察到窦，勾勒出动脉瓣的两个瓣叶。同时，流出道在形成瓣膜的周围呈现出更梨形的轮廓（图2H-H’）。在胚胎发育的剩余过程中（86-118hpf），动脉瓣瓣叶的外观几乎没有变化（图S3A-D），尽管它们在14天受精后（dpf）时变薄（图S3E），这表明塑形发生在胚胎后阶段。![]()
我们通过量化表达绿色荧光蛋白（GFP）的所有内皮细胞（包括内皮细胞）的Tg(kdrl:GFP)胚胎中心脏壁与内皮之间的距离，证实了原基形成的窗口期（图S3F）。在46hpf时，远端流出道的壁厚是均匀的（图S3G-G’’），而在54-70hpf时，我们观察到壁厚增加，这与远端流出道的多层外观相吻合（图S3H-J’’）。因此，从54hpf时在远端流出道观察到的细胞隆起（图2D’）是动脉瓣瓣叶的原基。为了扩展和补充我们的组织学分析，我们对发育中的流出道进行了活体成像，以识别瓣叶的运动。在Tg(kdrl:GFP)胚胎中，可以在62-70hpf时观察到瓣原基，但此时还没有瓣叶（图2I-J，视频1-2）。到78hpf时，可以区分出原始的瓣叶和窦，尽管同一窝胚胎中瓣叶和窦的区分程度各不相同（图2K，视频3）。到86hpf时，所有胚胎中都可见到两个瓣叶，每个瓣叶都有一个明显的窦（图2L，视频4）。综上所述，斑马鱼的流出道经历了动脉瓣形成的保守且标志性的过程，从最初开放的连续血管（30hpf-46hpf），经过原基建立（46hpf-70hpf）、窦形成（70hpf-86hpf），并最终进行瓣叶塑形（86hpf及以后）。为了扩展和补充我们的组织学分析，我们对发育中的流出道进行了活体成像，以识别瓣叶的运动。在Tg(kdrl:GFP)胚胎中，可以在62-70hpf时观察到瓣原基，但此时还没有瓣叶（图2I-J，视频1-2）。到78hpf时，可以区分出原始的瓣叶和窦，尽管同一窝胚胎中瓣叶和窦的区分程度各不相同（图2K，视频3）。到86hpf时，所有胚胎中都可见到两个瓣叶，每个瓣叶都有一个明显的窦（图2L，视频4）。为了确定斑马鱼中动脉瓣原基形成的位置，我们对Tg(kdrl:GFP)胚胎进行了心肌肌钙蛋白（心肌细胞标记物）和转胶蛋白（Tagln；以前称为SM22α）的免疫组织化学染色，后者是动脉极平滑肌细胞的一个高度保守的标记物。在46hpf时，尚未形成原基（图2，图S3），整个流出道壁均为心肌（图3A-A’）。在54hpf时，即原基形成的开始阶段，我们可以识别出远端定位的细胞，这些细胞既不表达肌钙蛋白也不表达Tagln（图3B-B’星号）。到62hpf时，位于瓣原基远端的壁细胞稀疏地表达Tagln（图3C-C’），而到70hpf时，Tagln在远端流出道中的表达变得强烈（图3D-D’）。从54hpf开始，动脉瓣原基在流出道的心肌部分、心肌细胞和平滑肌细胞的交界处清晰可见，并且不表达内皮、心肌和平滑肌标记物（箭头，图3B’、C’、D’）。通过测量壁厚（图S3F）并将其与心肌-动脉边界对齐，证实了我们的观察结果（图3E）。在54-70hpf期间，这些瓣原基中的细胞数量增加（图S4D-D’），这与细胞分裂有关，如BrdU掺入所示（图S4E-E’），且两个原基中的细胞分裂程度相同（图S4E’）。因此，与小鼠和人类一样，动脉瓣在心肌-平滑肌（心肌-动脉）交界处与动脉根部一起形成（图3E）。![]()
由于动脉瓣原基的定位与过渡区密切相关，我们接下来检查了这一区域是否存在于斑马鱼胚胎心脏的动脉极。与其他脊椎动物一样，斑马鱼第二心区的添加需要保守的Islet转录因子家族，其中Isl1+、Isl2a+和Isl2b+细胞存在于动脉极，但只有Isl2b对于细胞添加是必需的。在46hpf（图3F-F’‘）和54hpf（图3G-G’‘）时，我们清楚地识别出心脏动脉极的Isl1/2+内皮细胞和心肌细胞，这证实了先前的研究，即流出道来源于第二心区。特别是，心肌肌钙蛋白+、Isl1/2+细胞证实了斑马鱼流出道中存在过渡区（图3H）。在54hpf时，发育中的瓣原基内的细胞也是Isl1/2+，并位于过渡区附近（图3G’，星号），这确定了斑马鱼中动脉瓣形成的部位（图3G-H）。小鼠和人类的动脉瓣原基通过两种截然不同的机制形成：要么是通过内脏间充质（ICVS）中第二心区（SHF）祖细胞的直接分化，要么是通过内皮间充质转化（EndoMT）来源的细胞和神经嵴细胞使富含细胞外基质（ECM）的垫状物细胞化。由于我们已经确定了斑马鱼流出道中存在过渡区（图3F-H），且过渡区的发育与内脏间充质（ICVS）的形成有关，我们首先检查了动脉瓣原基中Isl1/2和Sox9的表达模式，因为这些基因的共表达是直接分化机制的标志。在54hpf时，我们在动脉瓣原基内（黄色区域，图4A-A’‘）以及正在形成的瓣远端的流出道壁（形成动脉球）中识别出了Isl1/2+ Sox9+细胞。到70hpf时，原基中的细胞已经下调了Isl1/2的表达，但维持了Sox9的表达（黄色区域，图4B-B’‘），这与小鼠内脏间充质中的情况相似。正在发育的动脉球中的细胞仍然表达Isl1/2（图4B’），表明它们是从第二心区较晚分化的，但同时也共表达了Sox9（图4B’‘）。![]()
为了排除覆盖在上面的内皮细胞或神经嵴细胞对这些结构的贡献，我们使用了Cre-lox介导的谱系追踪来确定它们的贡献。在70hpf和118hpf的Tg(kdrl:Cre); Tg(ubi:loxP-EGFP-loxP-mCherry); Tg(kdrl:GFP)胚胎中，我们观察到报告基因在内皮细胞中发生了重组（图4C’、D’，品红色），这与Tg(kdrl:GFP)中的情况相同（图4C、D），但在动脉瓣原基细胞（黄色区域，图4C’'、S6A，n=16/16）或瓣叶（黄色区域，箭头，图4D’'、S6A，n=14/14）中未观察到重组。相反，在同一胚胎中，房室瓣内的所有细胞都发生了完全重组（图S6B-C’'），这证实了房室瓣是通过内皮间充质转化（EndoMT）建立的，与动脉瓣不同。为了确定神经嵴细胞对动脉瓣的贡献，我们生成了一个新的Tg(sox10:iCre,cryaa:DsRed2)等位基因（图S5A-B’）。在70hpf的Tg(sox10:iCre, cryaa:DsRed2); Tg(ubi:loxP-EGFP-loxP-mCherry); Tg(kdrl:GFP)胚胎中，我们能够确定神经嵴细胞对腹主动脉和动脉球最远端部分的贡献（黄色星号，图4E’-E’'）。在70hpf的动脉瓣原基中，我们在12/14个胚胎中未观察到重组（黄色区域，图4E-E’，S6D）。在剩下的两个胚胎中，我们观察到了一个标记的细胞，但这些细胞的位置并不一致。在118hpf时，我们在远端观察到了重组（图4F’-F’'星号，图S5C-C’''），但8/12个胚胎的动脉瓣瓣叶中没有发生重组（图4F’-F’'，S6D）。在剩下的四个胚胎中，动脉瓣瓣叶中观察到了一到三个Cre+细胞，但这些细胞的空间定位没有可重复性。从70hpf到118hpf，神经嵴细胞的平均百分比没有增加（图S6D，70hpf：1.02%，118hpf：2.47%）。在70hpf时，所有胚胎的房室瓣中都没有神经嵴细胞（图S6E-E’' n=14/14）。在118hpf时，我们在6/10个胚胎的房室瓣瓣叶中观察到了Cre+细胞，这支持了之前的观察结果[46]（图S6F-F’'）。动脉瓣和房室瓣中Cre+细胞的存在没有相关性。综上所述，这些谱系追踪实验表明，动脉瓣原基的起源与内皮间充质转化和神经嵴细胞无关，其形成机制是通过第二心区的直接分化，这与小鼠和人类中的两个内脏间充质的情况相似。因此，动脉瓣原基的形成发生在过渡区，通过第二心区祖细胞直接分化为Sox9+的心脏间充质细胞（VICs）（图4G），这表明斑马鱼中动脉瓣的建立机制与房室瓣的发育机制不同。之前的研究曾基于弹性蛋白定位的分析，提出动脉瓣原基细胞是平滑肌细胞。然而，在我们的分析中，动脉瓣原基内的细胞并未表达经典的平滑肌标志物Tagln（图3B’-D’）。为了澄清这一点，我们通过整体原位杂交技术检查了弹性蛋白b（elnb）的时空表达情况。结果显示，从54hpf开始，远端流出道就有表达，这比之前的描述要早（图5A-D），与原基形成（图2、3、S3）和动脉球中平滑肌的出现（图3B-D’）相吻合。在54hpf和70hpf的Tg(kdrl:GFP)胚胎的中线切片中，我们发现原基细胞（黄色区域，图S7A-B’'）中没有elnb的表达。为了进一步确认这一点，我们在胚胎阶段进行了Miller弹性蛋白染色，发现从62hpf开始，动脉球中就可以检测到成熟的弹性蛋白，但原基中始终没有（箭头，图5E-H）。![]()
一氧化氮（NO）是动脉极的一个保守标志物，可通过DAF-FM传感器检测，据报道从2dpf开始就可标记动脉球。为了将这些观察结果与我们的流出道发育模型相结合，我们检查了动脉原基形成过程中DAF-FM的定位情况。在54hpf时，我们观察到心肌远端未分化的平滑肌中有稀疏的DAF-FM染色，而间充质细胞（VICs）中没有信号（图5I-I’'）。到70hpf时，DAF-FM染色几乎遍布整个动脉球，但最远端的细胞中没有染色（图5J’箭头）。在原基中没有观察到DAF-FM染色（图5J-J’'黄色区域）。我们还检查了DAF-FM与第二种平滑肌标志物肌球蛋白轻链激酶（MLCK）的共定位情况，据报道MLCK从3dpf开始在动脉球中表达。在54hpf时，我们观察到远端流出道（OFT）中整个区域都有弥散的MLCK信号，这与延伸到原基中的心肌肌钙蛋白形成互补（图5K-K’'）。到70hpf时，MLCK的表达在心肌远端的平滑肌中更清晰地局限于膜上（图5L’），与Isl1/2相似，MLCK在动脉瓣原基中的表达在54hpf到70hpf之间下调（图5K’，L’）。DAF-FM与MLCK重叠，但MLCK的表达更远端地延伸到动脉球和腹主动脉之间的连接处（图5L-L’'箭头）。最后，我们的分析表明，动脉瓣原基的VICs和动脉球的平滑肌细胞都是Sox9+（图4B’'），这与在小鼠主动脉中观察到的现象相似。我们在54hpf时证实了这一点，其中Sox9与整个远端流出道（OFT）的MLCK重叠（黄色区域，图S7C-C’'），在70hpf时，Sox9既存在于MLCK+平滑肌中，也存在于现在为MLCK-的动脉瓣原基细胞中（图S7C’，D’）。综上所述，这证实了动脉瓣原基中来自第二心区（SHF）的细胞与远端平滑肌细胞不同，并且结合我们的遗传谱系追踪，表明动脉极发育在进化上高度保守。为了进一步支持第二心区（SHF）在建立动脉瓣原基中的作用，我们检查了一种已知会破坏SHF添加的突变体中的流出道（OFT）发育情况。高度保守的转录因子tbx1对于维持SHF祖细胞池至关重要，而TBX1的缺失会导致22q11.2缺失综合征（迪乔治综合征）。已有研究表明，tbx1突变的斑马鱼具有较短的流出道，但其对动脉瓣的影响尚未研究。在70hpf时，tbx1突变体表现出完全渗透性的心包水肿、咽弓缺失以及流出道位置异常（图6A-B’）。使用elnb标记动脉球发现，在tbx1突变体中，该结构要么严重发育不良（图6D-D’），要么完全缺失（图6D’'）。虽然野生型（WT）同胞具有规则的、梨形的主动脉根部，其中包含动脉瓣原基（图6E），但tbx1突变体的流出道则严重紊乱（图6F）。在野生型同胞中，MLCK的表达强烈且局限于膜上，使得VICs可以通过缺乏心肌、心内膜或平滑肌标志物表达来定义（黄色区域，图6E）。在tbx1突变体中，MLCK在流出道中的表达通常完全缺失，并且在不同胚胎中的表达存在差异，这可能反映了通过分析elnb表达所确定的流出道发育不良的谱系（图6D-D’'）。这导致无法通过MLCK表达的缺失来识别VICs，因此，与之前一样，我们将VICs定义为位于心肌套内、心内膜下，但两者标志物均呈阴性的细胞（图3、4、5、S4、S6）。这种方法确定了VICs的数量显著减少，且两个原基均受到相似的影响（图6G-G’），这支持了动脉瓣原基由SHF祖细胞形成的观点。![]()
图6 tbx1突变体具有畸形的OFT和低细胞数的动脉瓣原基我们之前的研究表明，在小鼠中特异性敲除平面细胞极性（PCP）核心组分Vangl2会破坏过渡区的组织，导致后侧心内膜下间充质细胞（ICVS）变小或错位、主动脉瓣发育不良和二尖瓣畸形（BAV）。由于vangl2突变体斑马鱼的流出道（OFT）表型从未被描述过，因此我们调查了Vangl2功能的保守性。在70hpf时，vangl2突变体斑马鱼的前-后轴较短（图7A，B），但心脏形态在外观上看起来正常（图7A’，B’）。通过分析elnb表达发现，与70hpf时的同胞相比，vangl2突变体的动脉球显著更大，但形状更不圆润（图7C-F）。在vangl2突变体中，MLCK的表达与野生型同胞相当（图7G-H），并且其膜限制性表明vangl2突变体中平滑肌细胞的成熟正常（图5K’，L’，S7C-D’'）。尽管vangl2突变体的流出道形状异常（图7C-H），但原基仍位于野生型中的心肌动脉边界处（图7G，H），且原基中VIC的数量与野生型同胞无差异（图7I-I’）。胚胎流出道的3D重建显示，在70hpf时，野生型同胞与vangl2突变体的原基体积无变化（图7J-J’'，每种基因型n=8），这表明vangl2突变体的原基形状可能异常。由于3-4dpf之间形成心包水肿（数据未显示），这会影响非自主性的重塑事件，因此无法分析vangl2突变体中动脉瓣发育的后期阶段。![]()
综上所述，我们的研究表明，已知的心脏第二心区（SHF）发育调节因子tbx1的缺失会导致流出道变小且形态异常，并伴有动脉瓣原基中细胞的大量丢失，这支持了我们的数据，即这些原基来源于SHF。已知在小鼠中SHF部署需要vangl2基因，而vangl2的缺失会导致流出道形状异常，尽管原基中的细胞数量正常，这表明vangl2在动脉极发育过程中SHF细胞添加的组织中具有保守作用。在本研究中，我们描述了斑马鱼动脉瓣的成熟结构和胚胎起源。我们已证明，两个瓣叶都是通过心脏第二心区（SHF）祖细胞的直接分化形成的（图4和8），这与小鼠肺动脉瓣前叶和非冠状动脉瓣（即主动脉瓣）的发育相似。然而，重要的是要认识到，这并不等同于某些研究中所述的肺动脉瓣或主动脉瓣。斑马鱼和哺乳动物动脉瓣的总体外观存在明显差异。最明显的是，斑马鱼的动脉瓣为二叶式（图1，S1-2），没有瓣叶间三角区，也没有动脉瓣和房室瓣之间的连续性（图1）。有瓣叶联合和瓣窦，但没有冠状动脉口，因为鱼的冠状动脉循环起源于鳃后。尽管存在这些差异，但可以看到一个与室动脉连接处相伴的基底环，并且瓣叶的远端附着定义了窦管交界处（图1）。对瓣膜细胞外基质（ECM）成分的组织学分析显示，其结构与成年小鼠（图1，S2）和人类中的结构相似。动脉瓣心室面的丰富弹力蛋白沉积与心室纤维相符，而海绵样层似乎存在，以富含蛋白多糖的细胞外基质为标志。斑马鱼的纤维层发育不全，仅在瓣叶腔面有少量胶原沉积。![]()
图8 斑马鱼动脉瓣通过SHF前体细胞的直接分化形成示意图有报道称，脊椎动物间细胞外基质（ECM）含量存在细微差异，大型哺乳动物瓣叶中胶原和弹力蛋白含量更高，这可能是由于不同的血流动力学环境所致[10]。实际上，最近的一项研究表明，在瓣叶面向管腔的表面所经历的单向血流下，瓣膜间充质细胞（VICs）会实施一种弹性生成程序。心率的不同可能是解释尽管人类和斑马鱼中存在成熟弹力蛋白，但P90小鼠瓣叶中缺乏成熟弹力蛋白（图1，S2）的原因。此外，还可能存在细胞谱系特异性贡献，斑马鱼中缺乏明显的纤维层可能是由于神经嵴细胞未迁移到瓣原基中（图4）。综上所述，可以推测，形成有凹槽的基底环、瓣叶间三角区以及可能是纤维层的胶原，可能是高压心血管系统的机械作用、流出道完全分隔或两者共同作用的结果。总体而言，我们在斑马鱼主动脉根部确定了ECM成分的一般且保守的定位模式（图1，S2），并且该模型可能比小鼠模型更有用，有助于了解脊椎动物动脉瓣瓣叶中弹性生成的机制。在斑马鱼中，两个动脉瓣原基都直接起源于流出道（OFT）过渡区最远端的未分化心脏第二心区（SHF），没有神经嵴细胞或内皮间充质转化（EndoMT）的贡献（图4、8、S6）。与小鼠一样，我们观察到没有心肌细胞的转分化，并排除了这些细胞具有平滑肌细胞特性的可能性（图3、5、S7）。从鱼类到哺乳动物，瓣膜间充质细胞（VICs）直接由SHF祖细胞分化的保守性表明，这与动脉瓣发育的原始机制有关，该机制早于流出道垫中的内皮间充质转化和神经嵴细胞被共同用于流出道完全分隔之前。斑马鱼中存在过渡区（图3），以及鸡、小鼠、人类和可能还有非洲爪蟾[58]中也存在过渡区，这一区域与瓣原基形成部位紧密相关，进一步支持了这一点。在非洲爪蟾中，神经嵴细胞对于流出道的不完全分隔并不是必需的，相反，这些细胞保留在主动脉囊和相关弓部。这一贡献与我们在斑马鱼中观察到的以及其他人的观察结果非常相似，在斑马鱼中，神经嵴形成腹主动脉的一部分（图4，S5）。综上所述，这表明斑马鱼的流出道由近端的SHF衍生的心肌组成，其上方为SHF衍生的平滑肌，最远端为神经嵴衍生的平滑肌（图5，8，S7）。SHF和神经嵴细胞的这些贡献再次显示出与小鼠流出道的高度保守性；SHF产生主动脉和肺动脉干基部的平滑肌，而升主动脉和相关动脉的平滑肌则起源于神经嵴。我们的工作阐明了动脉瓣的发育起源，并明确证明了它与房室瓣不同（图4，S6）。在我们的谱系追踪过程中，我们发现sox10+假定神经嵴细胞在70小时受精后（hpf）之前不存在于房室瓣中，这一发现扩展了先前在5天受精后（dpf）观察到其存在的研究，我们也对此进行了确认（图S6）。我们在70hpf和118hpf时观察到sox10+细胞对动脉瓣的贡献很小且可变（图4，S6）。这些细胞在两个瓣中确切的作用尚不清楚，特别是考虑到它们在房室瓣中的空间位置不一致且在118hpf时突然出现。一个可能的机制（小鼠研究支持该机制）可能是，这些细胞并非起源于神经嵴，而是在瓣膜开始形成后，在发育中的瓣膜中上调了sox10。多项研究已经表明斑马鱼动脉极的发育和解剖结构具有保守性，而我们的研究对此进行了扩展。我们发现elnb是动脉球的最早且唯一标记物，而MLCK在54hpf时标记动脉球和瓣膜间充质细胞（VICs）（图5）。随着这种平滑肌的分化，Transgelin上调，MLCK变得仅限于膜上，并产生一氧化氮（由DAF-FM标记）。有趣的是，与此同时，瓣原基的VICs下调MLCK，这可能表明这两种细胞群具有共同的发育起源。我们还观察到Sox9信号强烈存在于流出道平滑肌以及咽区其他结构的平滑肌中（图4，S7，以及未显示的数据）。在小鼠P1期，磷酸化的Sox9存在于根部壁中，支持了Sox9在流出道壁中的表达实际上是一种保守模式。多项研究已经表明斑马鱼动脉极的发育和解剖结构具有保守性，而我们的研究对此进行了扩展。我们发现elnb是动脉球的最早且唯一标记物，而MLCK在54hpf时标记动脉球和瓣膜间充质细胞（VICs）（图5）。随着这种平滑肌的分化，Transgelin上调，MLCK变得仅限于膜上，并产生一氧化氮（由DAF-FM标记）。有趣的是，与此同时，瓣原基的VICs下调MLCK，这可能表明这两种细胞群具有共同的发育起源。我们还观察到Sox9信号强烈存在于流出道平滑肌以及咽区其他结构的平滑肌中（图4，S7，以及未显示的数据）。在小鼠P1期，磷酸化的Sox9存在于根部壁中，支持了Sox9在流出道壁中的表达实际上是一种保守模式。对斑马鱼vangl2和tbx1突变体的分析为斑马鱼和哺乳动物流出道的发育提供了重要联系（图6，7）。小鼠中Tbx1的缺失导致远端流出道缩短，并影响前间隔心内膜垫（ICVS）的发育，我们在斑马鱼tbx1突变体中也发现了相似的表型（图6），这与22q11.2缺失（DiGeorge）综合征中观察到的先天性心脏畸形相似。然而，虽然Tbx1小鼠突变体中前间隔心内膜垫受到影响，这是因为它需要后侧SHF的添加，但在斑马鱼tbx1突变体中，两个动脉瓣都受到了相似的影响（图6），这表明未分隔的流出道可能没有小鼠中观察到的独特区域特征。相比之下，vangl2的缺失导致了一个更为细微的缺陷，即瓣原基中存在足够数量的SHF衍生细胞，且位置正常，但由elnb标记的平滑肌区域的整体大小和形状异常（图7）。这表明，与小鼠类似，平面细胞极性（PCP）信号的缺失可能导致动脉极的细胞添加紊乱，而不是如tbx1突变体中所观察到的细胞缺失。关于纯合子人类VANGL2突变的了解很少，因为这些突变很可能与发育不兼容。患者主动脉瓣形态异常与血流动力学改变和主动脉病变相关，但哪种异常（血流、瓣膜结构或壁完整性）是驱动这种病理过程的原因仍不清楚。斑马鱼在研究这些相互作用方面具有独特优势，因为它们的血流依赖性过程高度保守，且便于进行重复的体内活体成像。先前的研究表明，心脏功能是流出道生长所必需的，并且tnnt2a突变体（缺乏心跳）据报道完全缺乏动脉瓣原基。此外，最近的研究表明，斑马鱼中TGF-β信号的破坏会导致动脉极扩张，这种扩张在转录上与马方综合征和胸主动脉瘤夹层相似。这与我们对流出道结构发育保守性的描述相结合，表明斑马鱼可能作为研究更广泛动脉极畸形的模型。在斑马鱼中研究瓣膜发育有许多优点：该过程的时间可重复性、关键阶段的可获取性、适合活体成像的体外发育，以及所有这些都可能在研究受到监管的阶段（通常为5dpf）之前完成。虽然以前大多数关于瓣膜发育的发育学研究都是在小鼠中进行的，然后发现这些研究在人类和其他物种（如斑马鱼）中也是相关的，但现在显然可以在斑马鱼中进行更多的发育学研究，并在小鼠中进行确认，从而大大减少基础研究中哺乳动物的使用。综上所述，我们已经证明，斑马鱼动脉瓣的两个瓣叶是通过与小鼠和人类间隔瓣叶相同的发育机制形成的，这与房室瓣的形成机制不同。这为通过人类基因变体的功能测试利用斑马鱼来理解人类先天性心脏病开辟了新途径。斑马鱼饲养
成年斑马鱼（D. rerio）按照标准实验室条件进行饲养，所有操作均符合英国当地动物福利和伦理审查机构（AWERB）、英国内政部和纽卡斯尔大学（项目许可证P25F4F0F4和PP0696166）的规定，并与欧洲议会指令2010/63/EU保持一致。成年斑马鱼通过使用三卡因甲磺酸盐（MS222，Merck E10521）进行终末麻醉后破坏大脑进行安乐死。所用特定品系和胚胎及成年组织收集方案的详细信息见补充方法。野生型C57BL/6小鼠按照标准实验室条件进行饲养，所有操作均符合当地动物福利和伦理审查机构（AWERB）和纽卡斯尔大学（项目许可证30/3876和P9E095FF4）的规定，并与欧洲议会指令2010/63/EU保持一致。在P90时，通过颈椎脱位法处死小鼠，取出心脏，剥离感兴趣区域，用4%多聚甲醛固定，按照标准程序进行系列脱水并用石蜡（VWR, 361077E）包埋。使用Leica RM2235切片机将蜡块切成8微米的薄片，并将同一心脏的交替切片分为三个不同组，分别用于分析弹性蛋白、蛋白聚糖和胶原。使用Olympus BX61显微镜和cellSens Dimension软件（Evident）对Tg(kdrl:GFP)胚胎在2%甲基纤维素（Sigma M0262）中进行成像。
将DAF-FM（Thermo, D23842）以5mM的储备浓度稀释在DMSO（Thermo, 11385597）中。在固定前30分钟，将20个手动去壳的胚胎在28.5ºC的E3培养液中的3mL 5μM BrdU中孵育，E3中DMSO的最终浓度为1%。将胚胎在4ºC的4%多聚甲醛中固定过夜，然后脱水至100%甲醇，并储存在-20ºC。在孵育和免疫组织化学之前，将胚胎避光保存。将BrdU（Merck, B5002）以10mg/mL的浓度溶解在E3培养液中，使用0.22μm过滤器过滤，分装并在-20ºC长期保存。对于BrdU脉冲处理，将20个手动去壳的Tg(kdrl:GFP)胚胎在28.5ºC的E3培养液中的3mL 5mg/mL BrdU中孵育。将胚胎用E3培养液冲洗，然后在4ºC的4%多聚甲醛中固定过夜，接着脱水至100%甲醇，并储存在-20ºC。在重新水化后并在免疫组织化学之前，胚胎在室温下用2N盐酸孵育1小时，然后在阻断前（见下文）进行了彻底的洗涤。对于Miller氏弹性纤维染色、阿尔新蓝染色和马松三色染色，将成年斑马鱼心脏从70%乙醇中洗涤至100%乙醇中，并在100%乙醇中过夜。第二天，将心脏在室温下于50-50（100%乙醇-二甲苯）中孵育30分钟，然后在65ºC的100%二甲苯中洗涤两次，每次1小时；在65ºC的50-50（二甲苯-蜡）中孵育1小时；在65ºC的蜡中孵育两次，每次30分钟；最后在65ºC的蜡中孵育45分钟，然后进行石蜡包埋。将蜡块切成8微米的薄片，并将同一心脏的交替切片分为三个不同组，分别用于分析弹性蛋白、蛋白聚糖和胶原。对于整个成年斑马鱼的组织学检查，将胚胎切断以去除躯干部分，然后从70%乙醇中洗涤至100%乙醇中，并在100%乙醇中过夜。第二天，将心脏在室温下于二甲苯中孵育两次，每次30分钟；然后在65ºC的50-50（二甲苯-蜡）中孵育1小时；接着在65ºC的蜡中孵育四次，每次1小时；然后进行石蜡包埋。将蜡块切成8微米的薄片，并使用标准协议用苏木精（Harris, Sigma HHS16）和伊红（H&E）进行染色。将石蜡切片在二甲苯中脱蜡，并在超纯水（MQ H2O）中复水。为了进行弹性蛋白染色，将载玻片在Miller氏弹性纤维染色液（VWR, 351154S）中孵育2小时（小鼠）或1小时（斑马鱼），用超纯水冲洗后，在新鲜的3%氯化铁（Merck, 157740）中孵育20分钟（小鼠）或10分钟（斑马鱼），用流水冲洗，并用10%伊红Y（Thermo, 6766010）复染5分钟。阿尔新蓝染色（abcam AB150662）按照制造商的说明进行。在进行胶原染色之前，将复水的切片在室温下于Bouin氏溶液（Sigma HT10132）中孵育过夜（16小时），然后在流水下冲洗8分钟，用双蒸水（ddH2O）冲洗2分钟。将载玻片在Weigert氏铁苏木精（Sigma HT1079）中孵育7分钟，在流水下冲洗3分钟，然后用双蒸水冲洗2分钟。使用马松三色试剂盒（Sigma, H15-1KT），将载玻片在Biebrich猩红-酸性品红中孵育7分钟，用双蒸水冲洗2分钟，然后在磷钨酸/磷钼酸中孵育45分钟（伴随搅动），在苯胺蓝中孵育45分钟（伴随搅动），用新鲜的1%乙酸冲洗2分钟，并在双蒸水中快速冲洗3次。染色完成后，所有载玻片均在二甲苯中透明，脱水并用Histomount（National Diagnostics HS-103）封片。将胚胎从100%甲醇中复水至PBST，并在PBS-X（含0.2% Triton-X（Sigma T8787）的1xPBS）中冲洗，然后在室温下用含5%正常山羊血清（Fisher Scientific 10098792）和10mg/mL牛血清白蛋白（A2153, Sigma）的PBS-X（封闭缓冲液）封闭1小时。使用了以下一抗：心脏肌钙蛋白（DSHB CT3，小鼠IgG2a，1:200）、平滑肌蛋白（Tagln，Stratech GTX125994，兔，1:1000）、BrdU（Abcam ab6326，大鼠，1:200）、绿色荧光蛋白（GFP，Abcam 13970，鸡，仅用于BrdU和FISH，1:500）、DsRed（也结合mCherry，Takara Bio 632496，兔，1:200）、Isl1/2（DSHB 39.4D5，小鼠IgG2b，DSHB 1:50）、肌球蛋白轻链激酶（MLCK，Merck SAB4200808（克隆K36），小鼠IgG2b，1:200）、Sox9（abcam ab185230，兔，1:500）。一抗在含1%二甲基亚砜（DMSO，Thermo, 042780-AK）的封闭缓冲液中于4ºC过夜孵育，并伴随搅动。第二天，将胚胎在PBS-X中冲洗，并在室温下彻底洗涤两小时。使用了以下二抗（Thermo）：驴抗小鼠647（A31571）、山羊抗兔594（A11012）、驴抗大鼠594（A21209）、山羊抗鸡488（A11039）、驴抗兔568（A11042）、山羊抗小鼠IgG2a 350（A21130）、山羊抗小鼠IgG2b 594（A22145）、驴抗兔647（A31573）、山羊抗小鼠IgG2a 647（A21241）、山羊抗小鼠IgG2a 488（A21131）和山羊抗小鼠IgG2b 647（A21242）。二抗在含1% DMSO的封闭缓冲液中以1:200的稀释度于4ºC过夜孵育，并伴随搅动。第二天，将胚胎在PBS-X中冲洗三次，并迅速脱水至100%乙醇，用于树脂包埋，树脂包埋的具体方法在补充方法中描述。使用正向引物5’-ATTAGGGGCTGGTGTTGGAA-3’和反向引物5’-CCAAGTCCAAATCCAGCACC-3’从76小时胚胎（hpf）野生型（AB）cDNA中克隆出elnb（ENSDARG00000069017）探针。将1089bp的片段连接到pCRII-TOPO载体（Fisher 11503837）中，并通过Sanger测序（Eurofins）确认插入。为了生成反义mRNA，用BamHI（NEB R0136）对质粒进行线性化，并在存在双氧标记核苷酸（Merck, 11277073910）的情况下使用T7 RNA聚合酶（Promega, P207E）进行转录。mRNA原位杂交的具体步骤在补充方法中列出。将胚胎复水至双蒸水（ddH2O），并在室温下于米勒氏弹性纤维染色液中孵育8小时，然后在ddH2O中冲洗，再在新鲜配制的3%三氯化铁溶液中于室温下孵育1小时，之后在ddH2O中冲洗，并在曙红Y中于室温下过夜孵育15小时。第二天，将胚胎在ddH2O中冲洗，并脱水至100%乙醇，用于树脂包埋。将树脂包埋的成年斑马鱼心脏进行连续切片，切片厚度为7微米，然后用苏木精和伊红染色，拍照，并使用Amira 2020.2（Thermo）软件进行三维重建。免疫组织化学、切片以及对野生型同胞和vangl2突变体胚胎的成像均按照所述方法进行。在Fiji中将DAPI和MLCK通道以及Tg(kdrl:GFP)和心脏肌钙蛋白通道合并，并转换为RGB图像。将两个图像栈导入Amira并进行对齐，确保两个图像栈相互对齐。对内皮、管腔、心肌和平滑肌进行分割，并将剩余空间定义为左或右原基。体积测量是从材料统计功能中提取的。每个实验至少进行两次，由来自不同亲本在不同天数收集的不同批次胚胎组成。BrdU分析进行了三次，每次实验重复由五个胚胎组成，在同一胚胎中，对原基中的细胞数量进行了量化。样本大小在分析前是预先确定的。对于所有其他分析，单个胚胎代表一个实验重复，并且样本大小没有预先确定。对野生型（AB）和Casper Tg(kdrl:GFP)基因型的胚胎（<5天孵化后）进行了苏木精和伊红（H&E）染色以及米勒氏弹性纤维染色。未观察到差异。所有统计分析均在GraphPad Prism中进行。原文地址：https://academic.oup.com/cardiovascres/advance-article/doi/10.1093/cvr/cvae230/7842808?login=false注：因文章篇幅有限，所有相关引用文献，以及补充素材可以点击至原文查阅。
苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过六年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。
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