文献：Pham VC, Rödel CJ, Valentino M, Malinverno M, Paolini A, Münch J, Pasquier C, Onyeogaziri FC, Lazovic B, Girard R, Koskimäki J, Hußmann M, Keith B, Jachimowicz D, Kohl F, Hagelkruys A, Penninger JM, Schulte-Merker S, Awad IA, Hicks R, Magnusson PU, Faurobert E, Pagani M, Abdelilah-Seyfried S. Epigenetic regulation by polycomb repressive complex 1 promotes cerebral cavernous malformations. EMBO Mol Med. 2024 Oct 14. doi: 10.1038/s44321-024-00152-9. Epub ahead of print. PMID: 39402138.
杂志：EMBO Molecular Medicine
脑海绵状血管瘤（CCM）是大脑血管的异常病变。CCM蛋白CCM1/KRIT1、CCM2或CCM3/PDCD10的缺失会触发MAPK-Krüppel样因子2（KLF2）信号级联反应，导致一系列病理性基因表达。然而，被KLF2激活的下游靶基因大多尚不清楚。在本研究中，我们发现Polycomb抑制复合物1的组成部分——同源染色体盒蛋白7（CBX7）在斑马鱼心血管发育过程中，参与了病理性KLF2信号的调控。CCM患者的病变部位，以及缺失CCM的人的、鼠类和斑马鱼的内皮细胞中，CBX7/cbx7a mRNA的表达显著上调。对CCM缺失模型——斑马鱼ccm2突变体、CCM2缺失的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）以及临床前的鼠类CCM3疾病模型进行CBX7/Cbx7a的基因沉默或药理学抑制，均有效抑制了病理性CCM表型。来自斑马鱼心血管组织和人类内皮细胞的全转录组数据表明，CBX7/Cbx7a在KLF2靶基因（如TEK、ANGPT1、WNT9以及与内皮-间充质转化相关的基因）的激活中起到了作用。我们的研究揭示了CBX7在KLF2依赖的生物力学信号调控中的复杂作用，并为CCM的病理机制提供了新的治疗策略思路。![]()
脑海绵状血管瘤（CCMs）可呈散发或遗传家族性形式出现，其特点是主要发生在大脑毛细血管-静脉血管床中的出血。这些病变可能在一生中反复出现，导致严重的神经系统问题，甚至可能致命。目前的治疗方法主要依赖外科手术，但当CCM病灶出现在无法手术的脑或脊髓区域时，手术治疗受限。因此，亟需药物治疗手段，来预防病灶的形成或促进急性病灶的消退。家族性CCM已被确认为与编码Krev相互作用捕获蛋白1（KRIT1）/CCM1、Malcavernin/CCM2或程序性细胞死亡10（PDCD10）/CCM3的基因的功能丧失突变有关。缺失任何一个这些蛋白都会引发类似的疾病表型，这主要是由于MAP3K3/ERK5和Krüppel样转录因子KLF2/4信号的增强。这是内皮细胞中生物力学反应的关键调控途径。功能研究表明，当CCM缺失小鼠失去Klf2/4基因时，相关的心血管缺陷会得到抑制；同样，当斑马鱼ccm突变体缺失Klf2a/b时，CCM表型也被抑制。Klf2可以引发内皮-间充质转化（endMT），这被认为会促使CCM病灶的形成，因为内皮细胞获得了间充质的特性。这些发现确立了KLF2信号作为CCM中的关键因素，但其在疾病病理中的下游靶点仍然大多未知。多项研究表明，血流量影响了CCM模型中病理表型的严重程度和发生率。完全缺失Krit1蛋白的斑马鱼表现出严重的心脏缺陷，阻止了血流的产生。在这种无血流的生理条件下，甚至主要血管也出现了CCM表型。令人惊讶的是，Krit1在心脏中特异性表达恢复了血流，并抑制了这些主要血管中的病理表型。这表明高水平的血流具有保护作用，相反，在低或无血流的区域则更容易发生CCM病变。同样，缺失KRIT1或CCM2的人内皮细胞在暴露于高流体剪切应力时，其转录特征类似于野生型。然而，在低剪切应力条件下，这些内皮细胞表现出典型的CCM信号转录反应。这些研究表明，CCM中的病理信号发生在缺乏强流体剪切应力的情况下。这些结果也暗示了一种分子机制，能够根据血流强度来调控Klf2朝向不同的靶基因。Polycomb家族蛋白在胚胎发育过程中是调控染色质状态的核心调节因子。它们通过控制基因组的表观遗传变化，影响一系列生物过程，包括分化程序、细胞周期进程、干细胞状态和内皮-间充质转化。Polycomb家族蛋白组装成两个不同的复合物，具有不同的组蛋白修饰活性。Polycomb抑制复合物2（PRC2）包括甲基转移酶EZH1/2，它们在组蛋白H3的第27位赖氨酸上进行三甲基化（H3K27me3）。这一修饰被认为具有抑制性，PRC1中的染色盒蛋白（CBX）识别这一修饰，并引导PRC1接近PRC2。PRC1的主要酶是E3泛素连接酶RING1A/B，它们单泛素化组蛋白H2A的第119位赖氨酸（H2AK119ub）。这些表观遗传标记导致染色质压缩及基因组位点的转录沉默。CBX7是PRC1的组成部分，是调控发育过程中的重要表观遗传因子，包括上皮-间充质转化（EMT）。EMT与内皮-间充质转化（endoMT）相关联，后者与CCM的发生有关。在多种癌症中观察到Polycomb家族蛋白的功能获得性激活。例如，CBX7在胃癌、来源于生发中心的滤泡性淋巴瘤以及急性髓系白血病中显著上调，促进了细胞增殖、抑制了分化，并维持了干细胞的自我更新能力。在本研究中，我们发现Cbx7a/CBX7的缺失可以抑制CCM缺陷的斑马鱼和人类脐静脉内皮细胞（HUVECs）的病理表型。在斑马鱼中，Cbx7a的表达受到血流抑制，但被Klf2a激活。Cbx7a反过来引导Klf2a转向病理性靶基因。为了确定这些病理性下游靶基因，我们采用了一种内皮细胞特异性Klf2a过表达的转基因模型。通过定量分析候选基因的表达水平，并对Cbx7a进行共同沉默实验，我们发现Tie2受体（由tek基因编码）和Wnt9信号通路在斑马鱼CCM模型中起关键作用。我们的研究揭示了PRC依赖的表观遗传调控在CCM发病机制中的重要作用。我们还表明，抑制Cbx7a的药物可以防止斑马鱼CCM2模型和临床前鼠类CCM3疾病模型中的心血管病理表型，这使CBX7成为CCM药物治疗的一个特别有前景的靶点。为了确定CCM中病理性靶基因转录调控的分子机制，我们分析了斑马鱼ccm2m201突变体心脏和小鼠条件性内皮特异性Krit1敲除模型的已发表的微阵列和RNA测序数据。在斑马鱼ccm2m201突变体中，表达显著上调的基因之一编码PRC1组成部分Cbx7a（图1A，B）。在斑马鱼krit1ty219c突变体心脏中，cbx7a的mRNA表达同样上升，其同源基因Cbx7在小鼠条件性内皮特异性Krit1敲除模型中也呈现上调，并且在人类iPSC来源的内皮细胞（ECs）中，CBX7的表达也上调（图1B）。随后，我们检查了已发表的斑马鱼ccm2m201突变体全转录组数据中PRC1其他组成部分的表达情况。与野生型相比，编码PRC1蛋白的几个基因显著变化（数据集EV1）。这促使我们进一步研究Cbx7a和PRC1在斑马鱼CCM模型中的作用。![]()
图1 Cbx7a/CBX7在不同的CCM疾病模型和家族性CCM患者的病变组织中表达上调为了阐明cbx7a mRNA在斑马鱼心血管系统中的空间表达模式，我们进行了整体原位杂交实验。结果表明，在ccm2m201和krit1ty219c突变体中，cbx7a在整个心内膜中高水平表达（图1D，E和EV1B，D），而野生型中的表达水平较低（图1C和EV1A，C）。此外，我们通过qRT-PCR对纯化的心脏、头部和尾部样本进行了cbx7a表达水平的定量分析（图1F）。结果显示，在心脏组织和尾部区域，cbx7a mRNA水平显著上调，表明其在斑马鱼CCM突变体的整个心血管系统中广泛上调。![]()
为了探讨CBX7是否也在CCM患者中上调，我们对CCM家族病例的原发性病变组织进行了CBX7的免疫组化染色。在对CCM1和CCM2家族病例患者脑部病变和周围神经组织进行的CBX7抗体免疫组化中，发现其内皮细胞（ECs）中强表达CBX7（图1G–J）。与之相比，健康对照组织的内皮细胞中CBX7表达较低（图1K）。Cbx7a的缺失抑制了斑马鱼CCM突变体中的心血管表型接下来，我们旨在对Cbx7a在斑马鱼CCM模型中的功能进行表征。我们利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术生成了cbx7a功能缺失突变体。通过靶向并删除该基因座推定的启动子区域的510bp（图2A），我们成功创建了突变体，避免了基因补偿机制的影响。缺失启动子的等位基因cbx7apbb62完全缺乏野生型的cbx7a mRNA（图2B），但与其野生型同胞相比，突变体并未表现出显著的形态学变化（附录图S1A，B）。我们还发现，cbx7apbb62或ccm2m201单突变体，以及ccm2m201;cbx7apbb62双突变体中，cbx7a的旁系同源基因cbx7b的表达水平没有改变（附录图S1C）。然而，对cbx7apbb62突变体的进一步表征显示，心内膜细胞的数量相较于野生型略有减少（附录图S1D）。![]()
图2 Cbx7a/CBX7抑制斑马鱼ccm2m201突变体中的CCM相关表型，并受Klf2a和血流控制为了功能性测试Cbx7a是否在CCM突变体的心血管表型中起作用，我们生成了ccm2m201;cbx7apbb62双突变体胚胎并分析其心血管发育。在受精后56小时（hpf），心脏的房室管（AVC）将心房和心室分隔开（图2C，箭头），AVC的心内膜细胞将形成未来的心脏瓣膜，并且通过活化的白细胞黏附分子（ALCAM）标记（图2C’）。与野生型相比，ccm2m201突变体表现出显著的心脏扩大（图2D），并且在AVC处缺乏心内膜缓冲细胞（图2D’），且没有血流（图EV2A）。此外，突变体心脏缺少将心内膜与心肌分隔的厚实心脏胶质层（图2D’，图2C’中的星号标记）。当在ccm2m201;cbx7apbb62双突变体中去除Cbx7a功能时，心脏的形态和功能恢复正常（图2E），部分双突变体中血流也得到恢复（图EV2A）。在这些双突变体中，AVC处的心管形态恢复至野生型状态，并且ALCAM阳性的心内膜缓冲细胞再次出现（图2E，E’）。同样，ccm2m201突变体中过多的心内膜细胞数量也恢复至野生型水平（图2F）。此外，其他与CCM相关的心血管缺陷，包括侧背主动脉的过度增生和尾静脉丛的异常网络形成，在ccm2m201突变体中通过Cbx7a的缺失得到了修复（图EV2B–M）。这种对CCM相关表型的抑制并不能用klf2a mRNA表达水平的恢复来解释，因为通过qRT-PCR对整个胚胎的分析表明，klf2a及其同源基因klf2b的表达在表型恢复的ccm2m201;cbx7apbb62双突变体中依然维持在较高水平（图2G）。在krit1ty219c突变体中，我们也观察到了类似的表型修复效应，方法是通过反义morpholino寡核苷酸敲低cbx7a。在该模型中，心脏形态得到修复，AVC处心内膜细胞的ALCAM表达恢复正常（图EV2N–R）。为了可视化此实验中的klf2a表达水平，我们使用了转基因报告系统TgBAC(klf2a:Citrine)mu107 （图EV2N’–Q’），并发现，敲低Cbx7a后，krit1ty219c突变体的心内膜中klf2a表达依然较高（图EV2P’），相比之下，野生型中的表达较低（图EV2N’）。这些实验表明，Cbx7a的缺失能够抑制ccm2m201和krit1ty219c突变体中的内皮细胞表型，而这种抑制效应并不涉及Klf2a转录水平的恢复。![]()
图EV2 CCM突变的心血管缺陷在斑马鱼胚胎中通过去除Cbx7a而被抑制为了评估CBX7是否在CCM缺失的人类内皮细胞中发挥类似作用，我们采用siRNA技术在人的脐静脉内皮细胞（HUVECs）中敲低CCM2。缺失CCM2导致细胞间连接破坏，表现为VE-cadherin标记减弱，细胞间出现间隙，并伴有细胞形态拉长及应力纤维增多的现象（图2H，I'）。显著的是，CBX7的siRNA敲低抑制了CCM2敲低后HUVECs的拉长形态，减少了应力纤维密度，恢复了皮质中的肌动蛋白细胞骨架，并通过跨内皮渗透屏障实验恢复了内皮细胞层的紧密性至正常水平（图2J，J'，L）。相比之下，另一个PRC1蛋白CBX2的siRNA敲低并未缓解HUVECs中的CCM表型（图2K，K'，L），表明CBX2在CCM2缺失的HUVECs的形态和病理中不起作用。Klf2的生物力学信号已被证明在心脏房室管（AVC）区域的正常发育及CCM蛋白缺失导致的异常瓣膜发育中均有重要作用。为了确定Cbx7a与Klf2a在斑马鱼ccm2突变体中的关系，我们测试了Klf2是否影响cbx7a mRNA表达水平的升高。首先，我们生成了ccm2m201;klf2ash317;klf2bpbb42三重突变体胚胎，并进行了整体原位杂交。我们发现，80%的三重突变体胚胎心脏功能正常，其心内膜中cbx7a mRNA表达水平降低（图2M–O；n=8/10个胚胎中cbx7a mRNA表达降低）。在20%的三重突变体中，心脏功能异常，缺乏血流，cbx7a mRNA的表达依然升高（图2P；n=2/10）。接下来，我们测试了Klf2a是否足以诱导cbx7a的mRNA表达。我们在Tg(fli1a:Gal4FF)ubs3;Tg(UAS:klf2a)ig1 双转基因胚胎中进行整体原位杂交，这些胚胎在内皮细胞中强制性表达Klf2a（图2Q，R）。在56小时受精后（hpf），Klf2a的过表达导致心脏膨胀（图2Q），部分胚胎由于心脏形态异常和AVC未能变窄而缺乏血流。值得注意的是，缺乏血流的Tg(fli1a:Gal4FF)ubs3;Tg(UAS:klf2a)ig1 胚胎中cbx7a mRNA的水平显著升高（图2R）。我们在注射了针对肌节蛋白Troponin T2a（Tnnt2a）的反义morpholino寡核苷酸的胚胎中重复了这一实验，Tnnt2a是心肌收缩所必需的。Tnnt2a敲低的胚胎完全没有血流，在Tg(fli1a:Gal4FF)ubs3;Tg(UAS:klf2a)ig1 胚胎中出现了心脏膨胀表型（n=40/40个胚胎），cbx7a mRNA水平升高（图2S），并且AVC处心内膜细胞的ALCAM表达丧失（图EV3A–D）。这些实验表明，Cbx7a的表达由Klf2触发，并受到血流的抑制。![]()
图EV3 共生血流丧失和内皮过度表达Klf2a导致斑马鱼胚胎出现类似脑动静脉畸形的先天性心脏病表型Cbx7a在斑马鱼CCM模型中对多个Klf2靶基因的激活是必需的接下来，我们旨在明确PRC1组分Cbx7a是否影响Klf2靶基因的激活。为此，我们设计了一种转录组分析策略，识别Cbx7a依赖的Klf2a靶基因，这些基因需满足以下条件：（1）在CCM突变体中上调；（2）在ccm2;cbx7a双突变体中至少部分恢复正常；（3）可被Klf2诱导。首先，我们对野生型、ccm2m201突变体和ccm2m201;cbx7apbb62双突变体的心脏在56小时受精后（hpf）进行大规模RNA测序。我们预计与CCM表型相关的基因将在野生型和双突变体中恢复正常。在比较心脏转录组数据时，我们发现有1330个基因在ccm2m201突变体中相较于野生型上调。其中，429个基因在ccm2m201突变体与ccm2m201;cbx7apbb62双突变体中同样上调。对这429个基因进行基因本体分析显示，与血管生成、细胞迁移、内皮细胞增殖、endoMT、Wnt信号通路等相关的术语富集，其中一些过程已被证实与CCM的病理有关（图3A）。相反，有1413个基因在ccm2m201突变体中下调，其中513个基因在ccm2m201与ccm2m201;cbx7apbb62双突变体中同样下调。对这513个基因的基因本体分析显示，与细胞黏附、ECM组织和EMT过程相关的术语富集（图3A）。在与血管生成、经典Wnt信号和endoMT相关的基因中，几种基因此前已被证明与KLF2/4信号有关（图3B）。为了进一步研究这些分子途径的下游效应，我们选择了其中的三个基因进行后续功能研究。![]()
图3 Cbx7a/CBX7在CCM中导致病理基因表达，影响斑马鱼突变体的心血管缺陷Klf2a-Wnt9b信号缓解斑马鱼突变体中的CCM心血管缺陷Wnt9b在小鼠心脏瓣膜发育过程中受Klf2直接调控。我们发现斑马鱼中的wnt9b及其旁系同源基因wnt9a在ccm2m201（图3B，C）和krit1ty219c突变体中上调（图3C）。通过整体原位杂交，我们也在krit1ty219c和ccm2m201突变体心脏中检测到了wnt9b mRNA的上调（图EV4A，B，D，E，D'，E'）。为了验证wnt9b是否由Klf2a转录调控，我们使用了Tg(fli1a:Gal4FF)ubs3;Tg(UAS:klf2a)ig1 双转基因胚胎来驱动内皮细胞中特异性过表达Klf2a。通过整体原位杂交实验，我们发现斑马鱼wnt9b mRNA在心内膜中上调（图3E），相比野生型（图3D），这验证了其受Klf2a诱导。同样，利用反义morpholino寡核苷酸敲低klf2a和klf2b后，ccm2m201和krit1ty219c突变体中的wnt9b mRNA上调被抑制（图EV4C，F）。![]()
图EV4 在ccm斑马鱼突变体中wnt9b表达的上调涉及Klf2，并有助于CCM表型为了验证Wnt9b在CCM心血管缺陷表达中的潜在作用，我们使用针对wnt9b的反义morpholino寡核苷酸敲低了ccm2m201和krit1ty219c突变体胚胎中的wnt9b。敲低wnt9b缓解了许多与ccm2m201和krit1ty219c突变体相关的心血管缺陷。例如，Ccm2或Krit1的缺失与心脏膨胀表型和心内膜AVC处ALCAM丧失密切相关，而这些表型在敲低wnt9b后得到明显恢复（图3F，G' 和 EV4G，H' 对比图3H，H' 和 EV4I，I'）。同样，在ccm2m201;wnt9bsa20083双突变体胚胎中，心脏膨胀和AVC处ALCAM的表达恢复正常（图EV4K–M，K'–M'）。相比之下，wnt9b morphant和wnt9bsa20083突变体并未在AVC处表现出明显的表型缺陷（图3I，I' 和 EV4J，J'，N，N'）。这表明Klf2a-Wnt9b信号通路在斑马鱼CCM模型中的CCM心血管缺陷表达中起作用。接下来，为了进行转录组和表观遗传分析，我们生成了缺失CCM2的iPSC来源内皮细胞（图3J–M；附录图S2）。这些细胞表达内皮标志物von Willenbrand因子（vWF）（附录图S2D，E），并显示出正常的核型特征，表明细胞系健康（附录图S2F，G）。与野生型细胞相比，CCM2缺失的iPSC来源内皮细胞表现出更多的肌动蛋白应力纤维（图3J，K）和较弱的VE-cadherin标记，表明细胞黏附能力减弱（图3L，M），这也是CCM病理的两个典型特征。随后，我们使用这些CCM2缺失和野生型对照的iPSC来源内皮细胞进行RNA测序分析，发现CBX7、WNT9B、KLF2和KLF4 mRNA的表达水平增加（图3N和EV5A；数据集EV2）。该基因集还显示了与血管生成、Rho蛋白信号、细胞迁移及细胞黏附负调控相关的基因本体（GO）术语的富集（图EV5B）。![]()
图EV5 CCM2敲除（KO）iPSC衍生的内皮细胞中的转录和表观遗传调控PRC2蛋白参与组蛋白H3第27位赖氨酸（H3K27me3）的三甲基化，招募PRC1蛋白至特定染色质区域，导致H2AK119ub修饰并抑制基因的转录。在CCM2缺失的iPSC来源内皮细胞中，与野生型对照细胞相比，CUT&RUN-seq分析显示H3K27me3标记显著减少。因此，在与血管形态发生、血管生成、VEGF受体信号（与血管生成相关）以及Rho蛋白信号通路（与应力纤维形成相关）相关的基因座上，预测到了转录激活（图EV5C）。我们将这些GO术语与H3K4me3标记进行比较，后者主要富集在活跃表达的基因上，发现与内皮细胞迁移、血管生成和Rho蛋白信号相关的术语有明显的重合（图EV5D）。这些发现表明，CCM2的缺失影响了PRC1/2的活性，并与包括血管生成、Rho蛋白信号和内皮细胞迁移在内的CCM相关病理表型有关。为了验证该基因在人体病理中的相关性，我们检测了CCM患者原发性病变组织中其转录本的水平。结果表明，WNT9B及其同源基因WNT9A的mRNA在散发性和家族性CCM病例的病变组织中均有所增加（图3N）。综上所述，这些数据表明，Cbx7a依赖的Wnt9b上调在斑马鱼CCM模型的表型中发挥作用。此外，来自CCM患者的iPSC来源内皮细胞及病变组织的转录组分析揭示了WNT9B的上调，提示其可能参与CCM病理。Tie1/2信号传导对斑马鱼ccm2突变体中心血管缺陷的表达有贡献全转录组分析表明，Cbx7a可促进多种参与血管生成信号传导的基因表达上调（图3A、B）。例如，ccm2m201突变体中，编码血管生成素受体Tie2及其激活配体血管生成素-1（Angpt1）的基因表达上调。在ccm2m201;cbx7apbb62双突变体中，这些基因的表达恢复正常（图3B、O）。仅缺失Cbx7a会略微降低编码Tie2的angpt1和tek mRNA的表达水平（图3P、Q）。我们还发现，在Tg(fli1a:Gal4FF)ubs3;Tg(UAS:klf2a)ig1双转基因胚胎中，angpt1和tek的转录水平上调，这些胚胎的内皮Klf2a表达增加（图3P、Q）。在敲低Cbx7a后，tek的上调恢复正常水平（图3Q），而angpt1的水平未显著降低（图3P）。为了探究Tie2信号增强与ccm2心血管表型之间的功能相关性，我们通过药理学干预策略和遗传耗竭方法在斑马鱼CCM模型中降低了Tie2的活性。在16体节期至48小时孵化后（hpf）期间，我们用10 µM的BAY826（一种血管生成素受体Tie1和Tie2的拮抗抑制剂，Schneider等，2017）或二甲基亚砜（DMSO）作为对照处理胚胎（图3R–U）。这种抑制剂处理抑制了ccm2突变体的心脏膨大以及心内膜房室管（AVC）处ALCAM表达的丧失（图3S-T’），而对野生型胚胎则无影响（图3U，U’）。接下来，我们采用了遗传耗竭方法，并向tekhu1667/+;tie1bns208/+杂合亲本回交产生的后代中注射了对照反义吗啉代寡核苷酸或针对krit1的吗啉代寡核苷酸（图3V–Y）。该回交产生了一部分tekhu1667;tie1bns208纯合突变体，使我们能够评估Tie1/Tie2信号对krit1功能丧失表型表达的相关性。在存在突变等位基因（尤其是tie1）的情况下，krit1吗啉代物的心脏膨大表型显著降低，而在tekhu1667;tie1bns208双突变体中，krit1表型受到最大程度的抑制（图3W–Y）。这表明Tie1/Tie2信号传导参与了斑马鱼CCM模型中的心血管表型。迫切需要一种有效的针对CCM的药理学策略，这促使我们研究了以Cbx7为靶点的潜力。我们观察到，在斑马鱼CCM模型中，cbx7a mRNA的表达显著增加，这表明该蛋白作为药理学干预的靶点具有一定的前景。两种特征明确的CBX7小分子抑制剂MS351和MS37452先前已在前列腺癌的治疗中进行了测试（图4A）。为了测试Cbx7a是否是CCM的有效药理学靶点，我们用MS351或MS37452处理了16-54小时孵化后（hpf）的ccm2m201突变体斑马鱼胚胎，并评估了这是否对斑马鱼胚胎功能丧失表型中特征性心脏形态缺陷的形成具有预防作用。确实，在这种处理方案下，治疗斑马鱼ccm2m201突变体抑制了心脏过度膨大的表型（图4B–D，n=9/20用MS351拯救的突变体胚胎；n=4/22用MS37452拯救的突变体胚胎），并通过内皮细胞内ALCAM的表达评估，在部分处理过的胚胎中恢复了房室分化（图4B’–D’，箭头所示）。![]()
图4 药理学抑制PRC1蛋白Cbx7a/CBX7在斑马鱼ccm2m201突变体中抑制了与CCM相关的先天性心脏表型，并在小鼠临床前CCM3疾病模型中减轻了病变负担接下来，我们在具有内皮特异性可诱导敲除CCM3结构的前临床小鼠模型中测试了这种药理学干预策略。我们选择CCM3进行这项前临床研究，因为CCM3在患者中表现为最具侵袭性的CCM形式。在出生后第1天（P1）通过他莫昔芬诱导后，Cre阳性的内皮特异性CCM3敲除小鼠（CCM3iECKO）接受了每日MS37452（2 mg/g体重）的胃内注射。随后，在出生后第8天（P8）收集组织时，评估了病变负担，包括总病变数量和面积（图4E–J）。我们发现，与未治疗的小鼠相比，接受MS37452治疗的CCM3iECKO小鼠的病变数量和面积均较低（图4G–J）。这种针对CCM中表观遗传调节剂的药理学阻断干预表明，CBX7是CCM中一个有前景的新治疗靶点。我们的工作和另一项最近发表的研究表明，多梳抑制复合物（PRC）的表观遗传调控影响血管畸形疾病CCM中的病理生理转录。在本文中，我们证明PRC1的组成部分CBX7在与CCM相关的病理生理条件下上调。这使得CBX7成为一个特别有吸引力的药理学干预靶点，因为其表达与CCM病理的活跃阶段相关，且已有现成的抑制药物。我们证明了沉默Cbx7a/CBX7可以抑制斑马鱼心血管发育和人类内皮细胞中的CCM表型。在CCM3疾病的前临床小鼠模型和斑马鱼心血管发育CCM的急性模型中，药理抑制Cbx7可以减小病变大小和数量。我们还证明了受Klf2a和血流调节的Cbx7a影响Klf2a在CCM相关表型发展过程中诱导的内皮细胞基因表达的病理模式。令人惊讶的是，Cbx7a在斑马鱼发育过程中并非必需，因为纯合突变体能存活至成年并具有生育能力。这表明Cbx7a的活性可能在特定的病理生理条件下才发挥特定作用。当内皮细胞的编码CCM蛋白的基因发生功能丧失性突变时，即使在流体切应力较低的区域，KLF2的表达也会上调。在斑马鱼和小鼠模型中的功能研究表明，这会触发一系列病理生理基因的表达模式，并驱动CCM的形成。在健康内皮中，KLF2由高水平的流体切应力诱导，并触发一系列具有血管保护作用的基因表达模式。长期以来，是什么引发了从血管保护到病理基因表达的转变，以及这种转变如何受到生物力学信号的影响，一直是个谜；同样不清楚的是，KLF2下游导致这种病理发展的基因是什么。在这里，我们发现Klf2a在斑马鱼CCM模型中激活PRC1蛋白Cbx7a的表达。有趣的是，这显然是一种生理调节，因为在Klf2;Klf4双敲除小鼠的心脏微血管内皮细胞中，Cbx7的表达下调。我们的研究结果表明，Cbx7a的激活促进了涉及wnt9b、angiopoietin1-tek和内皮-间充质转化（endoMT）特征基因等靶基因以病理生理模式表达（图4K）。此外，生物力学信号对Cbx7a和Klf2a的表达水平具有相反的影响，其中血流抑制Cbx7a的表达（图4K）。因此，CCM中的病理基因表达是Cbx7a和Klf2a综合活动的结果，而血流则影响它们的活性（图4K）。这指向了我们在早期工作中发现的一个现象，即我们发现血流具有保护作用，并能防止krit1/ccm1突变斑马鱼出现心血管异常。同样地，CCM患者的病变是血流缓慢的异常表现。我们提出，CCM中CBX7的激活是一种保守机制，因为从CCM患者病变组织中提取的内皮细胞核中富含CBX7蛋白。我们还发现，在小鼠内皮特异性Krit1/Ccm1敲除模型中，Cbx7上调，同时在人内皮细胞CCM模型中，CBX7也上调，并在病理表型中发挥关键作用。此外，在患者来源的原发性CCM病变组织中，包括WNT9A/B在内的斑马鱼Klf2靶基因的人类同源基因也上调。Klf2激活Wnt9b的过程最初是在小鼠和斑马鱼内心瓣膜发育的研究中发现的。这一过程涉及经典WNT通路信号的增强，进而促进内皮细胞的内皮-间充质转化（endoMT）。我们的新发现进一步证实了WNT9信号在脑血管畸形（CCM）中的作用。先前的研究发现，小鼠内皮细胞中Krit1/Ccm1的缺失导致转录调节因子β-catenin的核定位增加，并通过WNT途径进行信号传导。同样，小鼠中Krit1/Ccm1的内皮特异性敲除也引发了内皮-间充质转化（endoMT）。同一研究小组后来证明，小分子的WNT抑制药物硫代磺达肼屈嗪和磺达肼屈嗪可有效减轻内皮CCM3缺乏小鼠的血管病变负担。然而，Zhou及其同事对这些研究提出了质疑，他们未在CCM中发现任何endoMT或Wnt信号增强的证据。本研究强烈支持Maddaluno及其同事的原始发现，并进一步提供了CCM中endoMT和Wnt信号增强的证据。我们的发现还得到了PRC1在控制发育过程中的上皮-间充质转化（EMT）中扮演重要角色的广泛支持，而Wnt信号也在这一过程中发挥着重要作用。例如，CBX7在人类造血干细胞中表达，其靶标包括Wnt通路基因，如WNT9A和WNT9B的受体FZD9B。据我们所知，我们的发现首次证明了这些通路的表观遗传调控对脑血管畸形（CCM）血管畸形的形成有所贡献。阐明PRC1/2组分是否也参与其他血管畸形的形成将是一个非常有意义的课题。在本研究中，我们发现使用竞争性TIE1/2拮抗剂BAY826处理斑马鱼突变体能抑制与脑血管畸形（CCM）相关的心血管缺陷。这一发现强烈表明，Krit1/Ccm2与TIE2受体功能获得性突变所导致的血管畸形之间存在分子联系。先前的小鼠研究表明，在Ccm3的内皮特异性敲除模型中，Tie2信号增强。相比之下，小鼠Krit1或Ccm2敲除模型中Tie2活性未发生变化。同一研究小组还发现，Ccm3的缺失增加了Tie2低亲和力配体血管生成素2（Angiopoietin 2，Ang2）的分泌。Ang2作为稳定血管的血管生成素-1（Angiopoietin-1，Ang1）的拮抗剂，可破坏内皮细胞连接完整性和血管生成。我们的研究结果现在表明，在任何CCM蛋白缺失的情况下，内皮细胞中TIE2信号增强是普遍现象。这暗示了CCM与由TIE2功能获得性变体（如常见的TIE2L914F受体变体）引起的另一组低血流静脉畸形之间存在联系。在静脉畸形中，TIE2功能获得性变体可强烈激活PI3Ka/AKT信号通路，而该通路也已被证实与CCM相关。CCM（脑血管畸形）的发展需要内皮细胞过度生长，这通常发生在它们获得PIK3CA的致癌功能获得性突变时。特别具有侵袭性的CCM还与致癌MAP3K3功能获得性突变有关，这些突变足以导致畸形，但也可能与PIK3CA功能获得性或CCM功能丧失性突变同时存在。多梳蛋白抑制复合物1/2（PRC1/2）参与多种癌症的发生已得到充分证实。这些表观遗传调控复合物的不同组分与不同的癌症有关。例如，CBX7在急性髓系白血病和其他恶性肿瘤中上调。在之前的情况中，CBX7与几种H3K9甲基转移酶结合，这些甲基转移酶具有与其正常组蛋白靶标H3K27me3相似的三甲基化赖氨酸肽基序。因此，发现PRC1蛋白CBX7在CCM中被激活，为血管畸形中涉及的类似癌症的分子机制提供了又一个线索。我们的研究表明，CBX7的激活不仅导致TIE2-PI3Ka信号传导的增加，还导致内皮间充质转化（endoMT）等致癌特性。我们从CCM2敲除的iPSC衍生的内皮细胞中获得的数据显示，与CCM中内皮功能障碍相关的位点发生了三甲基化的丢失。这表明PRC蛋白活性发生了转变，并且这些位点可能发生了CBX7的潜在丢失。这些问题将在进一步尝试理解血管畸形的潜在病因及其与组织水平特性（如血流引起的机械应力）的联系时引起关注。材料与方法
斑马鱼的处理遵循欧洲实验动物科学协会（Federation of European Laboratory Animal Science Associations，FELASA）的指导原则，符合德国及勃兰登堡州的法律规定，并受到当地动物保护机构（LAVG，德国勃兰登堡州，动物实验协议#2347-43-2021）的严格监督。本研究中使用的斑马鱼品系包括krit1ty219c和ccm2m201、cbx7apbb62、klf2ash317、klf2bpbb42、tekhu1667、tie1bns208、Tg(fli1a:Gal4FF)ubs3、Tg(UAS:klf2a)ig1、Tg(fli1:NLS-mCherry)ubs10、Tg(klf2a:Citrine)mu107和Tg(kdrl:EGFP)s843。cbx7a突变体是通过CRISPR/Cas9介导的突变技术生成的。使用CCTop软件工具（https://cctop.cos.uni-heidelberg.de:8043/index.html）设计了单导向RNA（sgRNA），包括sgRNA1和sgRNA2（序列见表EV1）。sgRNA用于切除编码序列上游80个核苷酸处的510碱基对片段，以生成无启动子等位基因（pbb62）。sgRNA的合成方法如之前所述。简而言之，通过填充PCR使用含有T7启动子、目标序列、部分sgRNA支架序列和通用引物的sgRNA引物合成sgRNA的DNA模板。使用HiScribe™ T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit（New England Biolabs）进行体外转录生成sgRNA。cas9 mRNA是通过使用mMESSAGE mMACHINE™ T3 Transcription Kit（Invitrogen）对XbaI线性化的pT3TS-nCas9n质粒（Addgene #46757）进行体外转录生成的。在单细胞阶段，将约30皮克（pg）的sgRNA和250皮克的cas9 mRNA共同注射到TüLF野生型胚胎中。将注射后的鱼饲养至成年，并通过PCR检测缺失片段来鉴定Founder（即F0代）。将Founder与野生型鱼杂交以生成F1代。每个突变等位基因均来自单一的F1代鱼。从F2代亲本产生的胚胎开始，进行所有实验。基因分型引物见表EV1。通过向单细胞阶段的胚胎中注射1–2纳升（nL）的反义吗啉代（MO）寡聚物（Gene Tools, LLC），进行敲低实验。MO的序列见表EV1。对照组胚胎注射了等量的标准MO。对于CCM突变体的治疗，使用了MS37452（Sigma）、MS351（Cayman Chemical）和BAY826（Tocis）化合物。将粉末状化合物溶解于DMSO中，制备成50 mM的储备溶液，然后进一步在DMSO中稀释，生成1000倍的溶液。通过将1000倍的溶液在含有0.0015% 1-苯基-2-硫脲（PTU）（Sigma-Aldrich）的1×Danieau溶液中稀释，制备工作溶液。在16体节阶段，将大约20个去膜的胚胎转移到6孔板的每个孔中，并加入4 mL工作溶液。然后，将胚胎在28.5 °C下孵育至54–56小时受精后（hpf）。对照组胚胎用0.1% DMSO/0.0015% PTU/1×Danieau溶液处理。如文献所述，从56小时受精后（hpf）的胚胎中提取心脏组织，每份样本收获约50个心脏。提取后，将汇集的心脏转移到Quick RNA micro-prep试剂盒（Zymo kit）的100 µL RNA裂解缓冲液中，并且每个条件至少收集三个生物学重复样本。使用注射器从胚胎中解剖出尾部和头部样本（每份样本10个胚胎，每个条件四个重复），然后将汇集的样本转移到TRIzol试剂（Invitrogen）中。根据制造商的协议分离总RNA，并使用RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis试剂盒（Thermo Fisher Scientific）合成相应的cDNA。RT-qPCR实验按照之前描述的方法进行，在qTower 3 qPCR热循环仪（Analytik Jena）上使用KAPA SYBR® Fast qPCR试剂盒（Sigma），每份技术重复样本使用2 ng（心脏样本）或20 ng（尾部和头部样本）的cDNA。循环阈值（Ct）由仪器操作软件确定。使用eif1b作为管家基因进行标准化。使用2–ΔΔCt方法将对照样本值标准化为1.0。所有引物均列在表EV1中。对于RNA测序，首先从野生型、ccm2m201突变体或ccm2m201;cbx7apbb62双突变体斑马鱼中提取心脏组织，每份样本收获约50个心脏，提取方法如文献所述。提取后，将汇集的心脏转移到Quick RNA micro-prep试剂盒（Zymo kit）的100 µL RNA裂解缓冲液中，并且每个条件至少收集四个生物学重复样本。RNA的提取遵循制造商的协议，并使用TapeStation系统2200（Agilent）评估其完整性。只有RIN（RNA完整性数值）评分高于7的样本才用于后续步骤。使用NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module（NEBNext® Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina®，New England Biolabs）从30 ng总RNA中合成cDNA文库。样本在Illumina NextSeq 550测序仪上使用High Output Kit v2.5（75 cycles，400 M cluster，Illumina）进行测序，并将读取序列与斑马鱼参考基因组（GRCz10）进行比对。使用DESeq2（Galaxy Version 2.11.40.7）和Galaxy平台上的heatmap2软件包进行差异表达分析和热图分析。整体原位杂交（Whole-mount in situ hybridization）首先，通过扩增cbx7a编码序列中约700 bp的片段，并设计一个反向引物（该引物包含一个T7启动子悬垂序列，引物列表见Table EV1），来生成cbx7a mRNA的反义模板。然后，使用mMESSAGE mMACHINE™ T7 Transcription Kit（Invitrogen）和DIG RNA Labeling Kit（Roche）在体外转录反义mRNA原位杂交探针。将54小时受精后（hpf）的斑马鱼胚胎用4%多聚甲醛（PFA）在4°C下固定过夜，然后按照之前描述的方法进行整体原位杂交。杂交后，将胚胎保存在无水甲醇中，直至进行成像。为了成像，首先将样本在苯甲酸苄酯和苯甲醇（比例为1:2）的混合物中透明化处理，然后装载在Permount™装载介质中。使用Axioskop（Zeiss）显微镜和EOS 5D Mark III（Canon）相机，以20倍物镜记录图像，并使用Fiji软件进行处理。斑马鱼Alcam（激活的白细胞细胞粘附分子）的整体免疫组织化学染色按照之前描述的方法进行。使用的抗体包括：小鼠抗Zn-8/Alcam抗体（1/25稀释，发育研究杂交瘤银行提供），Alexa Fluor 546偶联的山羊抗小鼠抗体（1/200稀释，Thermo Fisher Scientific），以及Alexa Fluor 633偶联的山羊抗小鼠抗体（1/200稀释，Thermo Fisher Scientific）。简而言之，胚胎首先用4%多聚甲醛（PFA）固定过夜，然后用含有5%正常山羊血清（NGS）的PBST（磷酸盐缓冲盐水加Tween-20）封闭2小时。之后，将胚胎在含有0.2% Triton X-100、1%牛血清白蛋白（BSA）和5% NGS的PBST中稀释的一抗中孵育过夜。随后，用PBST洗涤胚胎，并在二抗中孵育过夜，之后再次洗涤、装载和成像。样本装载在SlowFade Gold（Thermo Fisher Scientific）中。图像使用LSM 710或LSM 880共聚焦显微镜（Zeiss）记录，并使用Fiji软件进行处理。从Lonza公司获得的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）池，按照制造商的说明，在补充有100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的完全EGM-2培养基中，于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中培养。按照制造商的说明，使用20 nM的siRNA和45 μl的Lipofectamine RNAimax（Life Technologies, #13778-150）对1.5 × 10^6个HUVEC进行两次转染，每次转染间隔24小时。对于双转染，将每种20 nM的siRNA与45 μl Lipofectamine RNAimax一起使用。siRNA双链来自Dharmacon的smartpool ONTARGET plus Perkin Elmer（对照：非靶向1: D-001810-01-50；CCM2: L-014728-01；CBX2: L-008357-01；CBX7: L-009561-01）。使用Lonza公司的MycoAlert支原体检测试剂盒定期检查HUVEC是否受到支原体污染。在第二轮转染后的第二天，将转染后的细胞用胰蛋白酶处理，再用1 mg/ml的胰蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich）处理，然后在含有1%牛血清白蛋白（BSA）的无血清EBM-2培养基中于37 °C下孵育30分钟。将汇合的人脐静脉内皮细胞（2 × 10^5个细胞）接种在涂有10 μg/ml纤连蛋白（FN）的24孔板载玻片上，并在完全补充的EGM-2培养基中孵育48小时。细胞的免疫染色操作如之前所述。简而言之，细胞用4%多聚甲醛（PFA）固定，用0.2% Triton X-100渗透化，然后与以1/200稀释度的抗VE-钙粘蛋白抗体BV9（Millipore）孵育。洗涤后，将盖玻片与以1/1000稀释度的抗小鼠Alexa Fluor偶联的二抗（Invitrogen, #A32723）和以1/2000稀释度的TRITC标记的鬼笔环肽（Sigma-Aldrich, #P-1951）孵育。将盖玻片装载在含有DAPI的Mowiol溶液中，并在带有AxioCamMRc相机的Axiomager荧光显微镜（Zeiss）上进行成像。xCELLigence实时细胞分析仪（RTCA）系统（Ozyme）被用于随时间测量电阻抗的变化。汇合的内皮细胞阻抗的变化反映了屏障功能的变化。将转染后的HUVEC（4 × 10^4个细胞）以汇合状态接种在预先用10 μg/ml玻粘蛋白和50 μg/ml胶原I涂层的E-板的16个孔中（每种条件4个孔），并使用完全EGM-2培养基。细胞贴壁4小时后，进行血清饥饿处理，并在含有0.3%牛血清白蛋白（BSA）的基础EBM-2培养基中再培养24小时。为了消除由于细胞铺展和附着于基底而产生的信号，将细胞指数归一化为血清饥饿处理的时间点。然后绘制了不同条件下24小时时的归一化细胞指数图。人类诱导多能干细胞（h-iPSC）和人类诱导内皮细胞（h-iEC）培养根据制造商的说明，OdinCas9-hiPSCs在Cellartis DEF-CS 500培养系统（Takara Bio）中维持。所有细胞系均在37°C、5% CO2的条件下培养。通过短串联重复序列（STR）分型对细胞系进行鉴定，且经检测无支原体污染。在分化前，细胞需适应mTESR系统（STEMCELL Technologies）。在DEF中培养的h-iPSC用TrypLE Select（Thermo Fisher Scientific, #12563-029）分散成单个细胞，并以35000个细胞/cm²的密度接种在Matrigel CLS354277（Corning）上，培养基为含10 μM Y27632的50% mTeSR1培养基和含GF3的50% DEF培养基。24小时后，将培养基更换为75% mTeSR1和25% DEF，48小时后换液时也采用相同比例。72小时后，细胞再次在Matrigel CLS354277上传代至100% mTeSR系统。在用于分化之前，它们在mTeSR中至少再传代培养两代。在细胞转染前36小时，将40,000个/cm²的OdinCas9-hiPS细胞接种到六孔板中。在转染前16小时，用10 µg/ml的多西环素诱导Cas9表达1小时。转染前几小时更换培养基，以增加处于增殖对数期的可能性。使用CRISPRMAX试剂以2.5:1的转染试剂与sgRNA比例以及反向转染方案对iPSC细胞进行转染。对于转染，将40,000个/cm²的细胞以96孔板格式直接接种到预先制备的转染复合物上，每孔含60 ng的sgRNA，如表EV1所列。使用Cellartis® iPSC单细胞克隆DEF-CS™培养基试剂盒进行单细胞克隆，并根据制造商的说明以每孔0.5个细胞的密度接种到384孔板中。当观察到孔中出现单细胞克隆时，对细胞进行扩增，并采集DNA样本进行下一代测序（NGS）。其余细胞在冷冻培养基（93% FBS，7% DMSO）中冷冻保存。NGS分析后，从每个细胞系中选择三个纯合子敲除（KO）克隆用于后续工作。NGS结果显示未编辑的三个克隆用作野生型对照。对于核型分析，细胞在DEF系统中解冻，当达到融合状态时，传代至T25培养瓶中，并在mTeSR系统（STEM CELL Technologies）中培养。当培养瓶中的细胞达到约80%融合时，根据Cell Guidance Systems提供的方案准备细胞进行核型分析，并将其送至该公司进行分析。核型分析通过g显带法进行评估（附录图S2F，G）。CCM2缺失的h-iPSC衍生的内皮细胞（ECs）的基因组DNA提取和下一代扩增子测序根据说明书，使用QuickExtract DNA提取溶液（Lucigen）从细胞中提取基因组DNA。在NextSeq平台（Illumina）上对基因组DNA样本中的目标扩增子进行分析。简而言之，在第一轮PCR中使用包含NGS正向和反向接头的引物（表EV1）扩增感兴趣的基因组位点。第一轮PCR使用NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix（New England Biolabs）在15 μL反应体系中进行，其中引物浓度为0.5 μM，基因组DNA模板为1.5 μL。PCR采用以下循环条件进行：98 °C预变性30秒；30个循环（98 °C变性10秒；每对引物的退火温度20秒；72 °C延伸20秒）；最后72 °C延伸2分钟。使用HighPre PCR Cleanup System（MagBio Genomics）对PCR产物进行纯化，并在Fragment Analyzer（Agilent）上分析正确的PCR产物大小和DNA浓度。在第二轮PCR中使用KAPA HiFi HotStart Ready Mix（Roche）向PCR产物中添加独特的Illumina索引。在第二轮PCR中加入索引引物，并使用第一轮PCR中纯化的1 ng PCR产物作为50 μL反应体系中的模板。PCR采用以下循环条件进行：72 °C预延伸3分钟；98 °C预变性30秒；然后进行10个循环（98 °C变性10秒；63 °C退火30秒；72 °C延伸3分钟）；最后72 °C延伸5分钟。使用HighPre PCR Cleanup System（MagBio Genomics）对最终PCR产物进行纯化，并在Fragment Analyzer（Agilent）上进行分析。使用Qubit 4 Fluorometer（Life Technologies）对文库进行定量，混合后，在NextSeq仪器（Illumina）上进行测序。根据先前发表的modETV2协议，将人诱导多能干细胞（hiPSCs）分化为内皮细胞（hiECs）。分化后，将hiECs解离为单个细胞，并使用涂有抗人CD31抗体的磁珠（CD31 MicroBeads，Miltenyi Biotec）将细胞分选为CD31+和CD31−细胞。然后，将纯化的CD31+人诱导多能干细胞衍生的内皮细胞（h-iECs）在涂有附着因子溶液（Cell applications）的6孔板中扩增培养。h-iECs的培养基是通过在基础培养基（PromoCell）中加入内皮细胞生长因子培养基2试剂盒的补充物来制备的。对于免疫细胞化学分析，将hiECs接种于96孔板中，待细胞融合后用4%甲醛固定，然后用0.1% Triton X-100进行通透处理。样本在10%胎牛血清（FBS）中封闭1小时，然后在4 °C下与5% FBS中的Ve-Cadherin抗体（Cell Signaling Technologies，#D87F2，稀释比例1/400）或VWR抗体（Sigma-Aldrich，#HPA001815，稀释比例1/100）孵育过夜。用PBS洗涤后，细胞在5% FBS中与1/1000稀释的驴抗兔Alexa Fluor 488（ThermoFisher，#A21206）或1/400稀释的Phalloidin 647 Plus（ThermoFisher，#A30107）孵育。用0.5 µg/ml的DAPI对细胞核进行染色。使用Yokogawa CV7000S共聚焦显微镜对染色后的细胞进行分析。CCM2敲除的单细胞iPS克隆的批量RNA-seq按照制造商的说明，使用Agencourt RNAdvance Cell试剂盒（Beckman Coulter）从50000–100000个细胞中提取总RNA，并在Fragment Analyzer 5300系统（Agilent）上分析RNA的质量和数量。使用KAPA mRNA HyperPrep Kit（Roche）制备RNA-seq文库，输入50 ng总RNA，然后在NovaSeq6000（Illumina）仪器上以51 bp的配对末端设置进行测序，每个样本的平均测序深度为3800万个簇。CCM2敲除iPSC衍生的内皮细胞RNA-seq数据处理与分析使用FastQC（v0.11.7）、Qualimap（v2.2.2c）和SAMtools stats（v1.9）对文库进行评估。使用STAR（版本2.7.2b）与人类基因组（GRCh38，Ensembl v100）进行比对来完成序列比对。使用Qualimap（v2.2.2c）获得测序质量控制指标，并使用MultiQC（v1.9）进行总结。使用NGmerge（v0.3）进行接头修剪。生成了包含Ensembl v100中cDNA和ncRNA条目的人类转录组索引，并使用Salmon（v1.1.0）获得基因丰度。生物信息学工作流程使用Nextflow工作流程管理系统（v20.10）和Bioconda软件管理工具进行组织。对于差异基因表达分析，我们使用R（v4.0.2）中的DESeq2（v1.26.0）进行分析，并采用“ashr”进行倍数变化收缩，同时使用Wald检验进行成对比较。基因集富集分析是使用FGSEA（v1.16.0）（BioRxiv: https://doi.org/10.1101/060012）进行的，它基于基因本体论生物通路集合（MSigDB集合v7.5.1中的C5_BP）和Reactome（MSigDB集合v7.5.1中的C2_CP:REACTOME）。CCM2敲除iPS细胞的CUT&RUN数据处理与分析使用Trimmomatic（v0.39）修剪接头序列，并从读取末端去除低质量读取。此外，还运行了kseq（v20190822），以去除可能在Trimmomatic处理中遗漏的额外条形码序列。使用Bowtie2（v2.4.2）和参数“--very-sensitive-local”将修剪后的读取与人类基因组（GRCH38，Gencode v31）进行比对，该参数可将多重映射的读取分配给其最佳比对位置，同时使用“--dovetail”参数允许比对彼此延伸的配对读取。读取的数据还使用Bowtie2与额外的参数“--no-overlap”和“--no-dovetail”与掺入的大肠杆菌基因组（K12-MG1655）进行比对。使用SAMtools（v0.8.1）对比对后的读取进行过滤，设置最小质量分数为0。掺入标准化按照中概述的程序进行。简而言之，基于相应掺入的深度为每个样本计算一个比例因子，并使用Bedtools的“genomecov”（v2.30.0）对目标bam文件进行比例缩放，并输出一个bedgraph文件。为了进行基因组浏览器可视化，使用了ucsc的“bedGraphToBigWig”（v377）。对于峰值检测，使用macs2的“callpeak”（v2.2.7.1），并使用HOMER的“mergePeaks”（v4.11）合并样本间的重叠峰值。原始读取数据的质量使用FastQC（版本0.11.9）（https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）进行评估。比对指标使用picard（v2.25.0）（https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/articles/360040507751-CollectAlignmentSummaryMetrics-Picard-）和SAMtools（v1.10）进行评估，并通过preseq（v3.1.2）（http://smithlabresearch.org/software/preseq/）、deeptools（v3.5.0）和Phantompeakqualtools（v1.2.2）生成结合富集质量指标。质量指标使用MultiQC（v1.10.1）进行总结。使用DiffBind（v3.4.3）识别差异结合的峰值，并使用clusterProfiler（v4.2.0）针对带有org.Hs.erg.db（v3.14.0）注释的基因本体论生物通路进行过表达基因集分析。数据处理使用Snakemake（v5.26.1）进行管理。我们通过材料转让协议从“治愈脑动静脉畸形联盟”（Alliance to Cure Cavernous Malformation）的CCM生物样本库获得了来自家族性脑动静脉畸形（CCM）患者的石蜡包埋组织活检样本。这些患者已同意将其活检样本用于研究。样本的收集和使用已经瑞典伦理审查局（EPM；批准号：2019-04715和2019-06374）批准。瑞典的伦理机构遵循《赫尔辛基宣言》（2013年）和美国卫生与公共服务部《贝尔蒙特报告》（Belmont Report）的规定。免疫组织化学染色采用全自动协议（DAKO Autostainer Link48）和DAKO的高pH检测试剂盒Envision FLEX（#K8000）进行。使用了以下抗体：CBX7（Sigma-Aldrich，#HPA056480，稀释比例为1:200）和CD34（Dako，#IR632）。图像使用Axioscan Z.1（Zeiss）进行记录，并使用Fiji进行处理。本项目中涉及小鼠的所有操作均按照IFOM ETS（欧洲肿瘤研究所分子肿瘤学研究所）的动物饲养和使用机构委员会（IACUC）的规定进行，并符合《实验动物护理原则》（Directive 86/609/EEC）中制定的指导方针，且已获得意大利卫生部批准。小鼠饲养于标准条件下，可自由摄取常规饲料。本项目实验使用了Cdh5(PAC)-Cre-ERT2/CCM3flox/flox小鼠，这些小鼠品系（在此称为CCM3iECKO）是通过CCM3flox/flox小鼠与血管内皮钙粘蛋白-Cre-ERT2（Cdh5(PAC)-Cre-ERT2）小鼠杂交得到的。这些小鼠表达与人雌激素受体突变体（ERT2）融合的Cre重组酶。ERT2在低水平他莫昔芬作用下被激活，但不受内源性雌激素影响。该融合蛋白在血管内皮钙粘蛋白（Cdh5）启动子下表达，因此仅在内皮细胞中表达。注射他莫昔芬[或其活性代谢产物4-羟基他莫昔芬（4-OHT）]后，融合蛋白Cre-重组酶-ERT2从热休克蛋白（Hsp）中释放并转移到细胞核中，此时Cre重组酶在loxP位点发挥作用。在出生后第8天（P8）收集野生型和CCM3iECKO小鼠的大脑。小鼠的性别随机保持，雌雄比例为1:1。CCM3iECKO小鼠经他莫昔芬（Sigma-Aldrich）处理，以特异性诱导内皮细胞中floxed基因的重组。首先，将他莫昔芬溶解于预热至37–40°C的乙醇中，使其最终浓度为100 mg/mL。然后，缓慢加入预热后的玉米油，使其最终浓度为10 mg/mL。将他莫昔芬（10 mg/mL）分装，并在-20°C下避光保存。注射当天，将一份他莫昔芬用玉米油稀释至最终浓度为2 mg/mL，并在出生后第1天（P1）通过胃内注射的方式，向每只小鼠注射50 mL该溶液。为进行基因型鉴定而准备DNA时，需将小鼠的尾巴或指尖在裂解缓冲液（含10% Gittschier缓冲液、TX-100、0.5 mg/ml 蛋白酶K和水）中于56°C下振荡消化过夜。消化后的组织在95°C下加热5分钟，然后进行基因型鉴定。用于小鼠基因型鉴定的引物列于表EV1中。从他莫昔芬注射后的第二天开始，Cre阳性的CCM3iECKO小鼠每天接受一次MS37452（2 mg/g体重）的胃内注射。药物首先溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，然后用50 mL玉米油稀释。对照组小鼠接受相同量的DMSO处理，DMSO同样溶解于50 mL玉米油中。在出生后第8天（P8）收集CCM3iECKO小鼠的大脑，并在4°C下用4%多聚甲醛（PFA；Sigma-Aldrich）固定过夜。固定后的大脑组织被包埋在4%低熔点琼脂糖中，并使用振动切片机（1000 Plus，The Vibratome Company，美国密苏里州圣路易斯市）沿矢状轴切成100微米的切片。脑切片作为漂浮样本在6孔或12孔板中进行染色。非特异性结合位点的封闭在室温（RT）下用含有0.3% Triton X-100、5%驴血清和1%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS）中进行1小时。样本在4°C下与用于封闭的相同溶液中稀释的一抗孵育过夜。在与二抗在室温下用含有0.3% Triton X-100和1% BSA的PBS孵育4小时之前，用含有0.1% Triton X-100的PBS进行多次洗涤。二抗孵育后，再用PBS洗涤，然后在室温下用4% PFA进行后固定5分钟。后固定步骤后再用PBS 1X进行洗涤。脑切片用含有4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的Vibrant Vectashield进行封片。对于小鼠大脑，血管使用生物素化的Isolectin B4（Vector Laboratories，#B-1205，稀释比例为1/200）进行染色，然后再用与Alexa Fluor 647偶联的链霉亲和素（Invitrogen，S#21374，稀释比例为1/400）进行染色。使用了以下二抗（由驴或山羊产生，针对相应的物种），并与Alexa Fluor 488或647偶联（Jackson Laboratories，#AB_2340846;#AB_2338902，稀释比例为1/400）。为了对病变进行定量，准备了100微米厚的振动切片脑组织，并用生物素化的Isolectin B4进行染色。对于每个大脑，至少切割了五个小脑矢状切片，并使用共聚焦显微镜SP8 DLS（Leica）的10倍物镜获取z轴堆叠图像。随后按照之前描述的方法对病变进行定量。对于后续分析，量化了病变的数量和总面积。然后，根据设定的5000平方微米的临界值，将病变分为小病变和大病变。统计分析使用GraphPad Prism 5进行。每个实验所用的统计检验方法和p值计算方法在图例中说明。所有给出的p值均为双侧，显著性定义为p<0.05。激光捕获人手术切除的脑动静脉畸形（CCM）病变和正常脑毛细血管10例人手术切除的脑动静脉畸形（CCM）病变（6例为散发性/孤立性，4例为家族性/多发性）被包埋在最佳切割温度（OCT）化合物中，快速冷冻，并储存在-80°C。3例无神经系统疾病患者的正常脑组织在尸检时取样，用福尔马林固定，并包埋在石蜡块中（FFPE）。将5微米的脑组织切片首先放置在Leica玻片上（Leica Biosystems Inc.，美国伊利诺伊州巴法络格罗夫），并用HistoGene（Applied Biosystems，美国加利福尼亚州）或Paradise染色剂（Applied Biosystems）对FFPE组织进行染色。然后，使用Leica LMD 6500激光捕获显微切割系统（Leica Biosystems，德国韦茨拉尔）在40倍放大率下收集来自CCM和正常脑毛细血管的内皮层（包括相邻的管腔和管腔外元素），并储存在-80°C。RNA的提取使用了RNA分离试剂盒（RNeasy® Micro Kit，Qiagen，德国希尔登）。使用商业化的低投入链特异性RNA-Seq试剂盒（Clontech，美国加利福尼亚州）生成cDNA文库，并在Illumina HiSeq4000平台上使用单端50碱基对（bp）读取进行测序。原始测序读取的质量通过FastQC v0.11.2进行评估（网址：http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）。使用RSeQC和Picard工具v1.117评估比对后的质量控制。读取数据使用STAR映射到GENCODE人类基因组模型（GRCh38 V28）。使用DESeq2识别差异表达基因，在需要时使用加性模型校正批次效应。原文地址：https://www.embopress.org/doi/full/10.1038/s44321-024-00152-9
注：因文章篇幅有限，所有相关引用文献，以及补充素材可以点击至原文查阅。
