【文献解读】功能检测揭示的血小板衍生细胞外囊泡的免疫调节作用
文摘
科学
2024-09-30 17:00
江苏
![]()
![]()
文献：Palviainen M, Puutio J, Østergaard RH, Eble JA, Maaninka K, Butt U, Ndika J, Kari OK, Kamali-Moghaddam M, Kjaer-Sorensen K, Oxvig C, Aransay AM, Falcon-Perez JM, Federico A, Greco D, Laitinen S, Hayashi Y, Siljander PR. Beyond basic characterization and omics: Immunomodulatory roles of platelet-derived extracellular vesicles unveiled by functional testing. J Extracell Vesicles. 2024 Oct;13(10):e12513. doi: 10.1002/jev2.12513. PMID: 39330919; PMCID: PMC11428872.杂志：Journal of Extracellular Vesicles影响因子：15.5
血小板以其在止血和血栓形成中的作用而闻名，越来越多的研究也认识到其在先天免疫、免疫血栓形成和炎症疾病中的贡献。血小板表达多种受体，使其能够达到不同的激活终点，并赋予其免疫调节功能。激活的血小板释放细胞外囊泡（PEVs），其形成和分子载荷被证明依赖于受体介导的激活和环境信号。本研究比较了通过不同受体激活血小板所生成的PEVs的免疫调节特征，包括糖蛋白VI（GPVI）、C型凝集素样受体2（CLEC-2）及结合所有凝血酶-胶原受体的激活。通过在斑马鱼体内和人类巨噬细胞体外的功能实验，揭示了不同PEV类型所触发的独特归巢和分泌反应。相比之下，针对蛋白质和miRNA载荷的组学分析结合物理化学粒子特征，仅发现激活PEV类型之间存在微小差异，这些差异不足以预测其不同的免疫调节功能。值得注意的是，在没有外源激活剂的情况下形成的自主释放PEVs（US PEVs）表现出与受体诱导的PEVs截然不同的免疫调节特征。我们的研究结果强调，PEVs可以通过受体介导的激活进行调节。为了真正理解其在介导血小板功能与免疫细胞之间的作用，开展功能实验是至关重要的。 ![]()
血小板是源自巨核细胞的无核细胞，展现出分子成分和功能特征的异质性。它们在质膜上表达受体，使其能够通过多样的信号依赖性激活终点实现从粘附到血栓形成及促凝转化等多种功能。血小板还在免疫血栓形成和免疫介导的炎症疾病中发挥重要作用。激活后，血小板释放多种可溶性生物活性分子和血小板衍生细胞外囊泡（PEVs）。研究表明，血小板在不同生物合成途径下形成囊泡的能力极具可调性，其PEVs的分子载荷，如其蛋白组、miRNAs及细胞质细胞器（如线粒体）的内容物，均可能因受体介导的激活或细胞环境而异，例如，取决于循环中的剪切条件。早期对激活血小板的电子显微镜（EM）分析描述了两种PEVs的群体：微囊泡和外泌体。后续的PEVs电子显微镜分析揭示了几种形态学类别，包括球形囊泡、管状囊泡和大小范围在50–1000纳米之间的大型血小板碎片，这表明血小板能够生成异质性的EV亚群。然而，这些不同PEV组（即所有血小板EV）的功能性仍然不甚清楚。含有血小板和巨核细胞特异性整合素亚单位CD41（与CD61结合）的EV大约占所有循环EV的30%–52%，具体取决于所用的分析方法。虽然其中一些EV可能来源于巨核细胞，但循环PEVs的升高水平与具有免疫介导炎症机制的病理状态相关，如脓毒症、自身免疫疾病（如狼疮、类风湿性关节炎）、心血管疾病和癌症。在生理功能方面，PEVs在凝血及招募和协调先天免疫细胞“归巢”到血管损伤/感染部位方面的作用已被明确，而它们在协调适应性免疫细胞功能方面的作用则较少被探索。我们假设，血小板在不同生理和病理免疫相关功能中具有相关性，因此必须能够调控其PEV的释放，以匹配激活信号。这使得血小板在EV生产方面表现出极大的灵活性，而这些PEVs则以优雅的方式进一步传播免疫调节作用。因此，我们探索了通过靶向含有免疫受体酪氨酸激活基序（ITAM）的两个免疫受体——糖蛋白VI（GPVI）和C型凝集素样受体2（CLEC-2）来选择性调节PEV释放的可能性。这两个受体共享相同的下游信号通路，但在体内的参与方式不同。在炎症疾病方面，GPVI是PEV形成的主调节因子，例如在小鼠类风湿性关节炎模型中，并且目前是急性缺血性卒中、动脉粥样硬化和癌症的新药靶点。GPVI通过胶原蛋白和纤维蛋白/纤维蛋白原在血栓中被激活。相反，CLEC-2是对病毒（如登革热病毒和人类免疫缺陷病毒-1）的受体，也可以通过与肿瘤相关的podoplanin激活，这与黑色素瘤等癌症相关。重要的是，这两个ITAM受体共享信号通路，这些通路对于许多免疫细胞（包括髓系、浆细胞树突状细胞、B细胞和T细胞）中的关键免疫受体也是共通的。因此，探讨GPVI和CLEC-2激活形成的PEVs的共同或不同特性，对于免疫相关的炎症功能具有广泛的意义。在本研究中，我们使用了以下特定的受体激动剂：通过胶原相关肽（CRP-XL）诱导GPVI PEVs，通过蛇毒毒素rhodocytin诱导CLEC-2 PEVs。作为公认的PEV诱导剂，我们采用了凝血酶和胶原共同激活以激活所有血小板的凝血酶和胶原受体（TC PEVs），生成与心血管病理和血管损伤相关的信号。为进行比较，我们还从未刺激的血小板中分离了PEVs（US PEVs）。为评估不同诱导PEVs的免疫调节作用，我们采用了两个模型系统。首先，我们测试了通过静脉（IV）注射的PEVs在循环中如何归巢于巨噬细胞，使用斑马鱼胚胎模型研究脊椎动物的网状内皮系统。接着，我们在体外人类巨噬细胞（PMA分化的THP-1细胞）模型中探索四种PEV类型之间的差异。然后，我们采用先进的EV特征化方法，包括纳米粒子追踪分析（NTA）、微流体电阻脉冲传感（MRPS）、单颗粒干涉反射成像传感（SP-IRIS）和电子显微镜（EM）对四种PEV类型进行物理化学特征分析。最后，我们比较了蛋白组和miRNA载荷特征，以识别可能定义四种PEV类型免疫调节能力的分子特征。令人惊讶的是，无论是常规的EV特征化还是成分分析都无法预测本研究中观察到的PEV的免疫调节特性。因此，我们的研究强调了功能测试在超越物理化学特征和组学分析方面的重要性。血小板如何调节EVs以实现免疫调节功能
我们利用受体特异性激动剂研究了血小板如何调节外泌体（EVs）以实现免疫功能。比较了两个免疫受体GPVI和CLEC-2的激活情况，这两者在血小板中的下游信号传导与白血球中的免疫受体相似。GPVI受体用CRP-XL激活（GPVI PEVs），而CLEC-2受体则用红色素（rhodocytin）激活（CLEC-2 PEVs）。同时，使用共同刺激物激活了血栓素和胶原蛋白受体（TC PEVs）。此外，我们还从未刺激的血小板中分离了未添加外源激活剂的外泌体（US PEVs）。在仔细去除激活或假处理后残留的血小板后，使用碘克沙醇缓冲超离心法分离PEVs，获得异质的外泌体亚群混合物。血小板的分离、激活和PEV的分离工作流程详见图S1，激动剂对血小板激活的比较数据见图S2。我们首先利用斑马鱼模型探讨了PEVs如何在血液中循环并与细胞相互作用。为了进行活体成像，向2天龄的转基因胚胎进行静脉注射了CellTraceTM Far Red标记的PEVs。转基因Tg(mpeg1:mCherry)gl23在所有胚胎巨噬细胞中驱动荧光报告蛋白mCherry的持续表达，从而通过两个荧光标记物的细胞内共定位来指示PEVs在巨噬细胞中的积累。初步筛选发现，四种PEV类型中只有GPVI和TC PEVs的浓度足以进行定量图像分析。因此，考虑到TC是一种公认的PEV诱导剂，并且涉及GPVI激活，我们将重点放在TC PEVs上，以探讨巨噬细胞是否选择性摄取PEVs。约105–106个颗粒（每次注射，按NTA估算）通过回心静脉微注入到全身循环中。PEV的积累仅在尾静脉（CV）和尾静脉丛（CVP）中观察到，后者代表了网状内皮系统（图1a，展示了感兴趣组织的明场图像）。在0.5小时后，PEVs已开始聚集在血液居住的巨噬细胞中，这一模式持续了6小时（图1b，视频1）。图像分析支持PEVs主要积累在巨噬细胞中，达到总封闭的约70%，而观察到的巨噬细胞数量随时间变化无显著变化（图1c,d）。GPVI PEVs也显示出相同的趋向模式（图S3，视频2）。从3分钟的时间序列中可以看到单个巨噬细胞与TC PEVs的相互作用，其中一些PEVs在空间和时间上明显与巨噬细胞的报告基因共定位（图1e）。值得注意的是，注射的PEVs在循环中很少被检测到，表明它们迅速从血液中被封闭。为了进一步研究巨噬细胞靶向PEVs的功能角色，我们追踪了肿瘤坏死因子α基因（tnfa）的转录激活，使用双转基因组合Tg(mpeg1:mCherry)gl23和Tg(tnfa:EGFP-F)ump5。TC PEV注射后3小时内，巨噬细胞开始诱导tnfa，表明它们朝向促炎表型极化（图1f，视频3）。![]()
为了进一步阐明血小板衍生的囊泡（PEVs）对巨噬细胞的免疫调节作用，我们用佛波酯（PMA）将人类THP-1细胞分化为巨噬细胞，用PEVs孵育这些细胞，并在两个时间点比较巨噬细胞的细胞因子分泌谱（图2a）。巨噬细胞用先前用原代人巨噬细胞优化过的PEVs剂量进行激活。分析中纳入了检测范围内浓度（至少一种PEV类型的所有生物重复样本中）的蛋白质，其中16种细胞因子中的34种被用于统计分析其显著性（表S2）。用不同类型的PEVs处理巨噬细胞后，在6小时和24小时均诱导出不同的分泌谱，这些分泌谱与在无PEVs条件下培养的巨噬细胞的对照分泌谱不同（图2b）。值得注意的是，与其他类型的PEVs相比，用CLEC-2 PEVs处理的巨噬细胞的分泌谱在6小时时间点就已显示出差异（图2b）。虽然GPVI、凝血酶受体（TC）和超声处理（US）PEVs诱导的分泌谱在6小时时就已经与未处理的巨噬细胞的分泌谱不同，但这些PEVs类型之间的不同特征在24小时时更为明显，TC PEVs诱导的分泌谱与GPVI和US PEVs诱导的分泌谱分离。这些数据表明，CLEC-2和GPVI PEVs诱导的动力学和特征曲线既彼此不同，也与TC PEVs的不同。![]()
图2 不同PEV类型引起的巨噬细胞细胞因子分泌谱的变化进一步比较来自激活血小板的PEVs（GPVI、CLEC-2和TC）与US PEVs诱导的分泌谱，发现细胞因子发生了统计学上显著的定量变化。在6小时时间点，16种细胞因子中有5种（图2c），在24小时时间点，16种中有11种（图2d）在用GPVI、CLEC-2或TC PEVs处理后与US PEVs诱导的细胞因子相比差异分泌。在6小时时，TC PEVs下调了五种巨噬细胞细胞因子（IP-10、IL-10、TNFα、IL-6和IL-1β），而与用US PEVs处理的巨噬细胞相比，CLEC-2 PEVs（GPVI PEVs仅轻微上调，IL-1β除外）上调了这些细胞因子（图2c）。在24小时时间点，这种趋势在更多细胞因子中持续，与用US PEVs处理相比，TC PEVs下调了10种细胞因子（SDF-1α、MIP-1β、MCP-1α、IP-10、eotaxin、IL-1α、IL-10、TNFα、IL-6和IL-1β）。有趣的是，在24小时时间点，与用US PEVs处理诱导的IL-7水平相比，来自GPVI-、CLEC-2-和TC-激活血小板的所有PEVs均上调了巨噬细胞中的IL-7，IL-7是淋巴样前体细胞的增殖细胞因子（图2d）。值得注意的是，与未处理的巨噬细胞相比，所有类型的PEVs均诱导了TNFα的分泌，这支持了体内观察，即循环PEVs可诱导斑马鱼胚胎巨噬细胞中的tnfa。为了总结分泌谱的结果，CLEC-2和TC PEVs明显诱导了不同的巨噬细胞细胞因子特征谱。这些特征谱也与GPVI诱导的分泌谱不同，而后者出乎意料地与US PEVs诱导的分泌谱相似。由于无法对所有类型的PEVs进行体内巨噬细胞摄取的定量，我们接下来想确保在THP-1细胞中观察到的功能差异不是由摄取量的不同引起的。我们通过高内涵成像在12小时内的四个时间点研究了PEVs（细胞质/膜）的摄取和细胞定位。用先前通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）优化的数量的CellTrace™ Far Red标记的PEVs（2.5 × 109颗粒/孔）与PMA分化的THP-1细胞孵育。高内涵成像数据证实，与模拟对照相比，所有四种PEV类型在12小时内均累积到细胞质中（图S4）。与US PEVs相比，观察到激动剂诱导的PEVs摄取量增加的趋势，尽管差异没有统计学意义（图S4a）。这支持了以下观点：THP-1细胞分泌谱中PEV诱导的功能差异（图2b-d）不是由不同的摄取动力学引起的。通过基本的EV特性表征，可以检测到不同诱导的PEVs之间只有很少的差异为了确定它们功能差异的原因，我们使用常用于表征EV的物理化学方法对四种PEV类型进行了分析。电子显微镜（EM）显示，PEV类型之间没有明显的形态差异（图S5a）。接下来，我们使用三种正交单颗粒方法对PEV的颗粒浓度、尺寸分布和表面标志物进行了表征（图S5b–c）。PEV诱导条件之间最大的差异是产量。在2.5 × 108个血小板/mL的条件下，糖蛋白VI（GPVI）激活诱导的颗粒产量最高（1.9 × 109），其次是凝血酶受体（TC）激活（1.7 × 109）和C型凝集素样受体2（CLEC-2）激活（4.1 × 108），当使用纳米颗粒追踪分析（NTA）测量时，这些产量均超过了未刺激血小板的颗粒数量（2.1 × 108）（图S5b）。使用电阻脉冲传感（MRPS）也检测到了相同的效力顺序，但差异较小（图S5b）。值得注意的是，GPVI和TC激活的产量相似，但尽管GPVI和CLEC-2信号通路存在重叠，CLEC-2再次被证明是比GPVI效率更低的激活剂。根据颗粒计数的较大标准差判断，供体在产生PEV方面的反应也存在显著差异（图S5b）。最后，在高灵敏度流式细胞术中对血小板激活样本进行直接分析（无需分离PEV）时，使用抗人CD61或抗人CD62P标记也观察到了相同的效力顺序（图S2d）。接下来，我们探讨了激活途径是否影响PEV的尺寸分布。使用NTA分析了70–1000 nm范围内的颗粒，使用MRPS分析了50–250 nm范围内的颗粒，并使用单颗粒干涉反射成像传感（SP-IRIS）确定了50–200 nm范围内的CD41阳性颗粒（图S5c）。将颗粒分类到不同的区间并进行量化。平均直径和众数直径（nm ± SD）总结在图S5的表格中。正交颗粒分析表明，无论使用哪种激动剂进行血小板激活，最终都无法在尺寸分布特征中观察到显著差异。仅当使用NTA和SP-IRIS（捕获CD41的PEV）分析时，与其他样本相比，TC诱导的样本中的平均颗粒直径略大，但这一观察结果并未被MRPS复制。接下来，我们使用SP-IRIS检查了亚群异质性。除了使用针对CD41的血小板特异性抗体外，还使用了针对三种常见EV四跨膜蛋白（CD9、CD63和CD81）的抗体来捕获PEV。使用CD9捕获的PEV数量最多（范围1.5 × 107个颗粒），而使用CD81捕获的数量最少（4.6 × 106个颗粒），CD63（范围6.2 × 107个颗粒）和CD41（范围8.1 × 107个颗粒）介于两者之间。对CD41捕获的PEV上四跨膜蛋白CD9、CD63和CD81的共定位进行分析（图S6a）显示，不同激活模式在CD9和CD9/CD63与CD41的共定位方面存在显著差异（图S6b）。与未刺激的PEV（US PEV）相比，GPVI、CLEC-2和TC PEV中CD41阳性PEV的CD9表达下调。相比之下，与US PEV相比，GPVI和CLEC-2 PEV中CD9/CD63双阳性PEV的表达上调。TC PEV中也存在相同趋势，但差异无统计学意义（采用双向方差分析，随后进行Tukey多重比较检验）。在所有PEV类型中，CD81与CD41的共表达均可忽略不计。综上所述，基本的EV颗粒表征仅揭示了颗粒产量方面的差异，尤其是GPVI和CLEC-2之间的差异。GPVI的效力与TC相当，而CLEC-2与未刺激的PEV相比，仅微弱地诱导了PEV的形成。未观察到尺寸分布或形态方面的差异。然而，所有激动剂诱导的PEV类型之间的四跨膜蛋白共定位特征相同（例如，CD63的外化），并且与未刺激的PEV的特征不同。通过蛋白质和miRNA组学分析对血小板胞外囊泡（PEVs）类型进行特征分析，仅发现细微的、主要是数量上的差异接下来，我们想要描绘PEVs的潜在分子特征，以解释巨噬细胞中观察到的功能差异。为了研究血小板根据受体依赖性调节PEVs分子货物的能力程度，我们进行了三项互补分析：蛋白质质谱分析、促炎蛋白的蛋白质表达分析（PEA）和miRNA测序。首先，我们使用质谱分析对PEVs的蛋白质含量进行了分析。从样品中共鉴定出250种蛋白质（表S3）。在这250种蛋白质中，有236种被转换为基因ID以供进一步研究。对所有蛋白质进行Reactome通路分析显示，除了预期的血小板相关通路（如R-HSA-114608、R-HAS-76005、R-HAS-76002）外，前15条富集通路中还包含了几条免疫系统相关通路（如补体级联R-HAS-166658、补体级联调节R-HAS-977606和先天免疫系统R-HAS-168249通路）（图3a）。基因本体论分析发现，多种蛋白质（YWHAE、VCP、C4BPA、ENO1、PARK7、CORO1A、HSP90B1、TUBA1B、TMSB4X、FLNA、YWHAG、PDIA3、HSPA8、HSP90AA1、ACTN1、MSN、NAP1L1、YWHAZ、PDIA4、PKM、ZYX、MYH9、CALR、P4HB、PFN1、ALDOA、PPIB、PPIA和HSPA1A）与蛋白质冠和RNA结合（GO:0003723）有关。将蛋白质组数据与ExoCarta和Vesiclepedia的前100种蛋白质列表进行比较，发现36种蛋白质与其中一个或两个数据库中的蛋白质共享（图3b）。这36种蛋白质是已知的EV膜蛋白（如CD9、CFL1和FLOT1），或胞质蛋白（如ALDOA和GAPDH），表明PEVs中富含典型的EV蛋白质。接下来，比较了GPVI、CLEC-2和TC PEVs的蛋白质丰度与未刺激（US）PEVs的蛋白质丰度。条形图（图3C）显示了与US PEVs中的蛋白质相比，GPVI、CLEC-2和TC PEVs中差异调节的蛋白质（表S5）。与US PEVs相比，在GPVI PEVs中，有54种蛋白质上调，101种下调。对于CLEC-2和TC PEVs，相应的数字分别为44和17，以及57和58。与US PEVs相比，GPVI、CLEC-2和TC PEVs中下调和上调的蛋白质数量用文氏图（图3d）表示，显示受体诱导的PEV类型之间的蛋白质组仅有微小差异。![]()
图3 使用质谱分析的PEVs受体诱导蛋白货物差异比较尽管本研究中的PEVs是从SEC分离的血小板中诱导而来的，但所鉴定出的大量蛋白质先前已被报道为EV分子冠的一部分。为进一步研究PEVs的分子冠蛋白质，将当前蛋白质组与两项先前的PEV蛋白质组研究中的蛋白质组进行了比较。文氏图显示了这些研究之间鉴定出的蛋白质的重叠情况（图S7），表S5列出了方法上的差异。对所有数据集或任意两个数据集之间的共享蛋白质进行了基因本体论（GO）富集分析。有趣的是，尽管方法上存在差异，但三项研究之间共享了78种蛋白质。GO富集分析的分子功能显示，大多数蛋白质功能与生物分子的结合有关（图S7）。本研究与Tóth等之间共享了48种蛋白质，而Aatonen等与Tóth等的研究之间共享了56种蛋白质。这104种蛋白质代表了生物分子结合和活性相关的GO功能类别。最后，在本研究与Aatonen等的研究（其中血小板也用激动剂激活）之间共享的蛋白质组中，有27种蛋白质具有细胞因子功能和神经营养因子结合功能。体内和体外功能试验表明PEVs具有影响炎症相关事件的能力。由于蛋白质组数据也显示免疫和炎症相关蛋白质上调，我们进一步使用PEA炎症面板分析了PEV蛋白质。PEA允许对四种PEV类型之间的80种蛋白质进行定量比较。在排除NPX值低于测定LOD 50%的蛋白质后，剩余41种蛋白质用于定量比较（表S6）。火山图最清晰地显示了与US PEVs相比，GPVI PEVs（图4a）、CLEC-2 PEVs（图4b）和TC PEVs（图4c）中差异表达的炎症蛋白质。在GPVI PEVs中，有9种蛋白质上调，2种蛋白质下调，与US PEVs相比。在CLEC-2 PEVs中，8种蛋白质上调，11种下调；而在TC PEVs中，与US PEVs相比，8种蛋白质上调，2种下调。上调蛋白质的文氏图（图4d）显示，至少有两种PEV类型共享了7种蛋白质：CCL11、CXCL1、CXCL10、CXCL11、IL8（CXCL-8）、MCP4（CCL13）和成纤维细胞生长因子21（FGF21）（图4e）。下调蛋白质的文氏图（图4f）显示，腺苷脱氨酶（ADA）、尿激酶型纤溶酶原激活剂（uPA）和CD40（图4g）至少在两种PEV类型之间共享，而仅在GPVI、CLEC-2或TC PEVs中上调或下调的蛋白质如图S8所示。比较来自ITAM受体激活血小板的PEVs发现，细胞因子仅存在数量上的差异，其中CLEC-2 PEVs中的细胞因子大多下调，而GPVI PEVs的细胞因子谱则与TC PEVs相似。![]()
图4 通过PEA对炎症标志物靶点的定量分析揭示了PEV蛋白特有的受体依赖性调节鉴于PEVs中富含RNA结合蛋白，我们最终分析了PEVs的miRNA含量，以探究其不同功能可能的作用机制。我们对未刺激的血小板和四种PEV类型的miRNA进行了测序，结果显示所有样本中共表达了541种miRNA，未发现定性差异（表S7）。主成分分析（PCA）显示，miRNA表达谱能够将未刺激的血小板和PEVs区分开（图5a）。然而，与我们的假设相反，我们并未发现US、GPVI、CLEC-2或TC PEVs之间的miRNA存在差异。随后，我们使用DESeq2算法（Love等，2014）分析了每种PEV类型与血小板miRNA相比上调或下调的差异表达基因（DEGs）。与血小板相比，四种PEV类型中共有56个DEGs共享，而独特的DEGs分布如下：US PEVs中有10个，GPVI PEVs中有17个，CLEC-2 PEVs中有4个，TC PEVs中有12个（图5b）。接下来，我们根据这些DEGs的靶基因所影响的途径对它们进行了分析。所有PEV类型共享的DEGs影响的前10条途径包括：白细胞介素-4和白细胞介素-13信号传导（R-HSA-6785807）、白细胞介素信号传导（R-HSA-449147）、有丝分裂G1-G1/S期（R-HSA-453279）、G1期与细胞周期蛋白D相关的事件（R-HSA-69231）、G1期（R-HSA-69236）、细胞衰老（R-HSA-2559583）、Tp53介导的转录调控（R-HSA-3700989）、雌激素受体（ESR）介导的信号传导（R-HSA-8939211）、癌基因诱导的衰老（R-HSA-2559585）以及G1/S期转换（R-HSA-69206）（图5c）。最后，我们通过分析GPVI、CLEC-2和TC PEVs的miRNA与US PEVs的miRNA相比的上调和下调情况，对它们进行了比较。这一分析仅揭示了微小的数量差异：与US PEVs相比，CLEC-2 PEVs有3个miRNA上调和1个下调，GPVI PEVs有13个上调和9个下调，TC PEVs有11个上调和8个下调，其中只有少数是GPVI、CLEC-2或TC PEVs特有的（图5d，e）。这些数据表明，PEV的miRNA可能影响包括免疫调节在内的多种功能，但本研究中的miRNA特征并未允许我们识别出与产生PEV的信号相关的特定特征谱。![]()
图5 未刺激血小板与不同诱导的PEVs中miRNA含量的比较总结蛋白质和miRNA含量分析的结果，我们发现PEVs的组成可以通过血小板的激活来调节，且未刺激的PEVs（US PEVs）展现出其独特的分子特征。然而，受体激活的血小板来源的PEVs之间的大部分差异是数量上的，例如细胞因子浓度的差异。少数独特的定性差异并不足以预测不同PEV类型的特定功能特征。尽管可以通过不同的受体介导激活诱导血小板产生细胞外囊泡（EVs），但关于其免疫调节能力，目前所知甚少。体外研究已经强调了单核细胞和巨噬细胞作为PEV介导免疫调节的特别感兴趣的目标。然而，在体内以高时空分辨率可视化PEVs与细胞之间的动态相互作用在技术上具有挑战性。因此，我们使用最近建立的斑马鱼胚胎脊椎动物网状内皮系统模型来研究静脉注射（IV）的PEVs与通过循环可接触的细胞之间的相互作用。据我们所知，这是首次将人类PEVs注射到斑马鱼胚胎中的研究。体内成像显示，与其他细胞相比，尤其是吞噬性内皮细胞，巨噬细胞对PEVs的积累更为明显。我们认为这一点很有趣，因为之前有报道称，在斑马鱼胚胎中，静脉注射的EVs和合成纳米颗粒主要积累在吞噬性内皮细胞中。事实上，由我们和其他人筛选的一系列纳米颗粒几乎总是首先被这些细胞捕获，而巨噬细胞的贡献很小（静脉注射的70nm SiO2纳米颗粒总体捕获量中<20%）。在啮齿动物模型中，斑马鱼吞噬性内皮细胞的哺乳动物功能等价物——肝窦状隙内皮细胞可能在系统给药纳米颗粒的肝脏清除中比库普弗细胞（巨噬细胞）贡献更大，这证实了斑马鱼胚胎中吞噬性内皮细胞在纳米颗粒捕获中的主导作用。这似乎也适用于某些EVs，因为斑马鱼黑色素瘤EVs（静脉注射）和卵黄合胞体层EVs（体内分泌）与纳米颗粒具有相同的归巢模式。这使我们的发现与先前关于不同来源EVs的报告有所不同，暗示并非所有类型的EVs在循环中的行为都相同。我们认为这里可能涉及两种机制：一是如先前使用哺乳动物细胞模型在体外、离体和体内所报道的，巨噬细胞对PEVs的优先摄取；二是由于吞噬性内皮细胞快速酸化，PEVs在溶酶体中的降解可能更快，如先前对带有预先形成、荧光标记的蛋白质冠的纳米颗粒（在5分钟后pH值降至最低）所观察到的那样。此外，从3分钟后开始显示的PEVs从血流中快速清除（图1e）表明，在时间范围和剂量有限的情况下，巨噬细胞可能在PEV摄取方面优于吞噬性内皮细胞，而在PEV数量较高时，吞噬性内皮细胞可能作为从循环中清除EVs的更大“汇”。PEVs和其他细胞的清除动力学有待进一步的体内研究以及确定参与摄取的配体-受体对。然而，在这里我们清楚地证明了PEVs在体内以巨噬细胞为主要目标归巢，这支持了先前的人类细胞数据。斑马鱼模型的一个局限性是，与哺乳动物啮齿类模型相比，其与人类在进化上的距离更远，而后者甚至可以通过人源化来表达同源受体。然而，许多参与血栓形成和先天性免疫细胞相互作用的受体在斑马鱼和人类之间实际上是高度保守的，例如，作为人类血小板的功能等价物的血栓细胞能够表达主要血小板表面受体CD41（itga2b）并介导凝血。此外，大多数参与人类血小板-单核细胞相互作用（CD42b、CD61和P-选择素）的血小板外泌体（Platelet-derived extracellular vesicles，PEV）表面受体在斑马鱼中都有同源物，并且它们的相互作用伙伴（CD11b/CD18和PSGL-1；在斑马鱼中为itgam/itgb2和selplg）也在受精后2-3天的斑马鱼胚胎巨噬细胞中表达。同样，它们还表达TIM和TAM受体家族的成员，在人类中，这些受体已知能够识别血小板外泌体上的磷脂酰丝氨酸。尽管本研究没有探讨人类血小板外泌体与斑马鱼巨噬细胞之间相互作用的确切分子决定因素，但发现巨噬细胞表现出优先摄取血小板外泌体并随后极化为表达tnfa的表型，这为研究识别同源分子模式的保守机制提供了有趣的见解，并为未来使用斑马鱼模型进行血小板外泌体研究铺平了道路。体外巨噬细胞功能测定结果显示，这四种血小板外泌体（Platelet-derived extracellular vesicles，PEV）类型产生了不同的分泌组，这凸显了看似相似的血小板外泌体内微妙分子调节的重大影响。值得注意的是，无论是按照既定指南（如MISEV）进行的传统细胞外泌体（Extracellular vesicles，EV）表征，还是对蛋白质和miRNA的组学分析，均未得出能够预测不同血小板外泌体作用机制的独特特征谱。本研究的最初目的是比较血小板中的两种免疫受体酪氨酸活化基序（Immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）受体，即糖蛋白VI（Glycoprotein VI，GPVI）和C型凝集素样受体2（C-type lectin-like receptor 2，CLEC-2），它们共享下游信号通路，这些通路也类似于髓系、浆细胞样树突状细胞、B细胞和T细胞中的免疫受体信号。重要的是，GPVI和CLEC-2在循环中的结合发生在完全不同的病理生理条件下。根据我们的假设，如果血小板参与免疫调节，我们期望在通过GPVI和CLEC-2刺激血小板后发现不同的血小板外泌体组（PEVome）。事实上，巨噬细胞分泌组的功能差异和血小板外泌体产量的差异确实如此，因为与CLEC-2相比，GPVI诱导产生了更多的血小板外泌体（不出所料的是，与未刺激的血小板相比，通过任何受体刺激都会增加血小板外泌体的产量）。相比之下，根据细胞外泌体的幂律分布，血小板外泌体的大小分布是不变的，主要是较小的血小板外泌体（<100纳米）。然而，使用所使用的方法（纳米颗粒追踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis，NTA）、磁共振粒子筛选（Magnetic Resonance Particle Sizing，MRPS）或同步辐射相位衬度成像（Synchrotron radiation-based Phase-Contrast Imaging for soft matter，SP-IRIS）），我们不能排除使用不对称流场流分级（Asymmetric Flow Field-Flow Fractionation，AF4）等方法可以检测到<50纳米的血小板外泌体之间的差异。令人惊讶的是，GPVI和CLEC-2血小板外泌体之间的分子载物差异很小。尽管通过蛋白质印迹分析（Protein Expression Array，PEA）发现CLEC-2血小板外泌体中的细胞因子水平呈下降趋势（图4f、g和S7d），但这两种血小板外泌体类型之间并无统计学显著差异，与CLEC-2血小板外泌体相比，GPVI血小板外泌体中只有一种miRNA（hsa-miR-140-5p）显著上调。对于激活的血小板产生的不同血小板外泌体类型之间差异较小的原因，有几种解释。首先，本研究仅进行了蛋白质和miRNA分析，这些血小板外泌体的脂质组、代谢组或糖基特征可能存在显著差异。其次，鉴定数量，尤其是蛋白质组数据中的鉴定数量，可能解释了差异表达分子数量较少的原因。此外，更丰富的蛋白质或miRNA可能构成了“共同功能”的基础，而执行不同功能特征的任何“调节”分子可能由于表达水平较低而未被检测到。也有可能是CD41/61结合或自分泌信号（如ADP、TXA2）的二次激活掩盖了初始受体特异性的分子特征，这需要使用受体拮抗剂和信号抑制剂进行未来的研究。第三，未来的综合多组学分析可能会揭示更复杂的分子特征，尤其是在对单个细胞外泌体或细胞外泌体亚群进行分析时。在本研究中，我们故意选择将所有血小板外泌体亚群作为一个批次来研究其免疫调节作用的整体情况。最后，我们认为，体内血小板外泌体的功能可能涉及不同生物分子类型的多个受体和信号通路的结合以及它们数量的变化，这使得刺激过程更加复杂。无论如何，我们的数据强调了两个关键概念：（i）血小板通过调节血小板外泌体组来主动调节免疫细胞协调，以及（ii）仅分析血小板外泌体的分子内容和理化特性不足以定义其功能。因此，这些结果突出了细胞外泌体作为复杂信使的多方面作用，并质疑了仅限于单一组学或基本细胞外泌体特征的分析足以揭示作用机制或预测功能的观点。因此，我们主张在分子分析中采用更广阔的视角，并需要进行功能测定。有趣的是，在无外源性激活剂存在的情况下形成的未受刺激血小板外泌体（US PEVs）诱导了一种独特的巨噬细胞分泌组。此外，蛋白质组学分析显示，与激活的血小板产生的外泌体（PEVs）相比，未受刺激血小板外泌体（US PEVs）的分子成分存在显著差异（图3c、d，图4）。未受刺激血小板外泌体（US PEVs）中12种蛋白质的水平较高（与GPVI、CLEC-2或凝血酶激活的血小板外泌体[TC PEVs]相比），其中9种是循环细胞外囊泡（EVs）生物分子晕的已知成分（A2M、APOA1、APOA4、APOB、APOE、HBB、HPX、ORM1、SERPINA3），其余3种是血小板膜蛋白（CD36、FLOT1、FLOT2）。这表明未受刺激血小板外泌体（US PEVs）来源于血小板质膜，而TC和GPVI诱导的血小板外泌体与未受刺激血小板外泌体（US PEVs）相比丢失了101种蛋白质（包括免疫球蛋白、补体成分和热休克蛋白），这些丢失的蛋白质都是生物分子晕的已知成分且来源于质膜，这进一步支持了上述结论。未受刺激血小板外泌体（US PEVs）来源于质膜的观点也得到了四跨膜蛋白共定位特征的支持：与未受刺激血小板外泌体（US PEVs）相比，受体介导的血小板激活降低了CD41+/CD9+ PEVs的比例，增加了三重阳性CD41+/CD9+/CD63+ PEVs的比例。我们的发现得到了先前研究的证实，该研究表明血浆中双阳性CD41+/CD9+ EVs增加，血清中三重阳性CD41+/CD9+/CD63+ EVs增加（凝血激活血小板，在血清中产生的血小板EVs多于血浆）。虽然我们不能完全排除在血小板处理过程中（例如自分泌ADP释放）意外刺激的可能性，但我们的数据并未显示血小板激活，并且为了降低因老化、凋亡或坏死而产生PEVs的可能性，我们故意缩短了诱导PEVs的激活时间（30分钟）。支持PEVs持续释放的观点的先前研究表明，在兔循环中释放了放射性标记的血小板膜，以及体外和体外（血小板浓缩物中）随时间产生PEVs，且持续数天。因此，我们提出，血小板与其他细胞一样，也会持续向细胞外环境释放少量EVs。这些PEVs可能以旁分泌的方式发挥稳态作用，因此不易在循环中检测到。EVs的稳态形成是EV领域的一个新兴概念。近年来，人们对EV异质性以及具有不同生物遗传起源的各种亚群存在的认识呈爆炸式增长。然而，关于不同激活途径对同一细胞类型EV组（EVome）影响的系统性比较仍然很少。血小板是研究不同信号通路对EV组影响的绝佳细胞模型。因此，在免疫系统背景下探索血小板EV组（PEVome）的可调性，对于将血小板EVs调整为特定特征的可能性具有重要意义，这将对开发具有固有治疗能力的药物递送系统或高级分子治疗产品（AMTPs）产生浓厚兴趣。此外，尽管人们对血小板EVs作为诊断生物标志物的兴趣浓厚，但仍需要更深入地了解血小板EV组的变异及其与诱导血小板EVs的信号之间的关系，无论该信号是通过CLEC-2介导的病毒性信号、通过凝血酶和胶原受体介导的血栓性信号，还是仅通过GPVI介导的信号。我们的研究结果表明，无论是通过不同的受体激活，还是在无外部刺激的情况下持续存在，体外均可释放经过调整的血小板EVs。要了解这些血小板EVs的功能性免疫调节作用及其作用机制，仅仅进行理化特性比较或组学方法分析是不够的。相反，我们提出，开发灵敏的功能性测定方法能够揭示血小板EV组之间即使存在细微差异也能发挥的免疫调节作用。血小板源性细胞外囊泡的诱导与分离
工作流程如图S1所示。标准去白细胞血小板浓缩液由芬兰红十字会血液服务中心（赫尔辛基，芬兰）提供，每份均来自四名ABO RhD配型相符的全血捐赠者的血浆层，并遵循芬兰福利与健康监督局（Valvira，赫尔辛基，芬兰）的匿名处理规定。血小板浓缩液在采集后24小时内制备，并在到达后立即通过尺寸排阻色谱法（SEC）分离出血小板。使用贝克曼库尔特T-540血液分析仪（贝克曼库尔特，美国）测量血小板浓度，并用添加了1mM MgCl2、2mM CaCl2和3mM KCl（生理阳离子水平）的Tyrode's-HEPES缓冲液调整至2.5×108mL-1，以匹配血浆中平均生理血小板浓度。血小板通过以下方式激活30分钟，温度为37°C，且在不搅拌的条件下进行：（i）加入2µg/mL胶原（HORM，武田制药，日本）和0.2 U/mL凝血酶（Enzyme Research Laboratories，英国）（TC）；（ii）加入10µg/mL CRP-XL（CambColl Laboratories，英国）（GPVI）；或（iii）加入100 nM rhodocytin（CLEC-2）。未添加任何激动剂的血小板以相同方式处理，以获得未刺激血小板释放的血小板源性细胞外囊泡（PEVs）。为监测激活程度，使用高灵敏度流式细胞术测定血小板浓度、血小板和PEVs表面P-选择素（CD62P）的变化，以及血小板活化CD41/CD61（PAC1）的变化（图S2c）。通过测量CD61+ PEVs的时间曲线（15、30、60和180分钟）来优化比较研究中PEVs生成的激活时间，以确保所有激动剂均有充分反应，并选择30分钟时间点进行后续实验（图S2d）。激活后，血小板在室温（RT）下以2500×g离心15分钟，然后将上清液转移至新管中，再次在室温下以2500×g离心15分钟，以确保去除血小板残留物。使用血液分析仪验证无残留血小板后，直接分析上清液或用于EV分离。对于PEV分离，将上清液覆盖在3毫升60%碘克沙醇垫层上，然后以100,000×g（SW28Ti转子，贝克曼库尔特）离心3小时，之后收集碘克沙醇垫层上方的部分，并用10毫升DPBS重悬，通过0.1µm过滤装置（Millex VV，Millipore）去除任何残留的碘克沙醇。然后，使用10kDa截留超滤装置（Amicon Ultra-15离心过滤装置，Millipore）将PEVs浓缩至100µL体积。单次使用分装后，在-80°C下保存，并在分离后3个月内使用。以这种方式分离的PEVs包含异质亚群，包括但不限于微粒和外泌体。取20微升血小板激活后的上清液，在暗处、室温下与2.5微升藻红蛋白（PE）标记的小鼠抗人CD62P抗体（克隆号AK-2，BD Biosciences）、2.5微升PE标记的CD61抗体（克隆号VI-PL2，BD Biosciences）或2.5微升异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗人CD41/CD61抗体（克隆号PAC-1，BioLegend）孵育2小时。使用同型匹配的阴性对照（即与相同浓度的鼠PE标记IgG1或FITC标记IgM孵育的样本）和未标记的EVs分别排除抗体的非特异性结合和背景信号。孵育后，将样本用含有140mM NaCl、pH 7.2的10mM Hepes缓冲液（NH缓冲液）稀释1:10，并通过0.1µm过滤装置过滤。所有样本均在Apogee A50-Micro流式细胞仪（Apogee Flow Systems Ltd.，英国）上以1.5µL/min的流速进行分析。使用Apogee微珠混合物（Apogee Flow Systems Ltd.，英国）通过测量110nm FITC标记的磷脂酰丝氨酸（PS）微珠的浓度，并将其与制造商提供的参考值进行比较，来校准流速。每个样本测量90秒，触发波长为405nm（侧向散射）。数据使用FlowJo（v10.7.1；FlowJo）进行分析。使用Rosetta校准系统（Exometry，荷兰）校准光散射信号，并将其与粒子直径相关联。根据校准结果，为PEVs（200–1000nm）、细胞残留物（1000–2000nm）和血小板（2000–3000nm）设置了尺寸门（Figure S2b）。基于同型对照设置荧光信号的门。超过荧光阈值的事件被判定为阳性。所呈现的浓度为检测到的事件数，已根据样本总体稀释度、流速和测量时间进行了调整。根据MIFlowCyt指南，使用稀释缓冲液和缓冲液中的游离抗体作为额外对照。使用Nanosight仪器LM14（Malvern Instruments，英国）对来自六个生物重复样本（24名供体）的粒子浓度和尺寸分布进行了NTA测量。该仪器配备有紫色激光器（405 nm，70 mW）和sCMOS相机（Hamamatsu Photonics，日本）。样本用0.1 µm过滤的DPBS（无钙镁离子的磷酸盐缓冲盐水）稀释，以获得每帧40–100个粒子的浓度，并使用相机14级设置录制了五段30秒的视频。数据使用NTA 3.0软件（Malvern Panalytical，英国）进行分析，检测阈值设置为4，屏幕增益设置为10。统计分析使用Prism 9软件（GraphPad，美国）进行。使用Kruskal–Wallis检验（p ≤ 0.05）确定统计显著性。我们使用Spectradyne nCS1仪器（Spectradyne，美国）通过MRPS方法测量了粒子浓度和尺寸分布。该仪器配备了C300聚二甲基硅氧烷（PDMS）色谱柱，可覆盖50–300nm范围内的囊泡直径。样本在过滤过的1% Tween-20的DPBS中稀释，以获得每毫升107至1010个颗粒，并立即用4µL的样品体积进行测量。数据收集持续300秒，或直到每个分析至少计数到1000个粒子过渡事件为止。使用nCS1数据分析器（Spectradyne）对数据进行预处理，包括合并两个技术重复的事件、去除电噪声和缓冲液背景，以及应用色谱柱特定的过滤器来排除基于通过时间对直径、峰值对称性和信噪比产生的假阳性信号。数据过滤的结果以二维散点图的形式呈现，并对每次运行进行检查。统计分析使用Prism 9软件（GraphPad）进行。统计显著性通过Kruskal–Wallis检验确定（p ≤ 0.05）。将胞外囊泡（PEVs）加载到200目涂有聚四氟乙烯碳并经辉光放电处理的铜网上，用2%的多聚甲醛（PFA）固定，再用2%的中性醋酸铀染色，嵌入甲基纤维素-醋酸铀混合物（1.8%/0.4%）中，然后使用荷兰FEI公司的Tecnai 12透射电子显微镜在80千伏下观察。在0.1 M的醋酸钠-联苯胺缓冲液（NaCaC缓冲液）中加入2%的戊二醛，将血小板在20分钟后停止激活，pH值调至7.4。然后将血小板转移到涂有多聚赖氨酸的盖玻片上，并在室温（RT）下继续固定20分钟。固定后，用NaCaC缓冲液冲洗盖玻片两次，每次3分钟；接着在室温下用溶于0.1 M NaCaC缓冲液的1%四氧化锇处理60分钟进行锇酸染色；之后用一系列不同浓度的乙醇/水溶液（50%–100%，v/v）进行脱水处理，并进行临界点干燥。然后对样品进行铂溅射，并使用美国FEI公司的Quanta 250场发射枪（FEG）扫描电子显微镜在3千伏下进行检查。使用ExoView Plasma Tetraspanin试剂盒和美国NanoView Biosciences公司的ExoView R100对胞外囊泡（PEV）样品进行分析。根据纳米颗粒追踪分析（NTA）测量结果，使用孵育缓冲液将样品稀释至所需浓度（总量为1–3×108个颗粒）。直接向芯片上加入35µL样品，并在室温（RT）下孵育16小时。然后，用含有抗人CD81（JS-81，CF555）、抗人CD63（H5C6，CF647）和抗人CD9（HI9a，CF488）的荧光标记抗体混合物对样品进行染色，洗涤、干燥，并在ExoView扫描仪中进行干涉反射成像和荧光检测。使用NanoViewer分析软件（NanoView Biosciences，美国）对数据进行分析，荧光截断值设置如下：CF555通道为250任意单位（AU），CF488通道为480 AU，CF647通道为269 AU。使用Prism 9软件（GraphPad）进行统计分析。采用双向方差分析（ANOVA）确定统计显著性（p ≤ 0.05）。PEV样本（总共1 × 1010个粒子）首先在真空浓缩器（Heto VR-maxi ST，Heto Lab Equipment）中干燥，然后在50 nM的碳酸氢铵缓冲液（AMBIC）中重新悬浮，pH 7.8，并补充了0.1%的RapiGest SF（Waters，USA）。使用标准BCA蛋白检测法（Thermo Fisher Scientific）确定了样本的蛋白浓度，并将每个样本的4微克转移到最终体积为50微升的AMBIC中，以制备胰蛋白酶肽。根据以下协议，使用溶液内胰蛋白酶消化方法制备胰蛋白酶肽：在95°C下变性5分钟，在70°C下用5 mM Tris(2-羧基乙基)膦酸盐盐酸盐（TCEP）溶液还原二硫键30分钟，然后在室温暗处用5 mM碘乙酰胺烷基化30分钟。Sequencing grade trypsin（Promega，美国）以1:50的酶蛋白比例加入，在37°C下孵育2小时，然后在相同浓度下过夜孵育。经过一夜消化后，加入盐酸至最终浓度为0.1%，并在37°C下孵育45分钟以去除RapiGest SF。随后，样品在13,000转/分的条件下离心15分钟以去除残留碎片，并转移到250微升自动进样微量瓶中（赛默飞世尔科技）。然后将样品加载到Easy-nLC 1200（赛默飞世尔科技）与Orbitrap Fusion质谱仪（赛默飞世尔科技）相连的系统中。肽（100 ng）使用Acclaim PepMap C18柱（2微米，100埃，75毫米，15厘米；赛默飞世尔科技）分离。肽通过缓冲液A（5%乙腈和0.1%盐酸）加载，并以线性梯度从10%到40%的缓冲液B（80%乙腈和0.1%盐酸）洗脱，历时1小时。三个生物重复（12名供体），每个生物重复又进行了三次技术重复，在不同的处理之间交替进行两次15分钟的洗涤运行和一个小时的空白运行。使用周期时间数据依赖方法获取质谱图，每3秒自动切换全扫描MS和MS/MS（MS2）扫描。全扫描MS的Orbitrap分析器参数为分辨率120,000，质量范围350至1800 m/z和标准AGC目标；而MS2光谱获取的参数为分辨率30,000，AGC目标为5 x 10^4个离子，隔离窗口为2 m/z，动态排除时间为30秒。通过间歇性注射50 fmol的商业可用BSA肽混合物（美国布鲁克公司）来常规监测色谱柱性能，并通过评估双重洗涤运行中的携带肽来评估。蛋白质鉴定和定量是使用MaxQuant软件包v. 1.6.17.0进行的，该软件包使用了包含>86,000个条目（其中包括245种常见污染物和所有反向序列）的UniProtKB人类FASTA文件。每个样本的技术重复（n = 3）在运行之间进行了匹配，以便在重复之间传递鉴定结果。所有其他参数均使用默认设置。使用Perseus数据分析软件（Tyanova等人，2016）v.1.6.14.0进行差异丰度分析和层次聚类。对丰度值进行了log2转换，将仅通过位点鉴定的蛋白质鉴定结果进行了分类，并从数据框中过滤掉了反向序列和潜在污染物。此外，还从比较中排除了在所有生物重复中强度值为零的鉴定结果。缺失的强度值根据正态分布进行了估算，并对丰度强度进行了中位数归一化处理。统计分析是使用Prism 9软件（GraphPad）进行的。使用Kruskal–Wallis检验（p ≤ 0.05）确定统计显著性。利用PEA技术（Assarsson等人，2014）和Olink炎症面板分析了来自PEVs（n = 3；12名供体）的炎症相关蛋白质货物。根据制造商的说明，使用DC测定法（Bio-Rad）以牛血清白蛋白（BSA）为标准品测量了PEVs的蛋白质浓度。在分析之前，将样品标准化至90 µg/mL。数据以log2尺度的标准化蛋白质表达（NPX）值表示，其中NPX值越高表示蛋白质表达越高。为了最大限度地减少分析内和分析间的变异，对数据进行了归一化处理（针对扩展对照和板间对照）。将NPX值低于检测限（LOD）50%以上的蛋白质从分析中排除。将低于LOD的值替换为LOD/2，并使用log2尺度的线性化表达进行统计分析。统计分析是使用Prism 9软件（GraphPad）进行的。使用Kruskal–Wallis检验（p ≤ 0.05）确定统计显著性。从四个生物重复样本（16名供体）中获取的PEV样本（共1×1010个颗粒，100µL）用DPBS稀释至500µL，然后使用配备TLA-55转头（k系数为81.3，贝克曼库尔特公司）的Optima MAX-XP超速离心机在4°C下以110,000 g的离心力离心90分钟以沉淀颗粒。按照制造商的说明，使用miRNeasy微量试剂盒（Qiagen）从沉淀样本中分离出RNA，并储存在-80°C以供进一步分析。使用Qubit RNA HS检测试剂盒（Thermo Fisher Scientific）和安捷伦RNA 6000 Pico芯片（Agilent Technologies）评估样本中RNA的数量和质量。小分子RNA测序文库按照NEXTflex™ Small RNA-Seq kit v3试剂盒（Bioo Scientific Co）中提供的方案进行制备。简而言之，将每个样本的总RNA（200至10,000 pg之间）在70°C下孵育2分钟，然后加入3' 4N腺苷化接头（接头稀释比例为1/4）和连接酶酶，并在20°C下过夜孵育该混合物以进行连接。去除多余的3'接头后，加入5'接头和连接酶酶，并在20°C下孵育1小时。使用M-MuLV逆转录酶在热循环仪中将连接产物进行逆转录，42°C下30分钟，90°C下10分钟。接下来，使用PCR循环富集cDNA：95°C下2分钟；22–25个循环，每个循环包括95°C下20秒，60°C下30秒，72°C下15秒；最后在72°C下延伸2分钟，并在4°C下暂停。将PCR产物在8% Novex TBE PAGE凝胶（Thermo Fisher Scientific）上分离，并从凝胶中切取150至300 bp之间的一条带。使用改良方案从聚丙烯酰胺凝胶中提取小分子RNA，其中凝胶切片中的DNA在室温下于无核酸酶水中过夜洗脱。之后，使用Qubit dsDNA HS DNA Kit（Thermo Fischer Scientific）对文库进行定量，并使用安捷伦High Sensitivity DNA Kit（Agilent Technologies）在安捷伦2100生物分析仪上对文库进行可视化。文库在HiSeq2500（Illumina）上进行测序，至少获得1200万个51核苷酸的读取序列。提取所有样本的原始计数后，使用NOISeq软件包（Tarazona等，2015）中实施的比例测试过滤掉低表达基因。使用DESeq2算法进行标准化和差异表达分析。为校正多重检验的p值，应用错误发现率（FDR）方法。如果校正后的p值<0.05，则认为基因差异表达。使用multiMiR Bioconductor软件包进行miRNA靶标预测。特别是，我们将预测重点放在包括mirecords、mirtarbase和tarbase在内的已验证靶标数据库上。使用clusterProfiler Bioconductor软件包对miRNA靶基因进行功能分析。体内功能测定
斑马鱼品系及饲养
所有斑马鱼的实验均按照丹麦和欧盟的法规进行，并获得了丹麦动物伦理委员会颁发的许可证（编号：2022-15-0202-00169）。斑马鱼在循环饲养系统中以标准条件（温度28°C，pH 7.2，电导率700µS）饲养，光照周期为14小时光照—10小时黑暗，每天喂食三次。通过自然交配产生胚胎，并在28°C的E3培养基（5 mM NaCl，0.17 mM KCl，0.33 mM CaCl2，0.33 mM MgSO4，10-5%（w/w）亚甲基蓝，2 mM HEPES，pH 7.2）中饲养。实验使用来自已建立的转基因品系的受精后5天内的胚胎；Tg(mpeg1:mCherry)gl23作为胚胎巨噬细胞的报告品系，Tg(tnfa:EGFP-F)ump5用于tnfa的转录激活。本研究中使用的所有鱼品系和野生型（AB）最初均来自欧洲斑马鱼资源中心（德国）。所有微注射实验均按照先前描述的方法进行（Hayashi等，2020）。简而言之，将斑马鱼胚胎（2 dpf）去膜，用含有0.016%（w/v）缓冲的三卡因（3-氨基苯甲酸乙酯；Sigma-Aldrich）的E3培养基麻醉，并嵌入0.8%（w/v）低熔点琼脂糖（BioReagent；Sigma-Aldrich）中。然后，通过总主静脉（Benard等，2012）向胚胎内注射3 nL的PEV和加载缓冲液（无菌过滤、无内毒素的酚红溶液溶于DPBS；BioReagent，Sigma-Aldrich），根据NTA估算，每次注射的剂量范围为106个颗粒。注射后的胚胎在不进行进一步处理的情况下进行体内成像。如之前更详细的描述，所有图像均使用蔡司LSM 780直立式共聚焦显微镜（德国卡尔蔡司公司）获取，激发激光波长分别为488 nm（EGFP）、568 nm（mCherry）和633 nm（用CellTrace™ Far Red染料标记的PEV）。所使用的物镜为W Plan-Apochromat 40×/1.0 DIC M27（卡尔蔡司）。在指定组织区域的所有图像均以2微米的间隔获取，确保每个荧光通道中的光学截面重叠，以构建z轴堆叠图像，并使用Fiji/ImageJ以最大强度z轴堆叠投影的形式呈现。明场图像显示为在任意位置的单个光学切片。PEV与巨噬细胞的共定位采用基于巨噬细胞报告蛋白荧光强度和Fiji/ImageJ中“转换为蒙版”工具的3D蒙版方法确定，如之前所述。简而言之，为了量化与巨噬细胞重叠的PEV荧光，将创建的二进制蒙版通过反转查找表（LUT）应用于PEV荧光通道。此过程针对堆叠图像中的所有光学切片执行，以排除在x、y空间中共定位但在z轴上未共定位的PEV荧光。所有图像均作为最大强度z轴堆叠投影进行处理，并使用Fiji/ImageJ进行分析。“被扣留的PEV”通过阈值化PEV信号来定义，通常仅选择与细胞相关的固定簇。为了量化巨噬细胞对整体PEV扣留的相对贡献，将巨噬细胞蒙版PEV信号（>阈值）的面积除以总PEV信号（>阈值）的面积。由于在某些情况下，巨噬细胞进出视野的移动会对该分析产生严重影响，因此我们应用了一个标准来排除胚胎：巨噬细胞蒙版PEV区域的随时间平均值应>25 µm²。THP-1细胞的培养与分化
THP-1细胞（ATCC TIB-202），一种人类单核细胞系，在由RPMI 1640（Euroclone，意大利）补充了10%经聚乙二醇沉淀去除外泌体（EV）的胎牛血清（FBS，Gibco）、100 U/mL青霉素（Gibco）、100 µg/mL链霉素（Gibco）、2 mM L-谷氨酰胺（Gibco）和25 mM HEPES（pH 7.4）的培养基中生长，以下简称“培养基”。外泌体的去除是通过聚乙二醇沉淀法实现的。THP-1细胞以2 × 105个/孔的浓度接种到24孔板中，并在含有50 nM佛波酯12-肉豆蔻酸13-乙酸（PMA）（Sigma-Aldrich）的培养基中孵育48小时，以分化为巨噬细胞。为了进行PEV摄取实验（第2.12.4节），THP-1细胞以0.5 × 105个/孔的浓度接种在涂有5 µg/cm^2纤维连接蛋白（Roche，瑞士）的96孔黑色PhenoPlate（Revvity，芬兰）上，并在含有50 nM PMA的培养基中孵育48小时，每孔加入100 µL培养基。使用Countess自动细胞计数器（Thermo Fischer Scientific）通过台盼蓝拒染法分析细胞的存活率。分化后，用PBS洗涤细胞，并在添加PEV之前在新鲜培养基中静置24小时。使用ProcartaPlex免疫分析法进行细胞因子分析在24孔板中（n=4），用佛波酯（PMA）分化的THP-1细胞分别与GPVI PEVs、CLEC-2 PEVs、TC PEVs或US PEVs处理6小时和24小时。根据之前的研究，每种处理的剂量为每孔2.5 × 10^9个PEVs（2 × 10^5个细胞）。作为对照，有四个孔未添加PEVs（模拟处理）。孵育后，收集条件培养基，在4°C下以500 × g离心5分钟以去除细胞碎片，并储存在-80°C。使用Cytokine & Chemokine 34-Plex Human ProcartaPlex Panel 1A试剂盒（Invitrogen）分析细胞因子分泌组，并根据制造商的说明使用xMAP Luminex系统（Bio-Rad）进行测量。检测内容包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、单核细胞趋化蛋白（MCP）1、巨噬细胞炎性蛋白（MIP）1α、MIP-1β、RANTES（正常T细胞表达和分泌的调节激活因子）、基质细胞衍生因子1（SDF-1α）、γ诱导蛋白10（IP-10）、嗜酸性粒细胞趋化因子、IFN-γ、白细胞介素（IL）IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-21、IL-22、IL-23、IL-27、IL-31、肿瘤坏死因子α（TNFα）、TNFβ、干扰素（IFN）α和趋化因子（C-X-C基序）配体（CXCL）1（GRO-α）。样品用RPMI培养基按1:2的比例预稀释。使用5参数逻辑（5-PL）算法为每个蛋白质生成标准曲线，报告背景校正后的中位荧光强度（MFI）和浓度值。在至少一个样本组中所有生物学重复品的浓度均在检测范围内的蛋白质被纳入进一步分析。使用对数转换后的MFI进行统计分析，以体现包含低丰度和高丰度分析物的优势（Breen等，2016）。统计分析使用Prism 9软件（GraphPad）进行。使用Kruskal–Wallis检验（p ≤ 0.05）确定统计学显著性。在1.4-7.7 x 1011 mL-1范围内的PEV与20 µM的CellTraceTM Far Red（Invitrogen）孵育30分钟，温度为37°C，黑暗中进行，每15分钟搅拌一次。孵育后，立即使用Izon qEV single Gen2 70 nm柱子（Izon Science）去除未结合的染料，每柱上样0.1–0.15mL标记的PEVs。弃去最初流出的0.65mL后，使用自动收集器（Izon Science）和0.1µm过滤的dPBS作为洗脱缓冲液，收集5个0.15mL的馏分。将外泌体（EV）馏分合并，并使用10 kDa截留值的超滤装置（Amicon Ultra-4离心过滤装置，Millipore）浓缩至100µL体积。使用纳米颗粒追踪分析（NTA）测量颗粒浓度，并将样品存储在蛋白质LoBind管（Eppendorf）中，于4°C保存，直至第二天用于细胞实验。同时，使用与PEV样品相同的方法制备含有20µM CellTrace™ Far Red染料的缓冲液（经0.1µm过滤单元过滤的dPBS），并作为模拟对照使用。为了研究巨噬细胞对PEVs的摄取，将THP-1细胞（每孔0.5 × 105个细胞，在100µL培养基中）接种于96孔PhenoPlate上，并按照上述方法分化为巨噬细胞。用PBS洗涤细胞后，在预热至37°C的PBS中用0.25µM的CellTrace™ CFSE（Thermo Fisher Scientific）孵育20分钟，再次洗涤后，在新鲜培养基中静置30分钟。然后，用剂量为2.5 × 108–5.0 × 108个CellTrace™ Far Red标记的PEVs或模拟对照处理细胞。在3、6、9和12小时时移除培养基，洗涤细胞，并用4%多聚甲醛固定15分钟。用PBS洗涤细胞两次，用0.5% Triton-X-100（Thermo Fisher Scientific）通透化处理，并用含10% FBS（Gibco）的PBS封闭15分钟。再次用PBS洗涤细胞两次，并在4°C下用PBS中以1:100稀释的小鼠抗人CD18一抗（Santa Cruz，克隆号sc-8420）孵育过夜，以可视化细胞膜。次日，用PBS洗涤细胞两次，并在室温下于暗处用抗小鼠Alexa Fluor 555二抗（Invitrogen）孵育2小时。用PBS洗涤各孔后，使用芬兰分子医学研究所（FIMM，赫尔辛基，芬兰）的高内涵成像单元的PerkinElmer Opera Phenix高内涵筛选系统，配备20× NA 1.0水浸物镜进行成像。图像分析使用Cell Profiler（v. 4.2.5）进行，每个样本至少计数700个细胞。原文地址：https://isevjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jev2.12513
注：因文章篇幅有限，所有相关引用文献，以及补充素材可以点击至原文查阅。
苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过六年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。![]()
![]()
