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题目
宿主与环境因素塑造上呼吸道微生物群和整个生命周期的呼吸健康
亮点
我们对上呼吸道（Upper Respiratory Tract, URT）微生物群在整个生命周期中的正常变化及其与宿主、环境和健康的关系了解有限。我们使用16S-rRNA测序技术，研究了来自3,160名0至87岁荷兰人的3,104份唾液（<10岁）/口咽（≥10岁）样本和2,485份鼻咽样本。这项研究为横断面人群研究（PIENTER-3）的一部分。结果显示，微生物群的组成与年龄密切相关，尤其是在鼻咽部，儿童和青少年时期微生物群逐渐成熟。我们发现微生物群组成与宿主、环境因素及健康结果之间存在明显的特定区域和年龄相关的关联。社交互动、性别和季节与鼻咽微生物群密切相关，而口腔微生物群则更多地与抗生素、烟草和酒精的使用有关。我们提供了一份URT微生物群图谱，展示其与环境和健康的关联，为未来研究奠定了基础。
1. 引言
人体健康受到体内外生理活性微生物群落的强烈影响。尽管相比肠道微生物群（gut microbiota），上呼吸道微生物群（Upper Respiratory Tract, URT microbiota）的研究较少，但其已被证实与呼吸健康密切相关，包括呼吸道感染的易感性和严重程度、慢性呼吸道疾病如哮喘（asthma）和慢性阻塞性肺病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD）以及心血管疾病（cardiovascular diseases）等。呼吸道由多个生态上截然不同的生态位组成，为多样的微生物群落提供了丰富的栖息地。这些微生物群通过与黏膜免疫系统（mucosal immune system）的相互作用，以及形成对有害微生物的屏障，在呼吸系统中发挥至关重要的保护作用。上呼吸道微生物群被认为是下呼吸道的守门人，因而对防止有害病原体的进入及维持健康的呼吸系统具有重要意义。由于上呼吸道直接暴露于外部环境，它必须不断适应宿主和环境特征的变化。因此，了解普通人群中上呼吸道微生物群的组成及这些因素对健康的影响，对于加深我们对微生物群如何影响或预防急性和慢性呼吸道疾病的认识至关重要。迄今为止，对上呼吸道微生物群的研究主要集中在婴儿和幼儿阶段，识别了影响微生物群发展的因素，例如出生方式（birth mode）和喂养方式（feeding type），并将早期微生物群的发展与健康结果联系在一起。研究还发现，在儿童急性感染期间，URT微生物群与下呼吸道感染的严重程度有明确的关联。虽然我们对URT微生物群在儿童时期如何影响健康有一定的了解，但尚不清楚这些关系在成人中如何延续或发生变化。现有的少量研究表明，成人URT微生物群与社交接触和烟草使用等因素有关。然而，我们对整个生命周期中URT微生物群的自然变化及其与宿主、环境和健康特征的关系仍缺乏足够的理解。在本研究中，我们对代表荷兰人口（0至87岁）的3,160名个体的鼻咽部和口腔样本进行了研究，这些样本是2016/17年荷兰全国横断面研究的一部分。我们旨在（1）描述荷兰普通人群整个生命周期中URT微生物群的特征，以及（2）其与宿主、环境和健康特征的关联。最终，本研究可以为未来关于URT微生物群组成自然变异的驱动因素及其与健康结果的关系提供参考。2. 结果
2.1 研究人群特征
我们对来自荷兰人群的3,175名个体的上呼吸道微生物群（URT microbiota）——包括鼻咽部（nasopharynx）和口腔样本——进行了横断面研究，研究时间为2016年1月至2017年12月。基于实际操作的考虑，我们从10岁以下的个体中收集了唾液样本，从10岁及以上的个体中收集了口咽样本，二者均代表口腔生态位。此外，我们从所有年龄段的个体中收集了鼻咽部样本。在预处理和质量控制后，来自3,160名个体的5,589份上呼吸道样本（3,104份口腔样本和2,485份鼻咽部样本），占最初5,930份样本的94%，符合进一步分析的条件研究人群包括319名婴儿（0岁，10%）、611名儿童（1-14岁，19%）和2,230名青少年/成年人（≥15岁，71%，图1A）。我们从2,429名个体（77%）中获得了鼻咽部和口腔的匹配样本。参与者来自全国各地（图1B），年龄在0至87岁之间（平均年龄为36岁），其中51%为女性，86%出生在荷兰（表1）。总共82%的参与者报告其健康状况良好或非常好（表S1）。宿主、环境和健康特征被分类为（图1C）：一般特征、季节/症状、家庭/接触情况、社会经济状况/生活方式、药物使用、疾病、饮食和早期生活。![]()
图1. 样本人群和数据选择概述
(A) 每个年龄类别中符合条件的样本数量。
(B) 参与者的地理分布。
(C) 每个生态位中分析的样本总数，以及问卷中每个类别所选择的变量数量。
2.2 上呼吸道微生物群在人类生命周期中的变化
该数据集包括4,096个扩增子序列变异体（ASVs），它们在至少2个样本中的相对丰度≥0.1%，涵盖了22个门（phyla）、40个纲（classes）、96个目（orders）、176个科（families）、441个属（genera）和660个种（species）。为了评估在整个生命周期中微生物群总体组成的变化以及上呼吸道不同生态位之间的差异，我们进行了主坐标分析（Principal Coordinate Analysis, PCoA）。结果显示，鼻咽部和口腔生态位（唾液和口咽）之间存在显著分离，生态位解释了总方差的30%（R²）（图2A–2C；PERMANOVA p值<0.001）。尽管唾液样本仅采集自10岁以下的个体，但它们大致与口咽样本形成一个连续体（图2D）。年龄是微生物群组成的重要驱动因素，分别解释了鼻咽部（所有年龄）、唾液样本（<10岁）和口咽样本（≥10岁）中10%、11%和1%的方差（图2E和2F；p值<0.001）。对于鼻咽部，我们对≤24岁和>24岁的人群进行了两个分层PERMANOVA测试，结果显示年龄对0-24岁个体解释的方差明显高于24岁以上的个体（分别为12%和0.7%，p值<0.001），表明与年龄相关的变化主要发生在成年之前。我们在40-64岁成人的鼻咽部微生物群中识别出15个核心属（392个中的15个，流行率>75%），这些核心属构成了总组成的94%。这些属在其他年龄组中也占据了89%-95%的微生物群组成，表明基本（核心）微生物早期已建立。然而，一些核心属如Staphylococcus、Peptoniphilus、Finegoldia、Lawsonella和Anaerococcus仅在10岁以后才出现（图S1A）。在成人的口咽中，我们识别出了22个核心属（115个中的22个），它们占据了总口咽微生物群组成的96%-97%，并且在唾液样本中的占比为92%-97%（图S1B）。鼻咽部样本显示出比唾液（平均Bray-Curtis差异=0.53）和口咽样本（=0.63）更高的异质性（=0.76，图2G），尤其是在老年个体中（图S1C）。在大多数年龄类别中，个体内匹配样本之间的一致性高于未匹配的鼻咽部和口腔样本的一致性，这突显了个体内生态位之间的生态连续性。婴儿的匹配样本之间表现出最大的吻合度，表明生态位分化程度较低（图S1D，=0.91，q值=0.01）。接下来，我们探索了每个生态位的样本内（α）多样性，发现年龄与鼻咽部和口腔生态位的多样性之间存在显著关联（图2H）。在鼻咽部，0岁、1-4岁和5-9岁年龄组的Shannon指数保持稳定（所有比较；q值>0.05），随后在10-14岁（β=0.4；q值<0.001，相对于5-9岁）和15-24岁年龄组（表S3；β=0.3；q值<0.001，相对于10-14岁）观察到多样性逐步增加，表明鼻咽部微生物群在青少年期（15-24岁）继续发育。相比之下，我们发现总的细菌密度随年龄的增加显著下降，尤其是在5-14岁年龄组（图2I；表S3；q值<0.05）。通过分段回归，我们将年龄作为连续变量在5-24岁和40岁及以上个体中进行分析，以识别这些年龄段中的潜在断点。在5-24岁个体中，5-8岁年龄组的细菌密度下降更为显著，随后呈现略微减缓的下降趋势（p值=0.044）。其他比较中，断点前后没有显著的斜率差异，表明生物量和多样性在各年龄段呈逐步变化（图2J和2K）。与鼻咽部不同，我们发现唾液中的多样性在0岁至1-4岁期间显著增加（图2H；β=0.6；q值<0.001）。进一步分析婴儿（0岁）发现，多样性在生命的第五个月前逐步增加（图S1E；q值<0.001）。成人的口咽微生物群显示出成年期微生物多样性逐渐下降，65岁及以上老年参与者的多样性显著低于40-64岁的成人（图2H；β=-0.132；q值<0.001）。分段回归分析显示，口咽的微生物多样性在69岁之前呈现逐步下降趋势，69岁之后下降更加明显（图2J和2K；p值=0.001）。口腔生态位的细菌密度在各年龄段保持相对稳定（图2I、2K和图S1F）。![]()
图2. 上呼吸道微生物群在不同年龄段的变化
(A–C) 基于Bray-Curtis差异的主坐标分析（PCoA），样本按生态位用颜色区分。前三个主坐标解释的方差百分比以括号表示。五个排名最高的扩增子序列变异体（ASVs）同时以三角形显示。解释的方差（R²）和p值通过PERMANOVA测试计算。
(D) 7-10岁个体中每个生态位中最丰富属的平均相对丰度（平均相对丰度>10%）。
(E和F) 基于Bray-Curtis差异的PCoA，按生态位分层并按年龄类别着色（E，鼻咽部 [NP]；F，唾液/口咽 [OP]）。解释的方差（R²）和p值通过PERMANOVA测试计算。
(G) 7-10岁个体中每个生态位样本的Bray-Curtis差异（每个生态位的子样本n=500）。箱线图表示第25和第75百分位数（分别为箱体的下边界和上边界）、中位数（中间水平线）以及落在四分位距（IQR；第25和第75百分位数之间的距离）1.5倍以内的测量值（须线）。p值通过线性模型计算，并用Benjamini-Hochberg（BH）方法进行多重检验校正（q值）。
(H 和 I) 按生态位分层的各年龄段的ASV水平Shannon多样性（稀释后）(H) 和细菌密度 (I)。箱线图显示了第25和第75百分位数、中位数以及落在四分位距1.5倍以内的测量值。p值通过线性模型计算，并使用BH方法进行多重检验校正（q值）。
(J 和 K) ASV水平的Shannon多样性 (J) 和细菌密度 (K) 在三个年龄组（鼻咽部微生物群：5-24岁和≥40岁；口咽微生物群：≥15岁）中的变化。通过分段回归分析和Davies检验，识别出显著的断点（用红色虚线表示），表明在特定年龄点的Shannon多样性或细菌密度发生变化。
所有模型均调整了性别和采样季节。参考组用粗体标注。
另见图S1。
2.3 微生物群落聚类与ASV在各年龄段的动态变化
为了深入了解不同年龄段鼻咽部和口腔生态位中的微生物群落结构，我们基于Bray-Curtis差异矩阵进行了完全链接层次聚类分析。我们在鼻咽部识别出10个微生物群落，一般由一个或少数扩增子序列变异体（ASVs）占主导地位（图S2A；表S4）。在口腔生态位中，我们识别出8个群落，其中两个群落由Streptococcus主导（群落2和群落4），另外六个群落由多种ASVs混合构成（图S2B；表S4）。接着，我们使用逻辑回归分析年龄特异性模式，以年龄为预测变量，群落成员身份为结果变量，并调整性别和采样季节。结果显示年龄与4个鼻咽部微生物群落呈负相关，这些群落特征是Moraxella（群落1和群落17）和Haemophilus（群落10和群落19）的高相对丰度（Mor1、Mor17、Hae10、Hae19），表明这些群落在年轻个体中更为常见（OR < 1；q值 < 0.001）。相反，4个由Corynebacterium（群落6和群落7）、Dolosigranulum pigrum（群落3）和Staphylococcus（群落5）主导的群落与年龄呈正相关（图3A和3B；OR > 1；q值 < 0.001）。在不同年龄段的比较中（即0岁、1-9岁、10-24岁、25-64岁[参考]和≥65岁），我们观察到0岁和1-9岁与25-64岁人群之间的差异最为显著，年轻参与者在鼻咽部群落Mor1、Mor17和Hae19中的成员比例显著较高，而在群落Sta5和Dol/Cor中的比例较低（图3C）。此外，我们通过将定量PCR测得的总细菌密度与每个样本中每个ASV的相对丰度相乘，研究了最丰富ASV的绝对丰度动态，并进行了线性模型分析。结果显示，尽管这些群落在成年人中更为普遍，但在<10岁的鼻咽部中D. pigrum（群落3）和Corynebacterium（群落6）的绝对丰度较40-64岁个体更高（图S3A；表S5；q值<0.05）。此外，我们还发现鼻咽部ASV Anaerococcus octavius（ASV66）、Anaerococcus（ASV97）、Corynebacterium（ASV46）、Finegoldia magna（ASV39）、Lawsonella clevelandensis（ASV45）和Peptoniphilus（ASV29）与年龄较大个体显著相关。与微生物多样性和细菌密度的结果类似，上述ASV的绝对丰度在15-24岁之前逐步增加，之后趋于平稳（图S3A）。关于口腔样本，我们在<10岁的唾液中观察到四个微生物群落。我们发现由Streptococcus主导的群落在婴儿（0岁）中占主导地位（Str4：81.8%；Str2：3.5%），但在1-4岁和5-9岁个体中显著减少（图3D）。第三大群落由Neisseria（ASV13）和Haemophilus（ASV9）主导的群落（Nei13/Hae9）从婴儿到较大儿童的相对比例增加（OR > 1；q值 < 0.001）。在ASV层面，我们确认了Haemophilus（ASV9和ASV10）和Neisseria（ASV13）在婴儿中的随年龄增加（图S3C）。在口咽样本（≥10岁）中，我们观察到口腔群落在各年龄段的相对稳定分布。在早期生活中的下降之后，由Streptococcus（群落2）主导的群落与年龄较大者呈正相关（OR > 1；q值 < 0.001；10-14岁为19.8%，≥65岁为31.6%）。分层分析证实，群落Str2的成员身份在≥65岁个体中显著高于25-64岁个体（图3F；q值=0.002）。此外，我们发现三个群落与年龄呈负相关（图3D–3E；Vei8/Pre11、Str4和Str4/Mix，OR < 1；q值<0.05），其中Str4群落在0岁个体中成员比例显著高于1-9岁（图3F）。通过差异丰度分析，我们确认了自10岁起Haemophilus（ASV10）、Alloprevotella（ASV49和ASV65）、Actinobacillus（ASV52）、Pasteurellaceae（ASV77）和Veillonella massiliensis（ASV78）等多种ASV绝对丰度的逐步减少，这与Shannon多样性结果一致（图S3B）。![]()
图3. 上呼吸道微生物群聚类
(A 和 D) 每个年龄类别中参与者在鼻咽部 (A) 和口腔 (D) 微生物群聚类中的比例马赛克图。聚类名称基于每个聚类中最占主导地位的ASVs。鼻咽部聚类由Moraxella (1)（Mor1；占28%的样本）、Staphylococcus (5)（Sta5；18%）、Corynebacterium (7)（Cor7；18%）、Corynebacterium (6和7)/ Dolosigranulum pigrum (3)（Cor/Dol；13%）、Corynebacterium (6)（Cor6；6%）、Streptococcus (4)（Str4；5%）、Haemophilus (10)（Hae10；3.8%）、Moraxella lincolnii (17)（Mor17；3.5%）、Streptococcus (14)（Str14；2.5%）和Haemophilus (19)（Hae19；1.5%）主导。口腔聚类由Streptococcus (2)（Str2；19.1%）、Streptococcus (4)（Str4；13.6%）、与Streptococcus (2)（Str2/Mix；12%）、Streptococcus (4)（Str4/Mix；11%）混合的微生物群落，或者Veillonella (8)/ Prevotella (11)（Vei8/Pre11；13%）、Neisseria (13)/ Haemophilus (9)（Nei13/Hae9；22%）、Leptotrichia (15)/ Prevotella (Lep15/Pre；5%）和Actinomyces (18)/ Prevotella (12)（Act18/Pre12；5%）主导。(B 和 E) 通过逻辑回归确定的年龄与鼻咽部 (B) 和口腔 (E) 聚类成员身份之间的相关性（以年份为单位）的比值比。连接圆圈的水平线表示95%置信区间的上下界。p值使用Benjamini-Hochberg（BH）方法校正（q值）。(C 和 F) 根据逻辑回归得出的不同年龄类别与鼻咽部 (C) 和口腔 (F) 微生物群聚类成员身份之间的比值比。连接圆圈的水平线表示95%置信区间的上下界。p值使用BH方法校正（q值）。参考组：鼻咽部和口咽，25–64岁；唾液，1–9岁。所有模型均调整了性别和采样季节。另见图S2和图S3。2.4 上呼吸道微生物群与宿主、环境及健康特征的关联
为了确定宿主/环境因素和健康结果在多大程度上影响上呼吸道微生物群组成的变化，我们对不同年龄层进行了单变量PERMANOVA测试（图4）。在6/8个年龄类别中，采样季节与鼻咽部微生物群组成的关联最强（R² = 1.2%–5.6%）。采样季节与鼻咽部微生物群的关联与最近的症状（如流鼻涕、咳嗽或发烧至少在采样前一个月内出现）一致，这些症状在婴儿中更为常见（0岁婴儿；R² = 1.3%–1.6%）。类似地，吃固体食物（R² = 2.0%）和托儿所的出勤率（R² = 1.4%）与婴儿微生物群的变化强烈相关。此外，我们的研究还发现，家庭构成，特别是与5岁以下儿童共同生活，与幼儿和25-39岁参与者的鼻咽部微生物群组成有关（R² = 1.7%），后者很可能是父母。对于口咽，我们发现社会经济状况/生活方式、近期抗生素使用和过去3年内报告的肺炎与微生物群组成密切相关，尤其是在40岁及以上的个体中（图4）。此外，在大多数年龄类别中，城市化程度（R² = 0.5%–4.0%）和市镇规模（R² = 0.2%–0.6%）对上呼吸道微生物群组成有显著影响，尤其是在15-64岁参与者中。饮食，尤其是水果摄入量（R² = 4.0%–6.0%），对唾液微生物群组成有显著影响。我们还发现，婴儿的喂养类型（纯母乳喂养R² = 3.2%；吃固体食物R² = 5.3%；p值<0.001）对唾液微生物群的影响更明显，而对鼻咽部微生物群的影响较小（图4）。同样，呼吸道感染的近期症状在婴儿的口腔微生物群中表现出最强的关联，其他年龄类别中则较弱。为了更深入地了解这些模式，我们从以下几个方面分析了宿主、环境及健康特征与上呼吸道微生物群的关系：（1）多样性，（2）密度，（3）ASV/属水平上的差异丰度。我们使用线性模型（MaAsLin2）对鼻咽部的ASV水平和口腔生态位的属水平进行分析，目的是确定导致观察到的变化的特定分类群。对于口腔生态位，我们选择聚焦在属水平，而不是ASV水平，因为先前分析显示，同一属的许多ASV反应类似，这种方法可以更广泛地代表口腔微生物群。我们分别集中在鼻咽部的31个ASV和口腔生态位的27个属（所有这些分类群的相对丰度在至少100个样本中超过1%），它们分别占鼻咽部样本中相对丰度的83%和口腔生态位的98%。对于每个模型，我们都调整了年龄、性别和采样季节。基于PERMANOVA结果和相关度，还进行了额外的校正（表S2）。![]()
图4. 宿主/环境/健康特征与上呼吸道微生物群组成的年龄分层关联
宿主、环境和健康特征解释的微生物群方差（R²）及其p值，结果基于不同年龄和生态位的单变量PERMANOVA测试。仅在每组样本数量至少为10时进行关联测试。颜色表示显著性水平，圆圈的大小表示解释的方差。ns表示不显著。另见图S4。2.5 上呼吸道微生物群与性别的关联
首先，鉴于在肠道微生物群与性别激素差异之间已发现的关联，我们探讨了上呼吸道微生物群与性别相关的趋势。在群落水平上，性别解释了鼻咽部总方差的0.3%（表S6；多变量PERMANOVA p值<0.001）。我们对每个年龄类别进行了线性模型分析，发现10-24岁男性和0岁婴儿的鼻咽部微生物群多样性高于同龄女性（图5A和5B；q值<0.05）。在15岁及以上的男性中，我们观察到若干低丰度ASVs的较高水平，包括A. octavius（ASV66）、Anaerococcus（ASV97）、Corynebacterium（ASV46）、F. magna（ASV39）、L. clevelandensis（ASV45）和Peptoniphilus（ASV29）（图5C和5D；在至少3个年龄类别中q值<0.1）。有趣的是，这些ASVs也与年龄较大者独立相关（图S3A）。敏感性分析通过多变量线性回归模型排除了性别相关效应仅由生活方式因素（如吸烟和饮酒）变化引起的可能性（未显示数据）。在口腔生态位中，性别解释了0.1%的方差，但仅在口咽样本中显著（图4；表S6；p值=0.002）。结果显示Bifidobacterium在40岁及以上的男性口咽中尤为丰富（图5E和5F；q值<0.1）。![]()
图5. 上呼吸道微生物群中与性别相关的模式
(A 和 B) Shannon多样性 (A) 和细菌密度 (B) 与性别在不同年龄类别中的关系。p值通过线性模型计算，并使用Benjamin-Hochberg (BH) 方法进行多重检验校正 (q值)。图中显示了均值和标准误。(C) 不同年龄段中，鼻咽部 (NP) ASVs的绝对丰度与性别之间的关联。估计值和q值通过MaAsLin2计算。图中显示了至少有一个显著比较的所有ASVs。颜色表示关联的方向（红色为正向，绿色为负向）。(D) 鼻咽部中至少在三个年龄类别中对性别有显著反应 (q值<0.1) 的ASVs的绝对丰度。图中显示了均值和标准误。(E) 口腔生态位中属的绝对丰度与性别之间的关联。估计值和q值通过MaAsLin2计算。图中显示了至少有一个显著比较的所有ASVs。颜色表示关联的方向（红色为正向，绿色为负向）。(F) 口腔生态位中至少有一个显著 (q值<0.1) 对性别有反应的属在不同年龄段的表现。图中显示了均值和标准误。*q值 % 0.25, **q值 % 0.1, ***q值 % 0.05。所有模型均校正了年龄（年/月）和采样季节。
2.6 上呼吸道微生物群与社交接触的关联
接下来，考虑到了解通过个人接触传播微生物的潜力对有效的疾病预防和管理至关重要，我们研究了家庭构成和与工作相关的接触（与儿童、动物、病人或老人一起工作）对25-64岁成年人上呼吸道微生物群的影响。为了提取每种接触类型的独立信号，每个模型均调整了所有其他接触变量。结果显示，与鼻咽部微生物群密切相关的信号与与儿童的个人接触有关，特别是在家庭中生活的儿童（表S6；R² = 1.2%；p值<0.001）和工作环境（R² = 0.6%；p值=0.005）。在与儿童一起生活或工作的成年人中，我们发现其微生物多样性较低，细菌密度较高，并且Moraxella（ASV1和ASV17）和D. pigrum（ASV3）的绝对丰度较高（图S4A–S4C），这些特征在较年轻的儿童中常见（图2H、2I和图S3A）。通过比较Bray-Curtis差异性，我们确认与儿童接触的成年人的鼻咽部微生物群与儿童的微生物群非常相似（图S4D）。相比之下，口咽微生物群受到与儿童共同生活（R² = 0.3%；p值=0.029）或工作的影响较小（R² = 0.2%；p值=0.019）。因此，研究结果表明，与儿童的接触在塑造成年人的鼻咽部微生物群方面比口咽微生物群发挥更大作用。2.7 上呼吸道微生物群与烟草和酒精使用的关联
由于吸烟与呼吸道感染和慢性呼吸系统疾病相关，我们研究了15岁及以上个体的烟草使用与上呼吸道微生物群之间的关联，包括现吸烟者（16%）、前吸烟者（33.6%）和被动吸烟者（6.1%）。我们校正了教育水平（Pearson r = -0.09；q值<0.001）和酒精消费（表S2；Pearson r = 0.09；q值<0.001）。在鼻咽部微生物群中，吸烟状态解释了0.3%的方差（表S6；p值<0.001）。我们观察到D. pigrum（ASV3）的绝对丰度从未暴露者、前吸烟者、被动吸烟者到现吸烟者逐步减少（图S4G；q值<0.25）。相反，稀有分类群如Peptoniphilus（ASV29）、F. magna（ASV39）、Corynebacterium（ASV46）和Campylobacter ureolyticus（ASV163）在现吸烟者中的丰度较高（q值<0.1），其中Peptoniphilus（ASV29）和F. magna（ASV39）与每周吸烟量呈正相关（图S4H）。在口咽中，吸烟对微生物群组成的影响比在鼻咽部更为显著（表S6；R² = 0.6%；p值<0.001）。在前吸烟者和现吸烟者中，口咽微生物群的多样性低于未吸烟者（图S4E和S4F；q值<0.05）。现吸烟者的口咽微生物群中Bifidobacterium的绝对丰度较高（coef = 3.0；q值<0.05），而其他17个属（尤其是Neisseria）的绝对丰度较低（图S4G；coef = -4.0；q值<0.05）。敏感性分析证实了吸烟的影响与性别无关。我们还研究了酒精消费与上呼吸道微生物群之间的关联（表S1；25.7%的个体禁酒），并控制了教育水平（表S2；Pearson r = 0.2；q值<0.001）和吸烟的影响。酒精消费对口咽的影响更为明显（R² = 0.3%；p值<0.001），而在鼻咽部的影响较小（表S6；R² = 0.1%；p值=0.021）。此外，与不饮酒者相比，饮酒者的鼻咽部Haemophilus（ASV9）（coef = 0.8；q值<0.05）和Streptococcus（ASV4）（coef = 0.7；q值<0.05）的绝对丰度较高（图S4G）。在口咽中，饮酒者的微生物多样性较高（q值=0.005），并且14个属（包括TM7x）的绝对丰度较高（图S4E和S4G；q值<0.25）。这些结果表明，烟草使用和酒精消费对上呼吸道微生物群结构具有不同的影响。2.8 上呼吸道微生物群与抗生素使用的关联
抗生素通常用于消除身体各个系统的病原细菌，但它们的使用可能导致全身微生物群结构的破坏。我们调查了15岁及以上个体中抗生素使用对上呼吸道微生物群的潜在影响，因为这一年龄组中抗生素的使用较为普遍（12.7%在过去三个月内使用过抗生素）。最近三个月内的抗生素使用解释了鼻咽部和口咽微生物群组成中分别0.2%和0.4%的方差（鼻咽部p值=0.011，口咽p值<0.001，表S6）。在鼻咽部，抗生素使用与较低的微生物多样性相关（图S4E；q值=0.045），并伴有D. pigrum（ASV3）、Peptoniphilus（ASV29）和L. clevelandensis（ASV45）绝对丰度的降低（图S4G；q值<0.05）。同样，在口咽中，我们观察到抗生素使用显著降低了微生物多样性（q值<0.001）、细菌密度（q值=0.034）以及19个属的绝对丰度（q值<0.25，图S4E-S4G）。在儿童（<5岁）中，结果相似，鼻咽部D. pigrum（ASV3，coef = -3.0；q值=0.007）和Corynebacterium（ASV7，coef = -1.8；q值=0.13）的绝对丰度较低。研究结果证实抗生素使用导致上呼吸道两个生态位的微生物群变化，口咽中的变化更为显著。2.9 上呼吸道微生物群与季节、呼吸道症状及肺炎的关联
为了探索采样季节、呼吸道症状和上呼吸道微生物群之间的关系，我们评估了有无呼吸道症状（如在采样前至少一个月内流鼻涕和/或咳嗽）或伴随发烧的呼吸道症状参与者之间的微生物群差异。在我们的数据集中，四个季节的代表性如下：冬季（22%）、春季（31%）、夏季（22%）和秋季（25%），而呼吸道症状在5岁以下个体中更为常见（无发烧的呼吸道症状：39%；伴有发烧的呼吸道症状：32%），在冬季尤为明显（无发烧的呼吸道症状：48%；伴有发烧的呼吸道症状：17%）。季节解释了鼻咽部微生物群0.4%的方差（表S6；p值<0.001）。进一步分析鼻咽部微生物群显示，冬季的Shannon多样性降低（图6A；q值=0.005），细菌密度增加（图6B；q值<0.001），并且Moraxella（ASV1）和Haemophilus（ASV10和ASV19）的绝对丰度在冬季较夏季更高（图6C；q值<0.05）。我们在不同年龄组（0岁、1-14岁和≥15岁）中分析了季节性模式，发现Haemophilus（ASV10）的丰度波动在儿童（1-14岁）和青少年/成年人（≥15岁）中尤为明显（图6D）。在唾液（<10岁）和口咽（≥10岁）微生物群中，采样季节分别解释了0.9%和0.5%的方差（p值<0.001）。在口咽微生物群中，冬季和春季的微生物多样性（图6A；q值=0.003）、细菌密度（图6B；q值<0.001）以及15个属的绝对丰度（图S5A；q值<0.25）均高于夏季。尽管近期呼吸道感染的个体通常报告的症状较轻，可能反映了常见的间歇性病毒感染，但这些症状仍与鼻咽部微生物群组成密切相关（表S6；R² = 1.7%；p值<0.001）。在鼻咽部中，我们检测到较高的细菌密度（图6B；q值=0.004），以及在近期有呼吸道症状的个体中，尤其是那些伴有发烧的感染者，潜在病原体的绝对丰度较高（图6C；q值<0.05）。这些潜在病原体包括Haemophilus（ASV10和ASV19）、Moraxella（ASV1和ASV17）和Streptococcus（ASV14）。基于BLASTn比对，我们怀疑Streptococcus（ASV14）可能代表Streptococcus pneumoniae（表S7；同一性=100%；E值=2.73 × 10⁻¹³¹），通过piaB和lytA特异性qPCR检测证实了这一点。我们发现Streptococcus（ASV14）的存在高度预测了儿童（<10岁）中肺炎链球菌的携带（阳性预测值[PPV]范围为0.78至0.81），但在≥10岁个体中预测值较低（PPV 0.21至0.56）（图S5B；Χ²检验p值<0.05）。此外，我们观察到Streptococcus（ASV14）的绝对丰度与piaB和lytA浓度之间有很强的相关性（图S5C和S5D；Pearson r = 0.78和r = 0.75，p值<0.001）。与Streptococcus（ASV14）的结果一致，我们检测到在婴儿中（图S5E），S. pneumoniae与近期轻微上呼吸道感染症状（有无发烧）之间有显著的正相关。同时，在患有呼吸道症状的个体中，重要的共生菌如Corynebacterium（ASV7）和D. pigrum（ASV3）减少（图6C；q值<0.05）。按年龄分层分析显示，这些差异在婴儿（0岁）和儿童（1-14岁）中最为明显（图6E；q值<0.05）。与鼻咽部相比，唾液和口咽微生物群的变异较小，与呼吸道症状的关联较少（R² = 0.7%和0.1%，p值<0.05）。对于唾液微生物群（<10岁），我们观察到有呼吸道症状和发烧的个体的微生物多样性较高（图6A；q值=0.002），并且13个属的绝对丰度较高（图S5A；q值<0.25）。我们还研究了15岁及以上个体的肺炎发生率与上呼吸道微生物群之间的关系，并校正了过去三个月内的抗生素使用（Pearson r = 0.15；q值<0.001）。5.6%的参与者（N = 122）在过去三年内经历过一次肺炎，而2.7%的参与者（N = 59）报告了多次肺炎。在经历过多次肺炎的个体的鼻咽部中，Streptococcus（ASV14）的绝对丰度和存在率较未患过肺炎的个体更高（图6F和6G；q值<0.05）。这些发现与S. pneumoniae（piaB浓度）与过去三年多次肺炎的适度关联一致（图S5E；p值=0.20），再次表明Streptococcus（ASV14）与过去感染负担的关联反映了部分个体中肺炎链球菌的携带情况。此外，通过敏感性分析，我们证明肺炎病史与更高的S. pneumoniae丰度相关，无论个体是否接受过抗生素治疗。在口咽中，Shannon多样性在经历一次（q值=0.02）或多次肺炎的个体中呈逐步下降（q值=0.005，图S5F-S5H）。与鼻咽部类似，我们发现有肺炎病史的个体的口咽微生物群中Streptococcus（ASV14）的丰度较高（图6G）。![]()
图6. 上呼吸道微生物群中的季节、呼吸道症状和肺炎相关模式
(A 和 B) Shannon多样性 (A) 和细菌密度 (B) 与采样季节（调整年龄类别和性别）或呼吸道症状（调整年龄类别、性别和采样季节）的关系，按生态位分层。连接圆圈的水平线表示95%置信区间的上下界。p值通过线性模型计算，并使用Benjamini-Hochberg (BH) 方法进行多重检验校正 (q值)。
(C) 鼻咽部 (NP) 中ASVs的绝对丰度与采样季节和呼吸道症状的关联。估计值和q值通过MaAsLin2计算。图中显示了至少有一个显著比较的所有ASVs。颜色表示关联的方向（红色为正向，绿色为负向）。
(D 和 E) 与采样季节 (D) 和呼吸道症状 (E) 关联最强的ASVs（coef < -0.9 或 coef > 0.9；q值 < 0.05），按年龄组（0岁，1-14岁，≥15岁）分层。估计值和q值通过MaAsLin2计算。图中显示了均值和标准误。星号表示该组与参考组（粗体）相比的显著性。
(F) 鼻咽部 (NP, ≥15岁) 中ASVs的绝对丰度与肺炎病史的关联（调整年龄类别、性别、采样季节和抗生素使用）。估计值和q值通过MaAsLin2计算。图中显示了至少有一个显著比较的所有ASVs。颜色表示关联的方向（红色为正向，绿色为负向）。
(G) 鼻咽部和口咽部 (≥15岁) 中存在Streptococcus (14) 的参与者比例（读取数 > 0），按肺炎病史分组。
*q值 % 0.25，**q值 % 0.1，***q值 % 0.05。参考组为：采样季节="夏季"，呼吸道症状="无呼吸道症状"，肺炎="未患过肺炎"。
另见图S5。
讨论
本项全国性人口研究对整个生命周期中的上呼吸道微生物群（URT microbiota）进行了全面分析，确定年龄是微生物群的主要驱动因素，不同的上呼吸道生态位表现出独特的模式。年轻个体的鼻咽部微生物群表现出较低的多样性和较高的总细菌密度，而在年长个体中则相反。微生物多样性和总细菌密度在15至24岁之间趋于稳定，表明鼻咽部微生物群在青年期继续发育成熟。这一现象此前未被报道，与肠道微生物群在2至5岁左右稳定的模式形成鲜明对比。D. pigrum和Corynebacterium属是鼻咽部的重要共生菌，常与疾病的缺失及潜在病原体的抑制相关。我们发现这些细菌的丰度随年龄变化，尽管D. pigrum在年轻个体中更为丰富，但在所有年龄组中均有分布。此外，我们还发现了一组稀有分类群，包括Anaerococcus (octavius)、Corynebacterium、Finegoldia magna、Lawsonella clevelandensis和Peptoniphilus，它们在青少年和成年人（≥15岁）的鼻咽部特征中更为明显。这些分类群在男性中更为丰富，特别是在青春期，这种模式在分层控制吸烟行为等其他因素后依然存在。我们推测，微生物群组成中由年龄和性别驱动的变化可能与激素波动有关，正如先前研究表明激素波动与小鼠肠道微生物群组成的变化相关。此外，我们假设微生物群的发育可能与免疫发育、上皮变化、解剖发育和不同生命周期的环境暴露存在相互关联。与鼻咽部相比，口腔生态位的细菌密度和多样性较高，个体之间的变异性较低，年龄相关的差异也较为微妙，可能是由于其在食物消化中的作用。我们观察到微生物群组成与宿主和环境特征之间存在显著的生态位和年龄特异性关联，特别是社交接触对鼻咽部微生物群组成具有强烈的影响。与儿童共同生活或工作的成年人的鼻咽部微生物群更接近儿童的典型鼻咽部微生物群，Moraxella的绝对丰度较高。尽管先前研究发现婴儿的鼻咽部微生物群类似于其母亲，但我们的数据表明，幼儿也可能影响其父母的微生物群。近期呼吸道症状、抗生素使用和吸烟行为与鼻咽部共生菌D. pigrum和Corynebacterium的绝对丰度呈负相关。有趣的是，链球菌（主要代表为S. pneumoniae）和Haemophilus属的绝对丰度与近期轻微感染相关，包括儿童的上呼吸道感染和青少年/成年人的下呼吸道感染（包括肺炎）。这些发现主要在婴儿和儿童中显现，进一步支持了鼻咽部细菌群落可能调节病毒感染严重程度并在恢复到微生物平衡之前需要一段恢复期的观点。我们的数据还表明，口腔微生物群主要受生活方式因素的驱动，如吸烟和饮酒。我们发现活跃和曾经吸烟者的微生物多样性较低，突显了吸烟对口腔微生物群的影响。最近的证据表明，口腔微生物群与心血管疾病有关，除了与肠道微生物群的已知联系外，进一步研究有助于阐明口腔微生物群作为直接或中介因素与心血管疾病风险的关联。尽管此前的研究主要集中于小样本或特定生命周期阶段的上呼吸道微生物群，本研究揭示了上呼吸道微生物群的年龄相关动态，填补了在人类微生物群研究中长期存在的知识空白。我们的研究采用了标准化操作程序来表征低生物量的呼吸道样本，确保了数据的可靠性。此外，我们采用了广泛的预处理步骤来避免使用低质量样本，并处理了潜在污染问题。理解微生物通过环境传播的潜力对于有效的疾病预防和管理至关重要，因此空气污染和集约化畜牧业等环境因素的影响是未来需要进一步研究的领域。研究局限性
尽管本研究通过广泛的问卷收集了宿主、环境和健康特征的信息，但我们未收集有关口腔卫生习惯的具体数据，如刷牙频率或使用漱口水的情况，这可能影响我们对口腔卫生习惯对唾液和口咽微生物群组成影响的理解。此外，依赖问卷自报数据可能引入回忆偏差，参与者可能不准确地记忆或报告其病史。研究采用横断面设计，限制了我们确定因果关系或变量间时间关系的能力。样本在不同的咨询时间采集，这可能引入由于一天中的时间差异以及与这些差异相关的微生物群变化。我们使用的16S-rRNA扩增子测序具有固有的局限性，这种技术可能无法区分属内密切相关的物种，也无法提供功能性读数。未来研究可以采用宏基因组学方法以克服这些局限性。此外，为了捕捉上呼吸道微生物群的正常变异范围，未来研究应包括在不同地理位置和生活方式下进行的纵向研究。原文网址：
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(24)00768-2
