【文献解读】黄酮类化合物Nobiletin通过靶向PKM2和激活糖酵解信号通路，缓解了斑马鱼抑郁样行为
文摘
科学
2024-09-25 17:00
江苏
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文献：Zhang ML, Li XP, Gao LF, Liu J, Bi ZJ, Miao YH, Shan Y, Yu HL. Nobiletin, an activator of the pyruvate kinase isozyme M1/M2 protein, upregulated the glycolytic signalling pathway and alleviated depressive-like behaviour caused by artificial light exposure at night in zebrafish. Food Chem. 2024 Sep 18;463(Pt 2):141328. doi: 10.1016/j.foodchem.2024.141328. Epub ahead of print. PMID: 39305673.影响因子：8.5
我们建立了一种由夜间人工光照（ALAN）引起的斑马鱼类抑郁样行为模型，发现Nobiletin（NOB）能够缓解这种抑郁样行为。基于24小时自由活动实验、时钟基因表达以及脑组织转录组测序的结果，发现糖酵解信号通路可能是NOB发挥抗抑郁作用的靶点。在ALAN斑马鱼模型中，外源性L-乳酸的补充也能减轻抑郁样行为。分子对接和分子动力学模拟显示NOB与丙酮酸激酶异构酶M1/M2（PKM2）蛋白之间存在分子间相互作用。我们随后使用化合物3k构建了PKM2被抑制的斑马鱼模型。对该模型的分析表明，NOB通过抑制PKM2来缓解抑郁样行为。总之，NOB通过靶向PKM2和激活糖酵解信号通路，缓解了由ALAN引起的斑马鱼抑郁样行为。介绍
随着城市化进程的快速推进，夜间光照的暴露在全球范围内急剧增加，目前超过80%的人群暴露于夜间人工光照（ALAN）中。ALAN暴露与多种生活方式因素相关，如智能手机、平板电脑等电子设备的使用以及家庭照明，这些因素进一步加剧了ALAN带来的风险。这些风险包括内源性局部昼夜节律的紊乱，导致大脑昼夜节律中心的直接突触输入失衡，从而影响下丘脑-垂体-肾上腺轴的昼夜节律，这是ALAN引起抑郁的一种致病机制。与抑郁相关的多个过程，如脑可塑性变化、神经传递、激素分泌和时钟基因表达，都受到昼夜节律的调控。目前的研究表明，昼夜节律紊乱与抑郁之间可能存在双向且互相加重的关系。Nobiletin（NOB）是一种黄酮化合物，含有六个甲氧基团（补充图1 A, B）。对5300种小分子的无偏化学筛选显示，NOB和橙皮苷（pentamethoxyflavone）增强了昼夜生物钟的振幅，而柚皮苷及其糖苷衍生物柚皮素则未能调控细胞昼夜节律。通过使用PER2::Luc敲入小鼠胚胎成纤维细胞，检测了18种黄酮类化合物对振幅、周期和昼夜节律相位的影响。结果表明，只有NOB和橙皮苷增强了PER2::Luc生物发光节律的振幅，延长了周期并延迟了相位，而其他黄酮类、黄酮醇和异黄酮未能调控细胞昼夜节律。含有更高甲氧基含量的多甲氧基黄酮在昼夜节律调控方面表现出更强的效果，其中NOB的效果最为显著。在饮食诱导的肥胖小鼠中，NOB抵抗代谢综合症，并以肝脏时钟依赖的方式增加能量消耗和活动量。另有研究发现，NOB在高脂饮食小鼠的C2C12肌母细胞中增强了骨骼肌时钟，改善了代谢疾病模型小鼠的能量稳态。在II型糖尿病患者中，NOB改善了胰腺时钟的昼夜节律振幅和胰岛素分泌。此外，NOB通过重编程肝细胞时钟，防止胰岛素抵抗和脂质代谢障碍。NOB还通过稳定时钟基因减少了昼夜节律紊乱引发的谵妄。作为一种天然小分子，NOB能够穿过血脑屏障，直接作用于神经元。基于以上证据，NOB抑制昼夜节律紊乱的能力、与昼夜节律和抑郁的相互作用，以及其穿越血脑屏障的能力，使得NOB可能缓解由ALAN引起的抑郁样行为的假设显得合理。斑马鱼（Danio rerio）是一种常用的脊椎动物模型生物，广泛应用于药理学、发育和疾病研究。与人类相似，斑马鱼主要以白天活动为主，形成群体，建立社会等级，并进行复杂的社会交流。斑马鱼体型小，对各种药物敏感，便于高通量药理筛选。此外，药物可以直接添加到斑马鱼的培养水中（即无创技术），或通过腹腔注射给药，允许快速吸收并减少药物总剂量。近年来，斑马鱼成为研究抑郁及其行为、遗传和生理机制，以及抗抑郁药物发现的有用模型生物。长期暴露于丙烯酰胺加剧了成年斑马鱼的体轴畸形和触觉倾向，进一步削弱了它们的探索能力和社交能力，导致焦虑和抑郁样行为。在斑马鱼中，布洛芬、伊伽洛和特布他嗪的暴露引起依赖性回避，导致游泳能力和乙酰胆碱酯酶活性下降。2,2′,4,4′-四溴二苯醚的暴露破坏了非成像视觉通路，并在斑马鱼中引发抑郁样效应。为了研究NOB是否能抑制ALAN诱导的斑马鱼抑郁样行为及其机制，我们首先构建了ALAN诱导的斑马鱼抑郁样模型。随后，我们观察了NOB在缓解抑郁样行为方面的效果，并探索了其在昼夜节律、转录组学和糖酵解信号通路中的作用机制。结果
NOB抑制了ALAN诱导的抑郁样行为和单胺类神经递质异常
NOB缓解了ALAN引起的体长、体重和心率下降
随着城市化进程的加快，全球范围内越来越多地使用外部照明来照亮城市，以便进行夜间活动。过度使用外部照明导致光污染，这对人类健康构成威胁，并造成能源浪费。在本研究中，我们建立了ALAN的斑马鱼模型。与对照组相比，ALAN组的体长、体重和心率显著降低（补充图1C-F）。NOB的干预缓解了这些ALAN引起的不良影响，其效果与褪黑素（MT）相当。NOB缓解了ALAN诱导的抑郁样行为
运动是一个复杂的过程，涉及大脑、神经系统和视觉通路的综合反应。在精神病学领域，斑马鱼模型促进了行为分析技术的发展。开放场实验、颜色偏好测试、社交行为评估和黑白箱评估等方法均有助于研究斑马鱼的抑郁样行为。在斑马鱼的开放场行为测试中，与对照组相比，ALAN组在总移动距离和平均速度上显著降低，而NOB的干预则缓解了这些变化（图1A）。NOB组的总移动距离和平均速度略低于MT组。![]()
颜色偏好评估为药物筛选和阐明斑马鱼模型中的颜色学习与记忆功能提供了宝贵的见解。与对照组相比，ALAN组在蓝色和绿色区域的总移动距离、平均速度和累计停留时间显著减少，同时在黄色和红色区域的累计停留时间显著增加（图1B）。NOB的干预减轻了这些变化，NOB组在蓝色和绿色区域的累计停留时间显著超过MT组。在人类中，来自家人和朋友的社会支持对身体和心理健康尤为重要。相反，缺乏社会联系与更高的心理疾病发生率相关，如创伤后应激障碍、抑郁、焦虑和睡眠障碍。斑马鱼具有明确的社会行为表型，与人类有遗传同源性，提供了相对简单的实验平台和高通量筛选的可能。与对照组相比，ALAN组在社交区域的总移动距离、平均速度、社交区域的频率和累计停留时间显著减少。NOB的干预缓解了这些ALAN引起的不良影响（图1C）。此外，与MT组相比，NOB组在社交区域的累计停留时间显著增加。焦虑样行为常与抑郁同时发生，通常通过明暗箱实验进行评估。由于本能倾向于寻找避难所和安全场所，斑马鱼通常更喜欢黑暗区域。相较于对照组，ALAN组在白色区域的停留频率增加，但在总移动距离、平均速度或白色区域的累计停留时间上没有显著变化（图1D）。与ALAN组相比，MT组和NOB组在白色区域的总移动距离、平均速度和停留频率均有所减少，尽管白色区域的累计停留时间未发生变化。NOB抑制了斑马鱼的脑皮层损伤、单胺神经递质功能障碍和细胞凋亡
使用H&E染色法对斑马鱼脑组织切片进行分析，评估NOB对ALAN暴露斑马鱼脑病理的影响。在对照组中，外部组织结构排列规整，皮层细胞丰富，未见空泡或其他异常现象。不同组织层之间的边界明显且规则，未见空泡或不规则结构（图2A）。相反，在ALAN组中，组织排列不规则，皮层与中脑脑室之间的距离增加，出现空腔，并且连接组织相关结构减少，这些现象在NOB或MT干预后有所改善。![]()
图2 NOB抑制了斑马鱼大脑皮层损伤、单胺类神经递质紊乱和细胞凋亡中枢神经系统中单胺神经递质的功能障碍，尤其是去甲肾上腺素、5-羟基吲哚乙酸和皮质醇，是抑郁症发病机制中的关键因素。与对照组相比，ALAN组的斑马鱼脑中皮质醇水平升高，而去甲肾上腺素和5-羟基吲哚乙酸水平降低。NOB和MT的治疗均改善了这些升高/降低（图2B）。值得注意的是，NOB组和MT组之间在去甲肾上腺素、5-羟基吲哚乙酸和皮质醇的水平上没有显著差异。脑源性神经营养因子（BDNF）在调节脊椎动物的心理行为中发挥重要作用。尽管多条信号通路影响情绪，但BDNF是与抑郁和焦虑相关的重要神经营养因子。抗抑郁药可能通过增加BDNF表达来发挥治疗作用，从而逆转神经元萎缩和细胞损失。与对照组相比，ALAN暴露组的bdnf mRNA水平降低，而NOB干预缓解了这种影响（图2C）。进一步分析斑马鱼脑中的凋亡相关基因发现，ALAN使p53 mRNA水平增加，而bcl2/bax比率降低。NOB治疗逆转了这些ALAN诱导的变化。此外，NOB组的bcl2/bax比率显著高于MT组。NOB挽救了ALAN引起的斑马鱼24小时心率和自由活动异常
抗抑郁药的临床疗效可能部分源于它们对生物节律的影响。斑马鱼心率在24小时内的变化如图3A所示。与对照组相比，ALAN暴露的斑马鱼在CT13、CT19和CT25时心率显著降低（图3B）。NOB干预缓解了ALAN暴露斑马鱼的心率下降，尤其在CT13和CT19时效果明显。![]()
图3 ALAN诱导的24小时心率和自由活动受NOB的影响斑马鱼的运动活动表现出明显的生物节律特征，白天游泳，晚上则表现出睡眠行为。通过电荷耦合设备相机记录斑马鱼的昼夜运动轨迹。与对照组相比，ALAN暴露的斑马鱼在20:00到07:00期间显示出显著增加的运动距离和速度，表现出躁动和兴奋状态（图3C，D）。然而，经过NOB干预后，这种运动活动的变化不再观察到。NOB对ALAN诱导的斑马鱼脑中生物钟基因表达的影响
为研究生物节律变化是否与内部生物钟功能障碍相关，检测了24小时生物节律中生物钟基因的节律表达。结果如图4所示。用于拟合基因表达数据的正弦函数为 y-y0 = Asin[π(x−xc/w)]。该函数使用Origin软件拟合基因表达数据，得到了四个常数：yo, A, xc 和 W。振幅用A表示，周期用2 W表示，阶段用π(x−xc/w)表示。相位差是根据峰值出现的时间计算的。生物钟基因的振幅、周期和相位见表1。![]()
图4 ALAN组中NOB对时钟基因表达的影响（24小时内）![]()
表1 ALAN斑马鱼中NOB对时钟基因振幅、周期和相位的影响在24小时内结果揭示了以下趋势： (1) 在ALAN组与对照组、ALAN+NOB组与ALAN组的特定CT时，某些基因的mRNA表达趋势相反：bmal1在CT25；per1在CT7；per2在CT19和CT25；per3在CT7、CT19和CT25；cry1在CT7、CT19和CT25；cry2在CT19和CT25；ror在CT13和CT25；rev-erbα在CT7和CT25。(2) 在mRNA表达振幅方面，bmal1、per3和ror的趋势在ALAN组与对照组、ALAN+NOB组与ALAN组之间相反。(3) 在mRNA表达周期方面，clock、cry2和ror的趋势在ALAN组与对照组、ALAN+NOB组与ALAN组之间相反。(4) 在mRNA表达相位差方面，clock、bmal1、per1、per3和rev-erbα在ALAN组与对照组、ALAN+NOB组与ALAN组之间表现出相反的趋势。NOB对ALAN诱导的斑马鱼脑组织转录组的影响
为进一步探讨NOB的抗抑郁作用，进行了斑马鱼脑组织的转录组测序。在对转录组测序数据进行质量控制后，对样本的差异基因（DEGs）进行了无监督层次聚类分析，并以热图形式展示（补充图2）。结果显示，同一组的四个生物重复样本均聚集在同一簇中，表明组内差异小于组间差异。对DEG数据进行了综合分析，利用Metascape的元分析功能对ALAN组与NOB组的差异基因进行了GO富集分析。结果显示，上调表达的基因中富集了与生物节律密切相关的信号过程，包括基因表达的生物钟调节、对光刺激的反应以及昼夜节律的睡眠/觉醒周期（补充图3A）。相反，下调表达的差异基因中富集了与生物节律密切相关的生物过程，包括基因表达的生物钟调节、生物节律、光周期以及使用DNA作为模板的转录负调节（补充图3B）。此外，NOB组与对照组之间的差异基因也进行了KEGG分析，富集了与生物节律密切相关的信号通路，包括转录因子信号通路、DNA修复和重组蛋白信号通路、核受体信号通路以及MAPK信号通路（补充图3C，3D）。在ALAN组和对照组的差异基因分析中筛选出16个与生物节律相关的基因：per3、fbxl3l、si:ch211-132b12.7、arntl2、per1b、cry2、rorcb、nr1d2b、nr1d4b、clocka、arntl1a、per1a、cry3a、cry1b、nr1d2a和nr1d4a。其中，有三个生物节律基因的FC < 1.5且p < 0.05：arntl1b、cry1a和rorca。筛选出了六个与心理健康相关的基因：h1–10、hsp70l、glral、gapdh、apoea和asb10。筛选出24个与肌肉相关的基因，包括stac3、casq1b、pygma、myhz1.2、cavin4b、myhz1.3、mybpc2b、ckmb、ttn.2、atpa11、ldb3b、ckma、atp2a1l、ldb3b、ckma、atp2a1、myhc4、tnnild、mybpc1、tnni2b.2、ttn.1、tnni1c、desma和flnca（补充表2）。对ALAN+NOB组与ALAN组的DEG数据进行了进一步的GO富集分析。对于上调表达的DEG，富集了51个生物过程（补充图4A）。对于下调表达的DEG，富集了40个生物过程（补充图4B）。然而，没有直接与生物节律相关的生物过程被富集。类似地，ALAN+NOB组与ALAN组的KEGG分析也没有直接与生物节律相关的富集。上调表达的差异基因中富集了24条信号通路（补充图4C），而下调表达的差异基因中富集了13条信号通路（补充图4D）。但没有直接与生物节律相关的信号通路被富集。分析ALAN+NOB组与ALAN组的DEG，筛选出一个与生物节律相关的基因rorb。有三个生物节律基因的FC < 1.5且p < 0.05：arnt、per2和nrld2a。筛选出一个与心理健康相关的基因apoa4b.2，以及一个与肌肉相关的基因pygma（补充表3）。对于高通量测序结果，有两种可能的解释。一种可能是由于实验限制，高通量测序未能捕捉到24小时内生物节律基因表达变化的完整范围，因此未富集与生物节律相关的信号通路。另一种可能是NOB可能间接影响生物节律。尽管高通量测序检测到rorb显著变化（FC = +1.58，p < 0.05），但其他三种生物节律基因（即arnt（FC = +1.29，p < 0.05）、per2（FC = −1.27，p < 0.05）和nrld2a（FC = −1.22，p < 0.05））的FC均未超过1.5。同时，GO富集分析和KEGG富集分析未检测到与生物节律相关的生物过程或信号通路。因此，NOB可能不会直接影响生物节律，而是改善生物节律功能障碍的负面影响。在KEGG富集分析中，与对照组相比，ALAN组的糖酵解/糖异生信号通路显著下调（富集 = 5.315，p < 0.000347）。在NOB干预后，ALAN组的糖酵解/糖异生信号通路显著上调（富集 = 7.273，p = 0.000004），这表明NOB可能通过葡萄糖代谢通路发挥作用。在对比过度照明组与对照组的GO分析中，上调的生物过程包括葡萄糖细胞刺激过程（富集 = 116.086，p = 0.008614）。下调的生物过程包括糖酵解（富集 = 11.494，p = 0.000012）。此外，与对照组相比，ALAN+NOB组的GO富集分析显示糖酵解过程上调（富集 = 13.82，p = 0.00000026）。这些结果提示NOB的作用可能与糖酵解过程的调节有关。转录组测序结果的RT-qPCR验证
基于高通量测序结果，采用RT-qPCR验证了斑马鱼脑部的糖酵解信号通路，如补充图5A所示。RT-qPCR的结果与转录组测序得到的结果一致，表明NOB可能调节了暴露于ALAN的斑马鱼的糖酵解信号通路。NOB逆转ALAN诱导的斑马鱼脑中L-乳酸水平下降
L-乳酸由星形胶质细胞释放，作为能量底物和信号分子来调节神经元功能（Magistretti & Allaman, 2018）。与对照组相比，ALAN组斑马鱼脑中的L-乳酸含量降低（补充图5B）。在ALAN组中，L-乳酸含量的减少得到了逆转。外源性L-乳酸补充缓解了ALAN组的抑郁样行为
为了探讨NOB是否通过激活糖酵解信号通路来缓解抑郁样行为，ALAN组接受了外源性L-乳酸的处理，并观察其对抑郁样行为的影响。外源性L-乳酸的施用缓解了ALAN组运动能力的下降（图5A）和异常的颜色偏好（图5B）。这还促进了更多的社会行为（图5C）和减少了焦虑行为（图5D）。此外，L-乳酸的施用抑制了单胺神经递质的紊乱（图5E）。![]()
图5 补充外源性L-乳酸减轻了ALAN组斑马鱼的抑郁样行为NOB与PKM2的相互作用
PK催化磷酸烯醇丙酮酸转化为丙酮酸，从而生成ATP。转录组测序揭示NOB处理相比对照组上调了PKM2的表达，而几种其他激酶（己糖激酶I/II [HKI/II]、6-磷酸果糖激酶 [PFK] 和乳酸脱氢酶 [LDH]）的表达没有显著差异。发现NOB与PKM2蛋白表面的一个凹槽结合，且形状互补性良好。结合能为−7.3 kcal/mol（图6A）。该结合凹槽具有亲水特性且疏水性较差，表明小分子主要通过亲水相互作用（静电相互作用）与受体结合以稳定结合。此外，NOB与PKM2蛋白的残基相互作用分析显示，结合位点主要是亲水性的（图6B）。如Asn75、Gly363、Lys367、Lys270和Asp178等残基与NOB形成亲水相互作用，而疏水性氨基酸如Tyr83和Ile299则与NOB的苯环相互作用。此外，Asn75和Gly363能够与配体形成氢键，促进它们的结合。![]()
最后，研究了NOB与PKM2蛋白结合的动力学。RMSF曲线描绘了PKM2蛋白中氨基酸残基的波动。在120–210 ns范围内，复合蛋白系统的RMSF波动显著低于简单蛋白系统，表明NOB结合后该区域的灵活性降低（图6C）。该区域是一个独立的结构域，接近NOB结合位点，表明NOB的结合减少了该区域的波动，并起到了稳定作用。基于MMGBA方程，计算使用了50–100 ns的轨迹，得出的NOB与PKM2蛋白之间的结合自由能为−30 kcal/mol（补充表2）。范德瓦尔斯势能（−40 kcal/mol）和静电相互作用（−19 kcal/mol）有利于结合，而极性溶剂化（34 kcal/mol）不利于结合。NOB缓解了PKM2抑制引起的抑郁样行为
使用PKM2特异性抑制剂Compound 3k诱导斑马鱼的PKM2抑制，并探讨NOB对PKM2抑制引起的抑郁样行为的影响。通过腹腔注射施用Compound 3k导致斑马鱼运动能力下降（图7A），表现为总运动距离和运动速率的减少。同时导致了异常的颜色偏好（图7B），表现为在蓝色和绿色区域的累积时间减少，而在红色和黄色区域的累积时间增加。此外，Compound 3k的施用还导致社会行为减少（图7C），表现为社会区域内次数和累积时间的减少，以及单胺神经递质的紊乱（图7E），表现为皮质醇和去甲肾上腺素的减少以及5-羟基吲哚乙酸的增加。NOB的补充改善了由PKM2抑制引起的这些变化。![]()
图7 NOB缓解了PKM2抑制引起的斑马鱼抑郁样行为讨论
在这项研究中，我们首先研究了NOB对由ALAN诱导的斑马鱼抑郁样行为的影响。NOB减轻了ALAN引起的斑马鱼运动能力下降、颜色偏好改变、社交行为减少和焦虑样行为增加。NOB缓解了皮层损伤和单胺类神经递质失衡，以及在暴露于ALAN的斑马鱼大脑中观察到的BDNF减少和细胞凋亡。NOB改善了24小时心率的异常，恢复了24小时自由活动的干扰，并改善了受ALAN影响的斑马鱼脑中时钟基因的表达模式。通过转录组分析和随后的RT-qPCR验证，确定了糖酵解信号通路在NOB的抗抑郁效果中扮演了重要角色。这些发现得到了NOB诱导的ALAN暴露斑马鱼大脑中L-乳酸积累增加的证实。此外，补充外源性L-乳酸缓解了抑郁样行为并恢复了ALAN暴露斑马鱼大脑中单胺类神经递质的失衡。NOB被发现能自发地与PKM2蛋白结合，引起PKM2蛋白构象变化，并拯救了由PKM2抑制引起的斑马鱼大脑中的抑郁样行为和单胺类神经递质失衡。情感和认知是大脑功能的表现形式，大脑代谢产物在一定程度上可以反映中枢神经系统功能。开放场测试常用于评估动物的运动活动和空间探索行为。在这项研究中，我们观察到与对照组相比，经过人工光夜（ALAN）暴露后，斑马鱼的运动减少，而这种减少通过NOB治疗得到了缓解。颜色偏好测试是评估记忆、认知功能障碍、神经退行性疾病、临床前疗效和毒理行为的有效方法。斑马鱼通常偏好蓝色和绿色而不是其他颜色，如红色和黄色。与对照组相比，ALAN组在蓝色和绿色区域花费的时间较少，表明正常颜色偏好模式受到了干扰，而NOB治疗可以恢复这种模式。斑马鱼以其高度的社会行为而闻名，通过测量社会互动提供了一个敏感的行为障碍评估模型。在这项研究中，我们观察到由于ALAN，斑马鱼进入社交区域的频率和在此区域的停留时间显著减少，而NOB干预可以恢复这种状态。抑郁常常伴随着焦虑，导致行为改变。黑白箱测试利用斑马鱼对明亮区域的自然厌恶和对黑暗区域的偏好。在这项研究中，ALAN导致了进入白色区域的行为增加，这种行为被NOB减弱。这些行为测试结果表明，NOB抑制了ALAN暴露的斑马鱼的抑郁样行为。中枢神经系统中单胺类神经递质的功能障碍是抑郁症发展的一个关键因素。去甲肾上腺素被认为是情绪唤醒的神经递质，其主要功能是诱导“战斗或逃跑”的行为，以及“恐惧和愤怒”的情绪。5-羟基吲哚乙酸是5-羟色胺的代谢产物，通常被认为是幸福和愉快感觉的贡献者。皮质醇是一种由下丘脑-垂体-肾上腺轴调节的糖皮质激素，在压力下释放，并与抑郁症和情绪障碍相关。在由不可预测的轻微压力诱导的大鼠抑郁样模型中，大鼠海马体中的去甲肾上腺素浓度降低，抗抑郁药物氟西汀显著增加了去甲肾上腺素的含量。文拉法辛加MT改善了斑马鱼由利血平诱导的抑郁样行为，并增加了斑马鱼大脑中的去甲肾上腺素水平。在这项研究中，NOB干预抑制了在ALAN暴露的斑马鱼大脑中观察到的皮质醇增加和去甲肾上腺素及5-羟基吲哚乙酸的减少。这些结果表明，NOB减少了由ALAN引起的斑马鱼单胺类神经递质的紊乱。昼夜节律是人类健康和代谢几乎所有方面的主控调节器，并且不仅与代谢综合征的关键组成部分有关，还与主要的共病，如睡眠障碍和抑郁障碍有关。几乎所有抑郁症患者都表现出显著的昼夜节律紊乱。完全扰乱昼夜节律足以在人类中诱导类似抑郁的行为。然而，昼夜节律变化是抑郁的原因还是结果尚不清楚。在这项研究中，使用了公认的昼夜节律障碍模型ALAN来构建类似抑郁的模型。斑马鱼时钟基因表达和24小时自由活动的变化，以及类似抑郁的行为和单胺类神经递质的干扰，表明模型构建成功。与ALAN组相比，NOB减少了类似抑郁的行为和单胺类神经递质的干扰。然而，转录组测序显示NOB+ALAN组的昼夜节律信号通路没有显著变化，表明NOB不是通过直接作用于昼夜节律的上游信号来发挥其效果的。尽管大脑只占体重的2%，但它消耗了20%的总能量，这使得它对能量代谢的波动极为敏感。值得注意的是，无论是脑部准备还是在人体内，乳酸都比葡萄糖更受青睐作为燃料。虽然在抑郁症模型中能量代谢的紊乱已被广泛记录，但糖酵解在抑郁症发病机制中的作用却常常被忽视。大脑在静息状态下表现出高度的糖酵解能力，而在激活时这一能力会进一步增强。然而，随着年龄的增长，大脑中的有氧糖酵解会下降，并与包括阿尔茨海默病、亨廷顿病和中风在内的多种脑部疾病相关联。这表明糖酵解在维持正常大脑功能中起着至关重要的作用。乳酸是糖酵解的关键产物，在组织中的浓度通常在0.5到20毫摩尔之间，细胞内的乳酸/丙酮酸比率可以从10变化到超过500。虽然丙酮酸不能抵消由神经元中MCT2下调引起的记忆障碍，但提高的内源性乳酸水平增强了学习诱导的mRNA翻译和Arc/Arg3.1表达。因此，乳酸不仅作为必需的能量底物，而且作为信号分子在周围器官和中枢神经系统中发挥作用。在常见的乳酸异构体（D-乳酸、L-乳酸和外消旋的DL-乳酸）中，由于人体内碳原子的不对称性，L-乳酸占主导地位。当突触活动增加时，从星形胶质细胞到神经元的L-乳酸转移被激活，这一机制被称为星形胶质细胞-神经元乳酸穿梭，这可能解释了突触活动和转移之间的能量耦合。L-乳酸已被确定为人类和动物模型中受伤时的神经保护剂。在易受压力影响的小鼠背内侧前额叶皮层中LDHA的过度表达足以恢复L-乳酸稳态，增加神经元兴奋性并减少抑郁样表型。在这项研究中，NOB上调了糖酵解信号通路，并增加了由人工光照引起的斑马鱼脑组织中L-乳酸的含量。补充了L-乳酸的ALAN组表现出减少的抑郁样行为和单胺神经递质的干扰。这些发现提供了NOB发挥其效应的机制是通过糖酵解信号通路的证据。NOB是一种具有六个甲氧基的天然小分子，具有良好的亲脂性和高渗透性。对NOB的X射线晶体结构研究表明，存在色烯和芳香烃环，以及结合的甲氧基，使得NOB成为一个手性分子，能够采取多种构象。这种分子的灵活性使得NOB能够与特定信号通路的多种靶向受体相互作用，从而发挥广泛的生理活性。值得注意的是，糖酵解中的关键分子靶点包括HKII、PFK、PKM2和LDH。与ALAN组相比，ALAN+NOB组中的PKM2显著不同。相比之下，这些靶点如HKI/II、PFK和LDH之间没有显著差异。分子对接和动力学模拟表明，NOB自发地与PKM2蛋白结合，亲水相互作用是主要驱动力。NOB与Asn75和Gly363形成了氢键。与NOB结合后，PKM2蛋白的构象在小幅度波动后稳定下来，始终保持紧凑结构。这些结果表明PKM2可能是NOB的分子靶点。我们使用化合物3k构建了一个斑马鱼模型，在该模型中PKM2被抑制。在这个模型中，斑马鱼表现出抑郁样行为和单胺神经递质失衡。NOB补充抑制了这些变化，表明NOB通过靶向PKM2表现出抗抑郁效果。应该指出的是，这项研究专注于NOB的抗抑郁效果。目前尚不清楚是NOB还是其代谢产物导致了观察到的效果。在实际的斑马鱼大脑中，存在代谢产物，主要是单去甲基橙皮素和双去甲基橙皮素。研究表明，NOB的去甲基化代谢产物比NOB具有更强的生物活性。未来，需要进一步探索NOB去甲基化代谢产物的抗抑郁效果。结论
NOB激活PKM2，通过上调糖酵解信号通路，促进L-乳酸在斑马鱼大脑中的积累。这有效地缓解了由ALAN暴露引起的斑马鱼的抑郁样行为。这项研究不仅为NOB的开发和利用以及其在预防和治疗抑郁症中的潜在应用奠定了科学基础，而且还提出了适用于其他天然植物化合物的更广泛的研究概念。方法与材料
NOB（纯度：> 95%）购自湖南中国联源康路生物技术有限公司。褪黑素（MT）（纯度：> 99%；M8600）、L-乳酸含量检测试剂盒（BC2235）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（PC0020）、L-乳酸（IL0540）购自北京索拉布莱科技有限公司（北京，中国）。去甲肾上腺素（LCSJZF95639）、5-羟基吲哚乙酸（LCSJZF886033）和皮质醇（LCSJZF96911）的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购自厦门伦昌硕生物技术有限公司（福建，中国）。RNA分离剂总RNA提取试剂（R401–01）、HiScript III 1st Strand cDNA合成试剂盒（+gDNA wiper）（R312–01）和ChamQ SYBR qPCR Master Mix（High ROX Premixed）试剂盒（Q341–02）购自南京诺维赞生物科技有限公司（南京中国）。化合物3k（S8616）购自Selleck Chemicals LLC（德克萨斯州，美国）。动物来源、分组和处理
鉴于AB型野生斑马鱼比TU型野生斑马鱼表现出更强的昼夜节律，我们使用AB型野生斑马鱼作为动物模型。研究方案已获得首都医科大学伦理委员会的批准（北京，中国）。3-4个月大的雄性AB型野生斑马鱼是从中国武汉的国家斑马鱼资源中心购买的。鱼所在的循环水温度为28 ± 0.5°C，鱼所在的房间温度也是28 ± 0.5°C（由中央空调控制）。成年斑马鱼每天两次（早晨和傍晚）喂食新孵化的卤虫卵。提供的食物量足够在5分钟内被消耗掉。喂食期间关闭循环水的进水和出水阀门，喂食后打开。经过一周的适应性喂食后，斑马鱼按以下方式分组：a)为了研究NOB在缓解由ALAN诱导的抑郁样行为中的潜力，每天在20:00时向水产养殖水中添加NOB（0.5 μM），持续20天。在NOB预处理后，将斑马鱼暴露于ALAN和NOB（0.5 μM）中，再持续20天。共有四个组：（1）正常光照（对照组）（2）由ALAN诱导的抑郁样模型（ALAN组），（3）ALAN+MT组和（4）ALAN+NOB组。正常光照组从07:00到21:00暴露于光线下14小时，随后从21:00到07:00暴露于黑暗中10小时。ALAN组则连续24小时暴露于光照下。在ALAN+MT（1 μM）和ALAN+NOB（5 μM）组中，分别在20:00到21:00之间向水产养殖水中添加MT或NOB。b)为了初步探索NOB抗抑郁效果的潜在机制，研究包括了以下几组：（1）对照组，（2）ALAN组，以及（3）ALAN+NOB组。c)为了调查外源性L-乳酸补充是否抑制了抑郁样行为，设置了三组：（1）ALAN组，（2）ALAN+L-乳酸组和（3）L-乳酸（100 μM）组，L-乳酸在20.00至21.00小时之间加入培养水中。d)为了调查NOB是否通过PKM2缓解抑郁样行为，NOB（0.5 μM）在预处理20天后，每天20.00至21.00小时加入培养水中。然后将斑马鱼暴露于化合物3 k（一种PKM2抑制剂），同时继续接受NOB干预20天。共有三组：（1）对照组（正常光照），（2）化合物3 k组和（3）化合物3 k+NOB组。化合物3 k（3 μM, 10 μL）每天通过腹腔注射给药。干预后，将斑马鱼放置在冷水混合物中20-30分钟，直到它们的鳃停止移动，心脏停止跳动，这符合欧盟关于保护动物和杀死斑马鱼的方法的指令（引用）。然后收集斑马鱼样本，一部分用4%的多聚甲醛在室温下固定，另一部分立即放入液氮中，然后储存在-80°C。检测体重、体长和心率
使用电子数显卡尺测量斑马鱼的体长，使用电子天平记录斑马鱼的体重。使用体视显微镜测量心率。开放场测试
行为实验在12:00至15:00之间进行，因为斑马鱼的活动在这段时间内相对稳定。使用Noldus公司的Danio Vision斑马鱼行为轨迹跟踪系统（荷兰瓦赫宁根）在一个安静的房间里监测斑马鱼的行为，房间温度保持在28 ± 0.5°C。每条斑马鱼单独放置在一个直径30厘米、高15厘米的圆形水槽中。一个光源（500勒克斯的荧光灯）被放置在水槽上方。一个电荷耦合器件摄像机被放置在顶部以记录斑马鱼的运动轨迹。每条斑马鱼测试5分钟。使用Noldus软件（荷兰瓦赫宁根）分析斑马鱼的行为参数。测试前，斑马鱼在开放场中适应5天以确保适应。色彩偏好测试
使用十字迷宫测试评估斑马鱼的色彩偏好。十字迷宫的每个臂长为20厘米×8.8厘米。四个臂分别覆盖着四种不同颜色的聚丙烯片（蓝色、绿色、红色和黄色），而十字迷宫的中心部分（8.8×8.8厘米）是透明的。测试前，斑马鱼在开阔场适应了5天以确保适应环境。社交行为测试
使用十字迷宫测试来观察斑马鱼的社交行为。十字迷宫的每个臂长为20 × 8.8厘米。十字迷宫的一个臂通过一个透明隔板分成两个相等的部分。将三条斑马鱼放在有隔板的一侧（称为“伙伴侧”），将一条斑马鱼放在没有隔板的另一侧（称为“空白侧”）。测试前，斑马鱼在开阔场适应5天以确保适应。焦虑行为测试
使用黑白箱评估斑马鱼的焦虑行为，该箱是一个长22厘米、宽14厘米、高14厘米的矩形水槽。水槽的一侧是白色且明亮的，而对面是黑色且不亮的。测试前，斑马鱼在开阔场地适应5天以确保适应。24小时心率记录
在干预的第19天或第20天，使用立体显微镜在昼夜节律时间（CT）1、CT7、CT13、CT19和CT25记录每条斑马鱼的心率。每组有13条斑马鱼。将斑马鱼置于含有200微克/升的三卡因的培养水中进行麻醉。斑马鱼在1分钟内进入麻醉状态。此时，斑马鱼不游泳，但它们的心脏正常跳动。使用立体显微镜记录每条斑马鱼的心率，并记录数据。实验结束后，立即将斑马鱼转移到正常的斑马鱼培养水中，它们在1分钟内恢复正常的运动。24小时自由运动测试
在干预的第15天或第20天，每天监测斑马鱼在圆形水槽中的自由游泳表现。圆形水槽的直径为30厘米，高度为15厘米。使用Noldus软件分析斑马鱼在24小时周期内的行为参数。测试前，斑马鱼在开放场适应5天以确保适应。苏木精-伊红（H&E）染色
斑马鱼脑组织用4%的多聚甲醛固定并处理。首先，组织被脱水，然后包埋在石蜡中。接着，组织被切片，脱蜡并用H&E染色。染色后，切片再次脱水并用中性树胶封片。最后，干燥的切片使用病理切片扫描仪扫描，并捕获图像。单胺类神经递质测试
干预后，在立体显微镜下解剖斑马鱼大脑，并立即进行后续分析。将斑马鱼大脑放入无RNase的研磨管中，加入200微升预冷的含有1% PMSF的DPBS。然后在4°C预冷的组织破碎仪中将大脑匀浆。匀浆条件为：4.0 M/s，60秒，4°C；静置60秒，4°C，重复五次。随后，样本在5000转/分钟下离心10分钟，收集上清液。根据制造商的说明，使用ELISA试剂盒检测斑马鱼脑组织中的去甲肾上腺素、5-羟基吲哚乙酸和皮质醇的含量。使用BCA试剂盒测量脑组织中的总蛋白浓度，并用作内部参考。逆转录（RT）和实时定量聚合酶链反应（qPCR）
使用RNA提取试剂从样本中提取并纯化总RNA。随后，使用HiScript III 1st Strand cDNA合成试剂盒（+gDNA擦除剂）对500纳克的RNA进行逆转录。使用ChamQ SYBR qPCR Master Mix进行实时PCR。用于斑马鱼qPCR的引物在补充表1中显示。温度程序设置如下：（1）95°C 30秒；（2）95°C 5秒，55°C 10秒和75°C 15秒，总共40个循环。反应后，确定基因的定量循环（Cq）值，并使用actb作为内参基因，通过2-ΔΔCt方法计算目标基因的相对mRNA表达水平。转录组测序
在第2.2(b)节描述的处理后，斑马鱼脑组织被用于转录组测序。根据制造商的说明，每个重复组中的六条斑马鱼的脑部被解剖并混合在一起，使用RNA隔离剂总RNA提取试剂进行总RNA提取。通过2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量。所有样本均显示出与28s和18s的两个rRNA相对应的清晰条带，5s处没有明显的rRNA降解迹象，表明RNA纯度高且完整性好。使用Nano Photometer分光光度计（Implen, 慕尼黑，德国）进一步确认了RNA的纯度，并使用RNA Nano 6000检测试剂盒（Agilent, CA, 美国）评估了RNA的完整性。所有样本的OD260/280均为2.0，所有样本的RNA完整性数值在8.0到9.1之间，确认了RNA适用于后续的测序分析。对于转录组测序的文库制备，每个样本准备了1微克的RNA。使用NEBNext Ultra™ RNA文库制备试剂盒（New England Biolabs, NEB）为Illumina®制备测序文库，并将索引代码整合到属性序列中。PCR产物在安捷伦Bioanalyzer 2100系统（AMPure XP系统，加利福尼亚州，美国）上进行纯化，然后评估文库质量。带有索引编码的样本随后在cBot Cluster Generation System上使用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS（Illumina，加利福尼亚州，美国）进行聚集。聚集后，文库制备在Illumina Novaseq平台上进行测序（加利福尼亚州，美国），生成150个碱基对的成对末端读取。Illumina Novaseq平台生成的原始图像数据通过CASAVA基呼叫分析，生成了FASTQ格式的原始数据文件。使用FsatQC对原始数据文件的质量进行了视觉评估，以确保高质量的原始数据。使用Trimmomatic对原始数据进行了处理和过滤，以减轻偏差并获得干净的数据。随后，计算了干净数据的Q20、Q30和GC含量。使用R包pheatmap（版本：1.0.12）基于差异表达的mRNA进行了层次聚类分析。使用DESeq2进行了差异表达分析，具有≥1.5倍变化和p值<0.05的基因被认为是差异表达基因（DEGs）。GO富集分析的筛选显著性阈值设定为p < 0.01。对于信号通路富集分析，设定为p < 0.05。L-乳酸测试
在第2.8节描述的干预措施后，斑马鱼的大脑在立体显微镜下被解剖。然后将它们匀浆，并收集上清液。按照制造商的说明，使用L-乳酸含量检测试剂盒检测斑马鱼大脑中的L-乳酸含量。使用BCA试剂盒测量脑组织中的总蛋白浓度，并用作内部参考。分子对接和分子动力学
NOB的SDF结构从PubChem检索出来，转换成PDB格式，并使用PyMOL存储。然后在AutoDock工具程序中加载，分配原子类型，并添加原子电荷。结果（分子对接配体）随后以PDBQT格式保存。PKM2的PDB结构（ID: P14618）直接从AlphaFold检索，加载到AutoDock工具程序中，并通过分配原子类型、添加原子电荷并以PDBQT格式保存，作为分子对接的接受体进行类似处理。使用AutoDock Vina 1.1.2执行分子对接。配体被指定为灵活的，而受体被指定为刚性的。搜索精度的详尽程度调整为100，而所有其他参数保持在默认设置。对接盒子的尺寸和中心坐标如下：中心x = 1.05，中心y = 4.61，中心z = 9.88，尺寸x = 60，尺寸y = 60和尺寸z = 60。选择具有最低结合分数（亲和力 = −7.3 kcal/mol）的构象进行后续的分子动力学分析。使用Amber18软件包进行了PKM2蛋白和NOB-PKM2蛋白复合物的分子动力学模拟，这些复合物是通过分子对接获得的。PKM2蛋白使用ff14SB力场参数进行参数化，而NOB使用gaff通用力场参数进行参数化。通过ANTECHAMBER模块计算了AM1-BCC原子电荷。将PKM2蛋白或NOB-PKM2蛋白加载到tleap模块中，在那里自动添加氢原子和反离子以中和电荷。选择了TIP3P显式水模型和周期性边界条件。分子动力学模拟工作流程包括四个步骤：能量最小化、加热、平衡和生产动力学。最初，对NOB和PKM2蛋白的重原子进行了约束，然后使用10,000步对水分子进行能量最小化，包括5000步最速下降法和5000步共轭梯度法。随后，释放了约束，整个系统进行了10,000步的能量优化。然后系统在50皮秒内缓慢加热至300 K，接着在NPT系综下平衡50皮秒。最后，进行了持续100纳秒的系统分子动力学模拟，使用NPT系综和2飞秒的时间步长。轨迹数据每20皮秒保存一次。使用CPPTRAJ模块进行了分析。使用MMPBSA.py模块计算了NOB-PKM2蛋白的结合自由能。统计分析
所有实验均独立进行三次或更多次，数据以平均值 ± 标准误差（mean ± SEM）表示。统计分析使用IBM SPSS Statistics 26.0（芝加哥，伊利诺伊州，美国）进行。首先，评估数据分布的正态性。然后，检查正态分布数据的方差齐性。如果满足方差齐性的假设，则使用学生t检验或方差分析（ANOVA）比较两个组。对于非正态分布的数据，使用非参数检验。在所有分析中，p < 0.05（双尾）被认为是统计学上显著的。原文地址：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0308814624029789?via%3Dihub
注：因文章篇幅有限，所有相关引用文献，以及补充素材可以点击至原文查阅。
苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过六年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。![]()
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