【文献解读】如何优化斑马鱼神经科学研究的饲养条件
文摘
科学
2024-09-27 17:00
江苏
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文献：Tsang B, Gerlai R. Nature versus laboratory: how to optimize housing conditions for zebrafish neuroscience research. Trends Neurosci. 2024 Sep 21:S0166-2236(24)00156-5. doi: 10.1016/j.tins.2024.08.013. Epub ahead of print. PMID: 39307630.
杂志：TRENDS IN NEUROSCIENCES
尽管斑马鱼（Danio rerio）在神经科学研究中的应用迅速增长，但关于如何在研究实验室中饲养这些鱼的基本问题仍然未得到充分研究。这或许可以解释斑马鱼设施中使用的多样化实践和环境参数的广泛范围。在本文中，我们提供了这些参数和实践的示例，包括饲养密度、鱼缸大小和水质化学成分。我们讨论了随机共振与稳态的原则，并提供了假设性示例，以解释为何将斑马鱼置于其可耐受的环境参数范围之外可能增加表型变异并降低可重复性。我们呼吁进行系统研究，以确立斑马鱼的最佳饲养条件。此外，我们还讨论了了解该物种的自然行为和生态如何为这些研究提供指导原则的重要性。斑马鱼在神经科学研究中的崛起及其饲养条件的紧迫问题
斑马鱼已成为生物学领域的主要研究生物之一，全球有超过10万名科学家使用斑马鱼进行研究。在神经科学领域，每年发表的斑马鱼研究数量迅速增加。对这种鱼的兴趣增长可能源于多种因素，其中之一是它在系统复杂性与实际简单性之间提供了合理的妥协。作为一种脊椎动物，斑马鱼与更高阶的脊椎动物具有许多保守的进化特征。同时，它体积小，便于在实验室中大规模饲养，且维护成本低。此外，斑马鱼允许采用还原主义的方法，通过仅有数十万个神经元的约5立方毫米的大脑来发现与我们自身生物学相关的进化古老的核心方面。在这篇观点论文中，我们认为不理想的饲养条件可能导致表型变异增加和实验结果的可重复性降低。我们还主张，需要对各种环境参数的影响进行系统的参数分析，以优化饲养条件，同时，斑马鱼研究也可以从对该物种的行为学和生态学的更好理解中受益。尽管我们专注于斑马鱼，因为这一物种在神经科学研究中相对较新，且上述问题尤其紧迫，但我们提出的许多观点同样适用于其他在生物医学研究中使用的实验室生物。随着对斑马鱼研究的积累，越来越复杂的研究方法也相继被开发。这些方法如今可以调查生物对实验操作的更细微反应。例如，实验室开始探讨斑马鱼的学习与记忆过程以及决策行为。斑马鱼还被用于毒理学筛查，已开发出多种行为表型的测定方法。许多研究探讨了胚胎期酒精暴露的影响，声称斑马鱼在模拟人类胎儿酒精谱系障碍方面具有实用性。不同的斑马鱼近交系在多种表型上存在差异，包括群游行为的发展。这些日益复杂的研究往往处理较小的效应量。因此，与早期斑马鱼研究中胚胎学家寻找对器官发育的重大基因效应不同，生物学家现在旨在发现实验操作的小效应。为此，需要采用减少表型变异的复杂方法。尽管包括神经科学技术在内的实验生物学方法迅速发展，提高了斑马鱼研究的精确性，但一个重要领域仍然基本停滞，即什么构成最佳饲养条件（即如何维护斑马鱼）。虽然已经制定了关于如何在实验室中饲养、繁殖和喂养斑马鱼的标准协议，但这些往往依赖于轶事观察和传统。我们认为，实验室环境因素及其对该物种影响的系统参数分析是必要的。此外，这些“标准”协议在不同实验室之间差异显著。例如，文献综述显示不同斑马鱼研究和设施在水的电导率（盐度）、温度、光强度和波长、食物类型、鱼缸大小和鱼密度等方面存在变化（表1）。这些不一致的做法在斑马鱼社区引发了关注。事实上，美国国家卫生研究院在2017年召开了一次会议，专门讨论这个问题并寻找解决方案。不幸的是，会议参与者未能确定上述及许多其他饲养参数的最佳值。根据这次会议，发布了一份报告，强调在所有斑马鱼研究中详细描述饲养条件参数的必要性，以提高结果的可重复性。该报告的作者还指出：“这一缺乏一致性的问题对研究的可重复性构成潜在威胁。”人们本以为大多数问题已得到解决，但对文献的进一步审查，以及2024年举行的关于这些问题的会议，表明问题依然存在。![]()
斑马鱼饲养条件缺乏一致性可能并不是唯一的问题，甚至可能并非主要问题。此外，尽管报告每个斑马鱼研究中使用的各种环境参数的确切值是必要的，但这可能不足以解决问题。我们认为，当前斑马鱼研究和饲养的主要问题在于，我们尚未了解该物种的最佳环境参数是什么，或这些环境参数的上下耐受阈值可能是什么。那么，为什么将斑马鱼置于假定的最佳范围之外会是一个问题呢？毕竟，可以认为如果控制组和实验组的斑马鱼在同一环境条件下饲养，则这两个组的统计比较是有效的，因为不理想性应对两个组的影响相同。然而，认为斑马鱼在远离最佳条件的情况下饲养会增加所测表型的变异性。不适当的实验室条件：增加环境诱导的表型变异性与降低可重复性随机共振是物理学中的一个概念，描述了当信号太弱而无法被传感器检测时，通过添加噪声可以使信号增强并变得可检测。尽管这一概念源于物理学，但可转移到生物学等多个学科。在生物学中，随机共振可以被视为稳态概念的对立面。稳态是指环境波动（即噪声效应）的影响被最小化，从而使有机体的表型变化减小或难以检测。然而，我们认为，当有机体面临极端环境条件时，稳态对外部变异的补偿可能会失效，随机共振的概念变得尤为相关。也就是说，当这些条件接近有机体在自然界中演化所能耐受的环境参数的阈值时，随机共振可能会发生。在这一阈值附近，环境参数的波动将导致部分个体的生物表型发生变化，从而增加种群中表型值的变异性。这种表型变异的增加本质上是生物系统对挑战的非线性反应结果，在这种情况下，是由于不理想的条件。已有多种生物现象表明了不理想条件下表型变异的增加。例如，不理想条件在细菌种群中被发现引发了变异性增加，在其他更复杂物种的生理表现中也有类似的发现。这些条件还被证明会增加动物的行为反应变异性，并导致个体内部认知表现的变异增加。因此，当环境参数接近最佳值时，斑马鱼的表现预计会更为一致。然而，当环境参数偏离最佳值时，一些斑马鱼可能会表现出显著的表型变化，而其他则保持接近种群的平均水平。这意味着整体种群表现出更高的环境诱导变异性。这是为什么呢？以下是两个关于成年斑马鱼的具体例子：食物可获得性和鱼密度。斑马鱼是一种小型掠食者，以落入水中的小型水生和陆生昆虫为食。当这些昆虫易于获得时，局部种群中的所有斑马鱼都能摄取足够的食物，保持健康，并表现出正常的脑功能和行为。即所有鱼类的健康状况良好，因此种群中的变异性较低。然而，当食物稀缺或不合适时，个体之间的竞争会加剧。较大、较健康的鱼能够更有效地捕捉更多昆虫，从而在不理想的条件下保持良好的饲养状态，并展现出该物种特有的行为和生物功能。相反，较弱或较小的个体则难以应对暂时的食物短缺，或者面临捕食较大或难以捕捉的昆虫的困难。因此，这些个体会在不理想条件下遭受更多影响，导致整体种群经历较高的环境诱导变异性。鱼密度的情况也类似，过高的密度会导致竞争加剧，而过低的密度则会增加捕食风险，并使获得最佳觅食更加困难。几乎所有环境参数都可以设想类似的假设性例子。我们特意使用“设想”一词，因为目前尚未收集到斑马鱼的此类实证数据。然而，环境参数的值在自然界中确实会波动，许多记录显示在环境条件更加极端时，种群的繁殖成功率会变得更加不稳定。实验室中的环境条件是否比自然界更为极端？我们能否从自然中学习并相应地调整斑马鱼的饲养方法，以使这些参数更接近斑马鱼的最佳值？这些是我们接下来要考虑的问题。如何从自然中学习：生态学与行为学相结合的实验斑马鱼研究在假设性例子中，容易设想出“最佳”存在。但是，什么是最佳？什么样的盐度、食物的种类和数量、鱼的密度等才是合适的？换句话说，如何找到斑马鱼在生物学、生理学、行为和脑功能上理想运作的环境参数范围？不幸的是，斑马鱼相关文献在这方面缺乏具体性。几乎没有系统性分析研究环境参数的变化如何影响斑马鱼。当前的方法大多依赖于轶事、习惯做法或在水族爱好者杂志中流传的信息。这其中一个原因可能是，进行系统性参数分析耗时且开始研究的问题往往并不简单。研究人员认为，进行这类系统研究的一种方法是向自然学习。我们可以从斑马鱼自然栖息地中的典型值开始，这些值是斑马鱼在进化过程中适应的，也是它们目前在野外生活的环境。尽管这方面的文献较少，亟需大幅扩展，但已有一些研究探索了斑马鱼的自然栖息地和行为。我们将重点讨论一些在斑马鱼实验室与自然记录显著偏离的环境参数。许多环境参数对成年和幼年斑马鱼都非常重要，且在实验研究中需要被报告。我们认为，随着对这些参数的系统研究数量增加，这份清单还应继续扩展。接下来，我们以斑马鱼的饲养条件与其自然适应环境的具体例子为例：盐度或通常在斑马鱼设施中测量的电导率。电导率取决于水中离子（盐）的浓度。在斑马鱼的自然栖息地，电导率范围在10到271 μS/cm。这一范围内的变化受到地理和时间因素的影响，因为电导率取决于特定位置水体周围的岩石/土壤类型以及该地区的降雨量。例如，如果土壤中含有碳酸钙，电导率会较高，而在季风季节，由于雨水几乎不含盐，电导率会降低。自然环境中的电导率范围与大多数研究人员在实验室中维持斑马鱼的方式形成鲜明对比。大多数实验室使用的系统水电导率约为1000 μS/cm，部分实验组甚至高达3000 μS/cm（见表1）。有报道显示，有些实验室的电导率高达9000 μS/cm。设施管理者可能偏好高盐度，因为这在一定程度上具有抑菌作用，并且可能减少藻类生长，从而使鱼缸看起来更干净。然而，高盐度可能对鱼的肠道微生物群产生不利影响，并可能负面影响生物过滤（即通过细菌去除有机废物的有毒副产品）。此外，目前尚不清楚这些高盐浓度如何影响斑马鱼的生物学，包括脑功能。人工提高的盐度是否构成重要的压力源，并且是否以某种方式改变鱼的生理，进而干扰或影响实验操作？这些都是尚待回答的许多问题（参见突出的疑问）。值得注意的是，研究显示盐度差异（50 μS/cm与600 μS/cm）能显著影响斑马鱼最典型的行为之一：群游。在50 μS/cm条件下测试的鱼表现出典型的群游反应（即游向并保持在活动的同类图像附近），而在600 μS/cm水中测试的鱼则表现出相反行为，实际上是避免同类图像。需要注意的是，50 μS/cm在斑马鱼自然栖息地的电导率范围内，而600 μS/cm虽然低于大多数斑马鱼设施推荐的电导率，但仍超过自然环境中记录的最高值的两倍。斑马鱼设施中使用的水盐成分（即盐的种类）与其自然栖息地的成分显著不同。在大多数斑马鱼设施中，水首先通过反渗透（R/O）系统过滤，这样能去除水中大部分溶解的离子和分子。然后，这些水会添加特定的盐以达到所需的电导率。这种方法的理念在于，R/O能去除所有杂质（如潜在的微量元素和毒素），并通过特定盐重构水质，以避免水质波动。原则上，这种方法是合理的，但在实践中却存在问题。大多数斑马鱼设施，包括我们自己的，使用的海盐（如Instant Ocean，Blacksburg VA, USA）是根据热带海洋的盐混合物配制的，其中90%以上为氯化钠（NaCl）。然而，斑马鱼的自然水域中，钠（Na）的含量少于钙（Ca）或镁（Mg）盐。简单来说，斑马鱼在自然中并不生活在稀释的海水中。缺乏钙或镁盐在斑马鱼设施中如何影响其骨骼发育、肾功能、突触传递和其他众多生物功能，仍不清楚。接下来我们考虑的例子是空间，即用于饲养和测试鱼类的容器大小。与此相关且同样重要的参数是鱼密度（即在特定水体积中饲养的鱼数量）。文献回顾再次显示，斑马鱼的饲养条件差异很大（见表1）。在一个极端，有的研究者将完全成熟的斑马鱼饲养在仅1升的小鱼缸中，而在另一个极端，则使用150升的饲养缸。值得注意的是，斑马鱼实验室中最常见的鱼缸尺寸在3至10升之间，而水族爱好者推荐的斑马鱼缸至少为40升。鱼密度在不同设施之间也差异显著，从每升15条鱼到仅0.5条鱼不等。如同之前讨论的其他参数，实验室中鱼缸大小和鱼密度的变化只是问题的一方面。另一方面，斑马鱼是否进化以适应这些条件（即拥挤的环境是否对它们的健康有害并导致实验室种群表型变异增加）也是值得考虑的。首先，让我们看看斑马鱼在自然中的生活状况。如前所述，斑马鱼生活在亚洲的热带淡水溪流、河流、浅稻田和池塘中，通常成群结队，群体从几条到数百条不等。它们通常在水体的上层到中层游动，通常靠近水生植物。因此，斑马鱼是一种典型的鲤科鱼类，属于开放水域的群游物种。那么，为什么要将斑马鱼饲养在小鱼缸中呢？这种饲养和测试方法是否对其生物学、脑功能和行为产生负面影响？尽管回答这些问题的研究刚刚开始，但结果已经表明小鱼缸和高鱼密度确实具有有害影响。例如，急性乙醇处理对幼鱼的影响在大孔板（六孔板）中才被检测到，而在小孔板（即96孔板）中则未能发现。结果还表明，小孔板诱发了压力/焦虑反应，而大孔板则没有，这可能是急性酒精效应未能在小孔板中检测到的原因。与此相符的一项最近研究考察了迷幻药物psilocybin对行为的影响，发现大测试场所能更好地检测到行为变化，因为幼斑马鱼在这样的场所表现出更丰富的行为。除了数据表明测试缸的体积很重要，还有证据表明，饲养缸的大小和鱼的密度也起着作用。在这项研究中，作者进行了一个3×3的组间研究，探讨了缸大小和鱼密度作为两个独立因素对斑马鱼行为的潜在影响。他们发现缸大小与焦虑相关行为反应呈负相关。有趣的是，作者还发现缸大小和鱼密度相互影响某些行为，而其他行为则独立受到这两个因素的影响。他们得出的结论是，在他们的研究中，较大的缸（10–50升）和中等密度的鱼（2条鱼/升）是饲养成年斑马鱼的最优方法。最后，我们考虑的主题是环境丰富化。环境丰富化已成为动物饲养中的热门词汇，因为人们意识到将动物饲养在贫瘠的笼子或水族箱中可能不合适。相关文献日益增多，表明一种结构化的环境，能在某种程度上模仿研究物种的自然栖息地，是有益的。举个鼠类研究的例子，老鼠和大鼠的笼子现在常配备隧道、攀爬平台或可咀嚼的小物件。数据也表明，环境的物理结构以及研究物种的行为特征都是重要的。例如，在自然中，动物并不会随时随地获得食物和水。让动物“工作”以寻找和获取这些资源，早已被证实对其有益，例如能提高被圈养物种（包括农业物种）的幸福感和健康状况。在这一方面，斑马鱼的文献也在跟进（有关最近的综述，见参考文献64）。例如，研究发现，斑马鱼倾向于选择带有模仿水生物种的塑料植物和沙底图像的缸的一侧，而不是贫瘠的一侧。事实上，这种偏好非常强烈，以至于这些“自然”刺激可以用作一种条件反射学习任务中的无条件刺激。在这个任务中，斑马鱼表现出强大的联想记忆获得能力，学习速度超过了大多数其他学习任务。最后，活水生植物作为丰富化选项的使用也开始受到关注。斑马鱼似乎在系统复杂性和实践简单性之间达成了合理的妥协，预计将继续成为一种优秀的实验室研究物种，其与人类疾病（包括脑部疾病）的模型建立和机制分析具有高度的转化相关性。现有的生物研究方法日益丰富，包括神经科学和重组DNA技术，随着斑马鱼相关出版物数量的激增，这些都清楚地表明了这一点。然而，随着斑马鱼使用的增加和实验方法的日益复杂，迫切需要研究如何在实验室中维持该物种的基本问题（见“待解决的问题”）。我们认为，必须系统性地分析可能影响斑马鱼生物学（包括脑功能和行为）的多个环境因素。也就是说，需要对这些因素进行参数化修改和控制，并实验性地分析这些修改的影响。我们认为，当前实验室中饲养斑马鱼的方法多样性不合适，主要有两个原因。首先，实验室特定的饲养方法和条件的个别差异造成了可重复性问题。其次，对于斑马鱼而言，若多个环境因素的最佳值范围尚不明确，则鱼群在超出最佳范围时可能会表现出更高的表型变异。换句话说，可重复性问题可能在不同设施之间（设施特有环境）以及同一设施内部都存在。正如几十年前对家鼠提出的建议那样，更加关注自然（即该物种的生态和行为学）对于指导实验室实践至关重要。我们建议，这种方法应成为未来系统性研究斑马鱼饲养和维持的指导原则。原文地址：https://www.cell.com/trends/neurosciences/abstract/S0166-2236(24)00156-5?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS0166223624001565%3Fshowall%3Dtrue
注：因文章篇幅有限，所有相关引用文献，以及补充素材可以点击至原文查阅。
苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过六年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。![]()
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