【文献解读】利用斑马鱼模型探索LECT2在肝外炎症免疫中的功能和潜在机制
文摘
科学
2024-10-25 17:01
江苏
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文献：Huang Z, Yang X, Qin X, Chen K, Liu W, Xu J, Li J, Zhang W, Huang Z. Localized production of LECT2 by orthotopic histiocytes during inflammation. J Genet Genomics. 2024 Oct 4:S1673-8527(24)00255-8. doi: 10.1016/j.jgg.2024.09.017. Epub ahead of print. PMID: 39369817.
杂志：Journal of Genetics and Genomics
白细胞源性趋化因子2（LECT2）最初被鉴定为由肝细胞分泌的一种多功能蛋白质，参与多种肝脏病理生理过程，同时也是肾淀粉样变性和肝淀粉样变性中一种显著的淀粉样纤维蛋白。近期，LECT2被发现在包括肝细胞癌（HCC）、非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）、脓毒症、动脉粥样硬化、关节炎和过敏性疾病在内的多种病理过程中的免疫过程中发挥作用。然而，LECT2在非肝脏组织中的表达和功能尚不清楚，其调节肝外免疫反应的机制也知之甚少。本研究旨在进一步阐明LECT2在介导肝脏疾病以外的炎症和免疫反应中的潜在机制，同时全面绘制LECT2的表达图谱，以加深我们对LECT2在肝病学之外重要性的理解，并探索LECT2相关疾病的潜在治疗策略。斑马鱼具有光学透明性和保守的免疫系统，是研究基因表达和免疫反应的成像研究的理想模型。在本研究中，我们使用了斑马鱼模型来探索LECT2在免疫中的功能和潜在机制。在斑马鱼中，lect2基因由三个冗余的基因拷贝组成：lect2.1、lect2.2和lect2.3，它们的表达模式和功能尚未明确。序列分析显示，这些基因与人类LECT2的同源性有所不同，其中Lect2.1的同源性最高（59.49%）（图S1A和S1B）。在斑马鱼胚胎的单细胞测序中，lect2.1在Fabp10a+肝细胞中高表达，而lect2.2和lect2.3几乎检测不到（图S1C）。这些发现通过1个月大斑马鱼肝脏的定量实时聚合酶链反应（RT-qPCR）分析得到了证实（图S1D）。综上所述，Lect2.1最有可能是哺乳动物LECT2的同源基因。传统上认为LECT2是哺乳动物中肝脏特异性的细胞因子，但这并未全面反映其在不同组织和器官中免疫过程和淀粉样变性中的复杂作用。在这里，我们使用整体原位杂交（WISH）技术追踪了斑马鱼幼虫中lect2.1的表达。我们发现，在受精后36小时（hpf），lect2.1转录信号起源于尾部造血组织（CHT），并在整个发育过程中持续表达（图S2A）。到受精后4天（dpf），肝脏中也出现了强烈的lect2.1信号（图1A和S2A）。接下来，我们生成了一个报告基因品系Tg(lect2.1:eGFP)，该品系成功再现了内源性lect2.1的表达模式（图S2B、S2C、S2H）。将Tg(fabp10a:DsRed)与Tg(lect2.1:eGFP)进行杂交显示，lect2.1+（eGFP+）细胞在肝脏中与肝细胞标志物Fabp10a共定位（图1B）。值得注意的是，在肝脏外也发现了lect2.1+细胞，它们与中性粒细胞标志物Lyz共定位（图1C）。相反，lect2.1+细胞不与红细胞、巨噬细胞或淋巴细胞共定位（图S2D–S2F）。综上所述，我们的结果表明lect2.1在肝细胞和中性粒细胞中均有表达，这表明lect2.1可能作为潜在的中性粒细胞标志物，并扩展了其在肝脏以外的功能意义。![]()
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图1 原位组织细胞在炎症触发下产生的Lect2.1可促进巨噬细胞的募集和激活尽管之前没有相关报道，但我们对小鼠单细胞数据的分析发现中性粒细胞中表达Lect2，这与中性粒细胞肽（NGP）、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3N（SRGN）和髓过氧化物酶（MPO）水平升高相一致（图S2G）。流式细胞术证实小鼠骨髓中存在Lect2转录本，且中性粒细胞中表达升高（图S2I）。这些发现强调了LECT2表达在不同物种间的进化保守性，并凸显了其在免疫调节中的潜在重要性。接下来，我们使用尾鳍截肢和大肠杆菌（E. coli）注射模型研究了lect2.1在炎症和感染中的表达。我们发现，在截肢后3–4小时（hpa），邻近的组织细胞中eGFP表达显著上调，在12小时时达到峰值（图1D和1F；视频S1）。这些观察结果通过整体原位杂交（WISH）得到了证实（图S3A）。同样，在大肠杆菌注射后，损伤部位附近的组织细胞中eGFP水平在注射后约3小时显著升高，在10-12小时达到峰值，并以感染部位为中心的荧光梯度明显（图1E、1G、S3B；视频S2）。此外，在斑马鱼幼鱼的酒精诱导急性肝炎模型中，肝脏中也观察到lect2.1表达水平升高（图S3C–S3E）。在c-myb缺陷的斑马鱼中，中性粒细胞数量显著减少，但在感染部位周围的组织细胞中，尽管中性粒细胞缺乏，仍然观察到eGFP的产生（图S3G），这表明Lect2.1是由这些细胞在炎症反应中直接产生的。为了确定哺乳动物LECT2的表达是否与斑马鱼的模式相似，我们采用了LPS诱导的急性败血症小鼠模型。通过使用LECT2 mRNA探针的整体原位杂交（WISH）和对健康小鼠和败血症小鼠的肾脏、肝脏、肺和脾脏组织的RT-qPCR，我们观察到败血症器官中LECT2显著上调（图1H、S3F、S3H）。这些结果表明，哺乳动物LECT2显示出与斑马鱼lect2.1相似的表达模式，表明LECT2是在炎症组织中直接产生的。接下来，我们使用CRISPR/Cas9系统生成了一种突变斑马鱼品系（lect2.1e414），以研究Lect2.1在炎症和免疫中的作用。第4外显子中119个碱基对的缺失导致移码，从而使突变体中转录缺陷（图S4A和S4B）。尽管如此，突变体在存活或发育方面并未显示出显著差异。我们使用感染和尾鳍损伤模型进一步探索了Lect2.1的免疫调节作用。将斑马鱼感染eGFP标记的大肠杆菌，并在受精后4天（dpf）的幼鱼中评估细菌清除情况。对照组在感染后6小时（hpi）观察到完全清除细菌，而lect2.1突变体则未能清除细菌（图1I和1J）。感染后24小时（hpi）的定量分析证实，突变体中残留的大肠杆菌水平显著高于对照组（图S4C），这表明Lect2.1对于细菌清除是必需的。值得注意的是，Lect2.1的缺失并不影响尾鳍截肢后的再生过程（图S4D和S4E），这表明Lect2.1不是修复反应的关键因素。斑马鱼幼鱼对感染的早期反应主要依赖于中性粒细胞和巨噬细胞。我们利用转基因品系Tg(lyz:DsRed)和Tg(mpeg1:GFP)对这些细胞进行标记，研究了Lect2.1表达变化在大肠杆菌感染期间如何影响它们。中性粒细胞迅速迁移到感染部位，在感染后约12小时达到高峰，然后下降（图S5A和S5B）。相反，巨噬细胞表现出长时间的积累，在感染后约25小时达到高峰，并持续到32小时后（图1K和1P）。尽管lect2.1突变体中中性粒细胞的迁移和流出未受影响（图S5A和S5B），但巨噬细胞的早期募集明显延迟，且聚集高峰较低（图1K和1P）。为了确认Lect2.1的免疫调节作用是由巨噬细胞介导的，我们使用了硝基还原酶/甲硝唑（NTR/MTZ）系统来消除这些细胞。在MTZ处理后的24小时内，Tg(mpeg1:NTR-GFP)转基因斑马鱼中的巨噬细胞和Tg(npsn:NTR-mCherry)转基因斑马鱼中的中性粒细胞被成功消除（图S5D和S5E）。我们的结果表明，Lect2.1在斑马鱼中的免疫保护作用与巨噬细胞密切相关，这体现在正常斑马鱼比lect2.1敲除斑马鱼具有更高的细菌清除率（图1L、1Q、S5C、S5F）。巨噬细胞消融消除了这种由Lect2.1介导的保护作用（图1L和1Q），而中性粒细胞消融则没有这种效果（图S5C和S5F），这表明Lect2.1独立于中性粒细胞对巨噬细胞进行免疫调节，从而增强免疫力。接下来，我们使用Tg(hsp:lect2.1-eGFP)品系研究了Lect2.1对巨噬细胞募集的影响，该品系允许通过热休克诱导来控制和定时表达Lect2.1（图S6A）。在目标热休克和Lect2.1产生后，邻近区域的巨噬细胞迁移到该位点并停留，与Lect2+细胞相互作用（图1M–1O，S6B；视频S3）。在Lect2.1产生位点积聚的巨噬细胞表现出触角回缩，与树突状巨噬细胞不同，这突出了Lect2.1直接募集巨噬细胞并可能调节其状态或极性的能力。此外，hsp:lect2.1组的巨噬细胞表现出成熟表型，树突状细胞减少，圆形细胞核增多，且充满分泌囊泡（图1R和S6C），这与M1样巨噬细胞相似。同时，这些巨噬细胞中M1相关促炎细胞因子（tnfa、tnfb、il1b、il6）的表达增加（图S5D–S5G），表明Lect2.1可能激活巨噬细胞并促进其向M1样表型转变。在哺乳动物中，LECT2与多种受体相互作用，包括CD209、具有免疫球蛋白样和表皮生长因子样结构域的酪氨酸激酶1（TIE1）、MET原癌基因和血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）。在斑马鱼中，仅在巨噬细胞中检测到CD209同源物Zgc:174904（Cd209l），并且在感染期间其表达上调（图S6H）。共免疫沉淀实验证实，Lect2.1直接与Cd209l结合（图1S）。使用反义寡核苷酸morpholino敲低cd209l导致cd209l转录减少、细菌清除能力受损，并消除了Lect2.1的保护性免疫作用（图S6I–S6K）。对cd209l敲低的斑马鱼进行热休克处理降低了Lect2.1诱导的巨噬细胞募集（图S6L和S6O），并消除了Lect2.1对巨噬细胞相关炎症细胞因子il1b和tnfa的刺激作用（图S6M和S6N）。这些发现表明，LECT2.1通过Cd209l受体介导巨噬细胞的募集和激活。我们目前的研究为LECT2在炎症和免疫中的多方面作用提供了独特的见解。通过使用斑马鱼模型和遗传工具，我们描绘了Lect2.1的表达模式，发现它不仅在稳态条件下由肝细胞和中性粒细胞产生，还在炎症期间由局部组织细胞产生。我们的发现得到了小鼠模型研究的支持，强调了LECT2在物种间表达的进化保守性，并超越了传统的以肝脏为中心的观点。此外，它们为探索LECT2相关的其他病理状况，特别是淀粉样变性，铺平了道路，其中炎症诱导的LECT2局部合成可能是疾病进展的关键因素。此外，通过使用lect2.1突变体和转基因品系，我们确定了Lect2.1通过与巨噬细胞相互作用来增强宿主免疫力的关键作用，阐明了其作为巨噬细胞特异性趋化因子和活性调节因子的双重功能。此外，作为首项在体内证明斑马鱼中Lect2.1趋化功能的研究，我们的发现扩展了巨噬细胞趋化因子家族，并为解决LECT2相关免疫紊乱提供了新的策略。此外，我们还确定了与哺乳动物CD209同源的Cd209样受体作为斑马鱼巨噬细胞上的Lect2受体，这表明LECT2-CD209轴在物种间具有进化保守性，验证了我们的斑马鱼模型，并强调了其在哺乳动物疾病中的更广泛适用性。原文地址：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1673852724002558?via%3Dihub注：因文章篇幅有限，所有相关引用文献，以及补充素材可以点击至原文查阅。
苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过六年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。
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