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题目
胰岛素抵抗（Insulin Resistance）作为洞穴鱼适应营养受限环境的机制
摘要
周期性的食物短缺是自然栖息地中生物面临的主要挑战之一。洞穴栖息的动物必须忍受长时间的营养缺乏，因为在没有光合作用的情况下，洞穴依赖外部能量来源，例如季节性洪水。在本研究中，我们发现与河流适应型种群相比，墨西哥脂鲤（Astyanax mexicanus）的洞穴适应型种群表现出血糖稳态失调和胰岛素抵抗（Insulin Resistance）。我们发现，多个洞穴种群携带胰岛素受体（Insulin Receptor）的突变，这导致体外胰岛素结合减少，并促成了高血糖。携带这一突变的表面型与洞穴型杂交鱼比非携带者体重更高，而经过基因工程改造携带该突变的斑马鱼（Zebrafish）也表现出体重增加和胰岛素抵抗。在食物供应不频繁的洞穴中，较高的体重可能是一种应对策略。在人类中，胰岛素受体的相同突变会导致一种严重的胰岛素抵抗形式并缩短寿命。然而，洞穴鱼的寿命与表面鱼相似，并且在血液中没有积累与糖尿病相关病理进展通常相关的晚期糖基化终产物（Advanced Glycation End-Products）。我们的研究结果表明，在营养受限的环境中，胰岛素信号传导减弱是有利的，洞穴鱼可能已获得了补偿机制，使其能够规避通常与血糖调节失败相关的负面影响。正文
A. mexicanus鱼种包括能够互相繁殖的河流栖息种群和洞穴栖息种群（图1a），分别被称为“表面鱼”和“洞穴鱼”，它们经历了显著不同的营养可获得性。洞穴鱼对饥饿具有抵抗能力；当食物缺乏时，洞穴鱼相比表面鱼体重损失的比例更小。已有研究发现了几种导致饥饿抵抗的因素，包括代谢昼夜节律的减少、代谢率的降低以及体脂的增加。然而，这些适应性背后的遗传变化在很大程度上仍然未知。在本研究中，我们重点研究了三个独立演化的洞穴鱼种群，这些种群根据其栖息的洞穴命名（Tinaja、Pachón和Molino），它们分别从数百万年前入侵洞穴的两个不同的表面鱼种群演化而来。Tinaja和Pachón洞穴鱼起源于比Molino洞穴鱼更为古老的表面种群。代谢稳态的一个关键方面是血糖的调节。我们比较了Tinaja、Pachón和Molino洞穴鱼与实验室饲养的表面鱼的血糖水平，发现洞穴种群在餐后血糖水平显著较高（分别为64、76和92 mg/dl，而表面鱼为47 mg/dl；图1b）。我们研究了短期和长期禁食期间的血糖稳态动态（图1c）。洞穴鱼在禁食24小时后血糖水平显著较高（Tinaja、Pachón和Molino种群的平均值分别为80、80和107 mg/dl，而表面鱼为59 mg/dl，P < 0.05，单因素方差分析）。在21天后，我们观察到Tinaja和Pachón洞穴鱼的血糖水平显著下降；在第1天和第21天，Tinaja洞穴鱼的平均血糖水平分别为80和48 mg/dl（P < 0.0001），Pachón洞穴鱼的平均水平分别为80和44 mg/dl（P < 0.0001）。表面鱼的血糖水平从第1天的59 mg/dl轻微下降至第21天的40 mg/dl（P = 0.02），而Molino洞穴鱼的血糖水平没有显著变化（第1天和第21天分别为107和100 mg/dl，P = 0.89）(注：洞穴鱼血糖在禁食状态下血糖较高)。Molino洞穴鱼维持较高的血糖水平，突显出其代谢适应性与我们调查的其他洞穴鱼种群之间似乎存在的根本差异。然而，我们的研究结果表明，血糖稳态失调是洞穴鱼种群的一个共同特征。为了进一步验证这一假设，我们使用葡萄糖耐量测试（Glucose Tolerance Test）比较了葡萄糖稳态的急性控制（图1d）。我们将葡萄糖注射到表面鱼和洞穴鱼的腹腔中，暂时使大多数鱼的血糖水平上升到400 mg/dl以上（图1d）。注射后8小时，表面鱼的血糖水平与注射PBS的对照组相同（分别为平均126和120 mg/dl；图1d），而所有洞穴鱼种群的血糖水平仍然显著升高（Tinaja、Pachón和Molino种群的平均值分别为374、432和411 mg/dl，P < 0.0005，相比注射PBS的对照组，单因素方差分析；图1d）。在Tinaja和Pachón洞穴鱼中，注射后13.5小时血糖水平仍然升高，但与注射PBS的对照组相比并没有显著差异（在Tinaja洞穴鱼中，注射葡萄糖和注射PBS的鱼分别为平均157和79 mg/dl，P = 0.47；在Pachón洞穴鱼中，注射葡萄糖和注射PBS的鱼分别为平均159和105 mg/dl，P = 0.65）。在Molino洞穴鱼中，血糖水平在13.5小时后仍显著升高（与注射PBS的对照组相比，分别为315 mg/dl和144 mg/dl，P = 0.000001），并在24小时后恢复到与注射PBS的对照组相同的水平（分别为132和133 mg/dl）。我们的结果表明，洞穴鱼的葡萄糖清除能力受到了损害。葡萄糖稳态需要胰岛素（Insulin）和胰高血糖素（Glucagon）的平衡释放，以指示组织从血液中吸收葡萄糖或从储存的糖原中生成葡萄糖。我们发现，在受精后第十天，第一个胰岛已经可见，并且在产生胰高血糖素的细胞数量（表面鱼和洞穴鱼分别为54和50，P = 0.678）或胰岛素的细胞数量（表面鱼和洞穴鱼分别为54和52，P = 0.275）方面没有差异，这表明表面鱼和洞穴鱼的胰腺发育类似（每个种群n = 5；扩展数据图1）。在1到2岁的成年鱼中，我们在24小时禁食后未检测到循环胰高血糖素水平的差异（扩展数据图2）。虽然Tinaja洞穴鱼的循环胰岛素水平趋于较高，但结果并不显著（每个种群n = 24；扩展数据图3）。尽管如此，我们发现了洞穴鱼胰岛素反应减弱的证据。我们给鱼注射了精氨酸（Arginine），精氨酸能够刺激胰高血糖素和胰岛素的同时释放，并观察到表面鱼的血糖水平显著下降（PBS注射鱼和精氨酸注射鱼的平均值分别为80和38 mg/dl，P = 0.006），而洞穴鱼的血糖水平没有变化（图1e）。此外，我们发现重组人胰岛素的注射在表面鱼中引起了60分钟后血糖的显著下降，但在Tinaja洞穴鱼中没有（扩展数据图4）。我们的综合观察表明，表面鱼和洞穴鱼之间胰高血糖素和胰岛素水平没有差异，而洞穴鱼对精氨酸或胰岛素不降低血糖水平，这提示洞穴鱼可能存在胰岛素抵抗（Insulin Resistance）。胰岛素刺激的葡萄糖摄取通过AKT在丝氨酸473（Serine 473, pAKT）上的磷酸化进行。我们比较了用重组胰岛素处理的新鲜解剖的骨骼肌中pAKT与AKT的比例（图1f, g）。与明显的葡萄糖稳态失调一致，我们观察到Tinaja洞穴鱼的pAKT水平低于表面鱼（pAKT：AKT)比值分别为0.775和1.39，P = 0.017；图1f, g），这表明与表面鱼相比，Tinaja洞穴鱼确实存在胰岛素抵抗。Pachón洞穴鱼的肌肉对胰岛素的反应pAKT水平也较低（pAKT比值为0.806，P = 0.027；图1f, g）；然而，尽管血糖升高（图1b），Molino洞穴鱼的pAKT水平与表面鱼相当（pAKT比值为1.26，P = 0.99；图1f, g）。我们的结果表明，Tinaja和Pachón鱼在血糖调节和胰岛素抵抗方面进行了平行的进化，而Molino鱼可能通过不同的机制进化出了其改变的葡萄糖代谢。![]()
图1. 洞穴适应的A. mexicanus种群中葡萄糖稳态的改变，a. mexicanus的表面鱼和Tinaja洞穴鱼。b，表面鱼与洞穴鱼的餐后1小时血糖（表面鱼、Tinaja、Pachón和Molino洞穴鱼的样本量分别为n = 10, 13, 3和3）。c，第1天和第21天的禁食血糖（每个种群和条件下n = 20）。d，葡萄糖耐量测试。腹腔注射葡萄糖（红色）或PBS（蓝色）后的血糖水平。数据点表示个体鱼的值，灰色阴影表示多项式回归的95%置信区间。e，腹腔注射精氨酸5小时后的血糖（每个种群和条件下n = 10）。f，蛋白质印迹分析：用pAKT（ser473）和AKT抗体检测的细胞裂解物。裂解物来自体外用PBS、高浓度（H, 9.5–11.5 µg/ml）或低浓度（L, 0.95–1.15 µg/ml）胰岛素处理的骨骼肌。g，使用密度测定法对最高浓度处理的条带进行定量分析（每个种群n = 3）。对于箱线图，横条表示中位数、第25、第50和第75百分位数，纵条表示1.5倍四分位距。显著性通过单因素方差分析（ANOVA）和Tukey的诚实显著性差异（HSD）事后检验计算。NS，P > 0.05；* P < 0.05；** P < 0.005；*** P < 0.0005。凝胶来源数据见补充图1。为了研究洞穴鱼胰岛素抵抗背后的遗传机制，我们使用现有的基因组序列（Supplementary Information 1）对胰岛素通路中所有已知基因的序列进行了分析。值得注意的是，我们在表面鱼和洞穴鱼的胰岛素受体基因（insra）中发现了一个编码差异，该差异影响了细胞外富含半胱氨酸域中的一个保守脯氨酸（P211L；图2a–c）。该突变的存在与胰岛素抵抗相关，因为Tinaja和Pachón种群携带该突变，而Molino洞穴鱼则拥有野生型等位基因（图2b, c）。值得注意的是，相同的遗传改变与至少两例已知的Rabson-Mendenhall综合征（Rabson-Mendenhall Syndrome）相关，这是一种人类中严重的胰岛素抵抗形式（图2c）。之前并未探讨过该突变的生化效应，但其在富含半胱氨酸域中的位置提示其在胰岛素结合中可能发挥作用。为了验证这一点，我们生成了稳定表达全长表面鱼或Tinaja洞穴鱼insra的转基因HEK293T（Flp-In-293）细胞系，并用不同浓度的异硫氰酸荧光素（Fluorescein Isothiocyanate, FITC）标记的人胰岛素孵育这些细胞。我们使用基于图像的细胞计量方法（Imagestream X Mark II）测量荧光强度作为结合效率的读数，结果发现表达洞穴鱼受体的细胞在除了最低浓度外的所有浓度下的胰岛素结合显著降低（图2d）。我们的结果表明，insra基因的P211L突变通过改变胰岛素结合效率影响了胰岛素信号传导。![]()
图2. 洞穴鱼胰岛素受体中的编码突变导致胰岛素结合减少a，胰岛素受体的示意图（改编自参考文献24）。红色星号表示P211L突变的位置。LR，富含亮氨酸重复序列；CR，富含半胱氨酸域；Fn，纤连蛋白III型域；TM，跨膜域；TK，酪氨酸激酶域。b，Astyanax中的突变序列色谱图。c，胰岛素受体P211L突变与Rabson-Mendenhall综合征（“Human (RMS)”）患者的氨基酸序列比对。d，稳定转染Flag标记的表面鱼或Tinaja洞穴鱼胰岛素受体并与FITC标记的胰岛素孵育的细胞的相对FITC强度。每个点代表>2,500个活细胞的平均FITC强度，归一化到未处理细胞的平均强度。线条表示局部多项式回归拟合的结果。三角形（实心代表表面鱼，空心代表Tinaja洞穴鱼）表示在竞争结合实验中细胞与10 µM未标记的胰岛素孵育的数据。显著性通过单因素方差分析（ANOVA，比较表面鱼和Tinaja洞穴鱼）和Tukey的HSD事后检验计算，* P < 0.05；** P < 0.005；*** P < 0.0005。接下来，我们测试了野外捕获鱼中P211L突变的存在及其频率。我们对来自不同地方的71条表面鱼和来自6个不同洞穴的51条洞穴鱼进行了基因分型（Supplementary Information 2；图3a）。与我们之前的观察一致，Molino鱼中没有发现该突变（n =8），但在所有其他测试的洞穴种群中均存在（Tinaja、Yerbaniz、Pachón、Japonés和Arroyo，合计n = 36）。值得注意的是，携带该突变的洞穴种群均来自同一祖先表面鱼种群。虽然在某些洞穴中该突变以杂合子的形式存在，但我们没有发现任何洞穴鱼携带表面等位基因的纯合子（图3a）。我们的发现表明，该突变在洞穴中存在积极的选择，并且洞穴等位基因具有部分显性效应。我们在任何表面鱼中都没有观察到洞穴等位基因，这表明该突变要么是在洞穴种群中新出现的，要么是我们的采样频率未能检测到的罕见变异，或是在当前的表面种群中不存在但在祖先表面鱼群中存在的变异（Supplementary Information 3）。为了研究P211L突变是否有助于葡萄糖调节的改变，我们测量了192条来自表面鱼与Tinaja洞穴鱼杂交的F2代鱼在终生自由采食下的禁食血糖水平（扩展数据图5）。我们发现，血糖升高（定义为超过表面鱼平均值59 mg/dl或最大值75 mg/dl）在我们的杂交群体中是一种非孟德尔性特征：只有4.7%的鱼继承了血糖升高的特征，而不是预期的25%，这表明该特征不是单基因遗传。虽然携带P211L突变的F2鱼与未携带该突变的F2鱼在血糖水平上没有显著差异，但我们发现只有携带P211L突变的F2鱼血糖水平超过了表面鱼的平均值（n = 9）或最大值（n = 3），这表明该突变在葡萄糖调节改变中起到了必要但不充分的作用。我们发现，在营养受限的饮食下，洞穴鱼的体重比表面鱼更重（分别为平均2.08 g和1.52 g，P = 0.02；图3b）。为了研究insra突变是否影响体重，我们对124条约1.5岁、自由采食的表面鱼与Tinaja洞穴鱼的F2代雄性鱼进行了基因分型和称重。我们关注雄性鱼，因为卵质量在不同雌性个体之间差异较大，可能占雌鱼体重的41%，在我们的分析中可能是一个混杂变量（扩展数据图6）。我们发现，携带一份或两份洞穴P211L insra等位基因的雄性鱼比仅携带表面等位基因的杂交鱼平均重27%（分别为平均1.63 g和1.28 g，P = 0.006；图3c）。洞穴鱼的食欲增加与黑皮质素4受体（Melanocortin 4 Receptor）突变相关。尽管该突变在F2杂交种群中与insra突变独立分离，但可能存在另一个与P211L突变紧密连锁的位点影响食欲。为了排除食欲对我们insra等位基因分析的影响，我们将体重相近的F2鱼（< 2 g）分别饲养，并确保它们每天食用6 mg的食物，持续4个月。我们发现，携带P211L纯合突变的鱼（n = 20）体重增加显著大于不携带洞穴等位基因的鱼（0.37 g对0.19 g，n = 60，P = 0.02），这与insra位点的变异独立于食欲调节影响体重增加的观点一致。为了确定洞穴鱼中与P211L突变相关的胰岛素抵抗和体重增加是否确实由于insra基因的改变，我们使用CRISPR基因编辑通过同源定向修复（Homology Directed Repair）将该突变引入斑马鱼（Danio rerio）（扩展数据图7）。我们发现，与杂合子同胞相比，携带P211L突变的斑马鱼纯合子在其骨骼肌中pAKT与AKT的比率较低，无论是在未经处理的条件下（P211L纯合子和杂合子鱼分别为0.05和0.13，P = 0.016）还是在胰岛素刺激条件下（P211L纯合子和杂合子鱼分别为0.13和0.32，P = 0.067，每个基因型和条件下n = 3）（图3f）。此外，我们发现，在相同条件下饲养时，携带洞穴等位基因纯合子的斑马鱼比其同胞更长（平均20.0毫米，相比杂合子鱼18.4毫米，P = 0.0046）且体重更重（平均124.6毫克，相比杂合子鱼99.7毫克，P = 0.022）（图3e, g, h）。我们的研究结果表明，P211L突变促成了在Tinaja和Pachón洞穴鱼中观察到的体重增加和胰岛素抵抗。考虑到在哺乳动物中，胰岛素受体的完全功能丧失突变与生长迟缓和体脂减少相关，鱼类中胰岛素受体突变导致的体重增加是出乎意料的。我们的结果表明，在鱼类中，胰岛素信号减弱具有相反的效果，但导致这种差异的机制仍不清楚。![]()
图3. insra的P211L突变在洞穴环境中过度表现，并与表面–洞穴杂交种的较高体重相关
a，该区域的地图，覆盖了野生捕获样本的基因分型结果。饼图表示纯合表面等位基因（蓝色）、纯合洞穴等位基因（橙色）或杂合子（灰色）鱼的百分比。饼图的大小大致表示基因分型的鱼的数量（Molino, n = 8；Surface, n = 71；Pachón, n = 9；Yerbaniz, n = 8；Japonés, n = 5；Arroyo, n = 7；Tinaja, n = 14；饼图的位置对应地图上种群名称的地理位置和垂直顺序）。P211L等位基因在所有野生捕获的表面鱼和Molino洞穴鱼中均不存在（Molino洞穴鱼源自较近的表面鱼谱系）。P211L突变存在于所有取样的洞穴鱼种群中，这些种群源自更古老的表面鱼谱系。Tinaja、Yerbaniz、Japonés和Arroyo地理上接近，被认为代表了单一的入侵事件；Pachón代表了独立的入侵事件。地图来源：Imagery ©2017 Landsat/Copernicus, Map data ©2017 Google, INEGI。b，Tinaja雄鱼（n = 6）和表面雄鱼（n = 5）在营养受限饮食下的体重。c，基因分型为P211L突变的18个月大的F2代Tinaja–表面杂交雄性鱼的体重。P-纯合表面鱼（P），n = 22；L-纯合洞穴鱼（L），n = 27；杂合子（P/L），n = 53。d，在固定饮食下的F2代Tinaja–表面杂交雄鱼的体重变化。n = 21（P），39（P/L）和20（L）。e，野生型（WT）和纯合P211L突变（HOM）斑马鱼同胞的图片。f，成年斑马鱼骨骼肌中体外用PBS或胰岛素处理后的pAKT：AKT比率（每个基因型和条件下n = 3）。g, h，野生型斑马鱼（n = 13 (P)）和杂合（n = 22 (P/L)）及纯合（n = 11 (L)）P211L突变斑马鱼的长度和体重。在箱线图中，中位数、第25、第50和第75百分位数由横条表示，纵条表示1.5倍四分位距。显著性通过双尾学生t检验计算，* P < 0.05。
洞穴鱼表现出胰岛素抵抗和高血糖；在人类中，这些表型分别是2型糖尿病的前兆和定义。此外，洞穴鱼有脂肪肝，这也是与2型糖尿病经常相关的特征。携带insra突变的转基因斑马鱼显示出鳞片大小的减少，这与之前描述的其他高血糖斑马鱼模型相符，最近在洞穴鱼中也观察到类似的表型。原则上，这些数据可能暗示了一种进化上的权衡，即为了获得饥饿抵抗的好处而牺牲生理健康。然而，表面鱼在15岁时开始表现出衰老的迹象，如皮肤下陷、鳍破损和背部弯曲(图4），而Tinaja和Pachón洞穴鱼则可以超过14年没有这些衰老迹象，并且在生育能力下降方面与表面鱼没有差异。洞穴鱼可能已经进化出补偿机制，使它们能够在潜在有害的代谢变化下保持健康。糖尿病患者的主要病因之一是由血液中蛋白质的过度非酶促糖基化引起的组织损伤，从而生成晚期糖基化终产物（Advanced Glycation End-Products, AGEs）。AGEs与糖尿病引发的血管损伤、心血管疾病和衰老密切相关。我们比较了终生自由采食的两岁鱼血清中的AGEs水平。尽管洞穴鱼的血糖水平升高，但Tinaja和Pachón洞穴鱼与表面鱼相比在AGEs水平上没有差异（分别为平均9.7, 9.3和8.9 µg/ml，P = 0.99, 0.95）。这两个种群可能有减少蛋白质糖基化的机制，使它们免受高血糖的有害影响。值得注意的是，Molino洞穴鱼的AGEs水平较高（平均14.1 µg/ml，相比表面鱼的8.9 µg/ml，P = 0.03）。尚不清楚Molino种群的健康和长寿是否受到AGEs积累的影响，但我们的结果表明它们可能通过不同于Tinaja和Pachón洞穴鱼的机制进化出了改变的血糖稳态。![]()
图4. 尽管血糖水平升高且存在胰岛素抵抗，Tinaja和Pachón洞穴鱼未显示衰老迹象，且未在血液中积累晚期糖基化终产物
a–c，实验室饲养的表面鱼（a）、Pachón洞穴鱼（b）和Tinaja洞穴鱼（c）在标示的时间内自由采食。洞穴鱼为野生捕获，年龄表示最小年龄。表面鱼（a）显示出衰老迹象，如松弛的皮肤和弯曲的尾巴（黄色箭头），而这些迹象在相似年龄的洞穴鱼中不存在（b, c）。d，禁食三天后的约两岁鱼血清中晚期糖基化终产物（AGE–BSA）的定量分析（每个种群n = 4）。* P < 0.05，单因素方差分析（ANOVA）和Tukey的HSD事后检验。在箱线图中，中位数、第25、第50和第75百分位数由横条表示，纵条表示1.5倍四分位距。
我们的研究结果将洞穴鱼确立为一个研究糖尿病样葡萄糖稳态失调病理抵抗的模型。此外，我们的结果凸显了在应对极端环境挑战时，关键代谢途径中可能进化出的极端生理措施。https://www.nature.com/articles/nature26136#:~:text=Our%20findings%20suggest%20that%20diminished%20insulin%20signalling%20is%20beneficial%20in
