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标题：
反复的脂多糖诱导微胶质细胞反应在大脑区域间的训练和耐受
摘要
背景
神经炎症参与几乎所有中枢神经系统疾病的发病机制。作为大脑的固有免疫细胞，微胶质细胞根据动态的大脑环境调节其活动。先前的研究表明，反复的外周炎症可以触发微胶质细胞基因表达和功能的长期变化，这是一种固有免疫记忆的形式。方法与结果
本研究中，我们使用多次低剂量的脂多糖（LPS）注射于成年小鼠，研究急性细胞因子、转录组学和微胶质细胞形态变化，这些变化促进了前额皮层、海马和纹状体的免疫记忆形成，以及这些变化对行为的长期影响。基因表达的训练和耐受在不同区域间共享，我们识别了三种独特的差异表达基因（DEGs）簇（2xLPS敏感、4xLPS敏感、LPS降低），这些簇富集了不同的生物功能。2xLPS敏感的DEG启动子富集了IRF和NFkB家族转录因子的结合位点，这两者是固有免疫记忆的关键调节因子。我们量化了微胶质细胞形态群体的变化，发现虽然在LPS处理下，各脑区和性别内的分枝状和杆状微胶质细胞的比例大致保持一致，但在免疫记忆状态下，从变形虫状向肥厚形态状态的转变明显，并且在反复LPS刺激下微胶质细胞端到端排列的事件出现和消退动态变化。结论
综合来看，研究结果支持微胶质细胞在大脑免疫记忆形成过程中动态调节的观点，并为未来在脑疾病背景下利用该模型提供了支持。1. 背景
固有免疫细胞通过固有免疫记忆动态调整其对免疫挑战的反应，这一过程受到其与炎症事件过去接触的影响。作为大脑的常驻免疫细胞，微胶质细胞迅速对炎症作出反应，参与经典免疫功能，包括细胞因子和趋化因子的产生以及对病原体和细胞残骸的吞噬（注：小胶质细胞是一种免疫细胞）。除了作为免疫细胞的责任外，微胶质细胞在维持大脑稳态中发挥关键作用，包括调节神经元和少突胶质细胞的数量、塑造大脑电路和精细调节神经连接。这些过程在大脑疾病中常常受到干扰，支持微胶质细胞在健康和疾病中的重要作用。多项临床和尸检研究指出，精神分裂症、自闭症谱系障碍和阿尔茨海默病等大脑疾病的病因具有神经炎症成分，这与微胶质细胞活化增加相关。微胶质细胞在大脑中释放和响应细胞因子、趋化因子和神经递质，以便与其他细胞类型进行通信并调节其功能。因此，微胶质细胞反应的干扰可能会影响大脑环境中细胞类型之间的通信，并可能导致大脑功能的下游变化。固有免疫细胞根据对免疫刺激的先前接触更新对炎症事件的反应。在最初免疫激活事件解决后，固有免疫细胞可以保持在“训练”状态，表现为对后续免疫挑战的反应增强，或者在“耐受”状态下，反应减弱。这两种形式的固有免疫记忆作为机制，增强了生物体有效应对反复感染或损伤的能力，但如果调节失常则可能有害。虽然免疫训练允许免疫反应的主动适应，对生物体具有保护性益处，但在无法解决的炎症背景下，这一过程可能变得不适应。同样，耐受的免疫反应在面对共生微生物时在避免慢性炎症状态方面发挥关键作用。然而，在面对新病原体时，这些反应可能适得其反。作为大脑的固有免疫细胞，微胶质细胞具有独特性，因为它们是寿命较长的细胞，在整个生命周期内能够进行局部自我更新，暗示微胶质细胞中固有免疫记忆的形成可能对大脑功能和疾病发展产生持久影响。固有免疫细胞，包括微胶质细胞，表达响应微生物相关分子模式的受体。微胶质细胞的 Toll-like receptor 4 (TLR4) 结合脂多糖（LPS），这是革兰氏阴性细菌的主要结构成分。最近的研究表明，反复进行低剂量 LPS 外周注射是一种有效的模型，用于研究微胶质细胞在大脑中的免疫记忆反应。反复的 LPS 刺激能够诱导大脑微胶质细胞的长期免疫训练和耐受，这种状态已被证明至少持续 6 个月。类似地，LPS 预处理还显示出通过防止耐受来减少创伤性脑损伤的损害。有趣的是，Wendeln 等人展示了小鼠模型中阿尔茨海默病和中风的病理特征受到 LPS 引发的免疫训练加重，且通过免疫耐受得到缓解。微胶质细胞的长期功能变化与这些模型中微胶质细胞增强子和基因表达的长期重编程相平行。与 HIF-1α 调控、代谢糖解和 Rap1 媒介的吞噬作用相关的基因在训练几个月后增加，但在耐受情况下则未见增加。文献中的发现共同支持了一个模型，即长期的基因表达重编程构成了与疾病相关的长期固有免疫记忆。然而，在微胶质细胞中，固有免疫记忆初步形成的机制尚未得到充分表征，因此成为本研究的主要焦点。在本研究中，我们使用反复 LPS 的小鼠模型，识别基因表达、细胞因子表达和微胶质细胞形态变化如何驱动大脑中训练和耐受的形成。与先前使用相同反复低剂量 LPS 模式的研究不同，我们特别关注在前额皮层、纹状体和海马等多个大脑区域中微胶质细胞的即时急性变化，这些区域在微胶质细胞形态和功能上具有已知的差异。此外，我们还评估了固有免疫记忆诱导的长期影响，采用全面的焦虑样、抑郁样、重复性及学习和记忆行为的评估，并对 LPS 诱导的微胶质细胞形态状态在各大脑区域的变化进行了系统评价。我们描述了在各大脑区域间共享的基因表达模式及其共享和独特的调控通路。同时，我们还描述了微胶质细胞在形成免疫初始和耐受过程中的动态出现和消退事件，这种形态表型在反复 LPS 的背景下尚未被描述。综上所述，这些发现为微胶质细胞在免疫记忆形成中的变化提供了新的见解，并支持未来进一步探索所述机制在大脑疾病背景下的工作。2. 结果
2.1 重复LPS注射导致急性病态行为的显著训练和耐受，但未引起长期行为变化
在我们的实验模型中，小鼠接受了为期四天的低剂量LPS（0.5 mg/kg）或载体（1xPBS）腹腔注射，随后在最后一次PBS、1xLPS、2xLPS、3xLPS或4xLPS处理后3小时对病态行为进行评分。结果表明，重复LPS注射导致急性病态行为的训练和耐受：在第二次LPS注射后，各处理组的病态行为达到了峰值，体重下降最为明显（图1A, B）。病态行为在第三和第四次LPS注射后逐渐恢复到基线水平。尽管小鼠在经历第二次LPS注射后的体重损失两天后有所恢复，但LPS处理组的体重在最高体重损失后的6天内仍显著低于PBS组，且在行为实验开始前，LPS处理组的体重未完全恢复到预处理水平。然而，在评估行为时，焦虑样、抑郁样、学习和记忆以及重复行为等长期差异未见显著变化，表明所有处理条件均已完全恢复，且重复LPS没有产生长期不利影响。![]()
图 1 重复LPS注射在小鼠大脑中产生显著的训练和耐受性。
A部分展示了重复LPS注射的实验方案和实验设计。B部分测量了在所有实验组最后一次注射后3小时的疾病行为（*p < 0.05，BH校正）。C部分显示了在最后一次注射后3小时内血清和四个大脑区域的Luminex蛋白定量结果。每种细胞因子和趋化因子在Luminex小鼠蛋白阵列上的对照组（PBS）与LPS处理组之间的Log10倍数变化（pg/mL）已标出。列按组织样本和LPS处理条件分组（*p < 0.05，BH校正）。未超出背景的基因以灰色表示。D部分比较了促炎细胞因子Il-1β和Tnf-α的RT-qPCR倍数变化（*p < 0.05，BH校正）。2.2 细胞因子和趋化因子蛋白水平先在血清中升高，然后在脑中升高
为了检测已知炎症蛋白（包括趋化因子、细胞因子及其他信号分子）的蛋白水平，我们对在最后一次注射后3小时收集的血清和四个不同脑区（前额皮质、海马、纹状体、小脑）组织进行了Luminex多重蛋白定量分析。结果显示，炎症分子的蛋白水平显著变化（图1C）。血清中，1xLPS处理后G-CSF、IL-6、IP-10、KC、MCP-1、MIP-1a、MIP-1b和RANTES显著增加，且在2xLPS处理后维持，3xLPS和4xLPS后大部分又恢复到基线水平。在前额皮质中，1xLPS处理后G-CSF、IL-6和IP-10显著增加，绝大多数变化发生在2xLPS处理后。海马、纹状体和小脑也观察到相似的模式，且大部分显著增加的水平均发生在2xLPS处理后。接下来，我们使用RT-qPCR分析了前额皮质组织中Il-1β和Tnf-α的表达，发现与蛋白分析结果类似，2xLPS处理后这两种细胞因子显著诱导，随后在3xLPS和4xLPS处理后趋向基线水平。这些结果表明，2xLPS产生了最大的炎症信号分子增加，这些反应在3xLPS和4xLPS后减弱，与在2xLPS处理后观察到的病态行为峰值和体重下降相一致。![]()
图2 在重复LPS注射后，行为没有长期变化。
A部分展示了每个处理组在实验的第1至第8天后24小时内的体重变化百分比，行为评估在第9天开始。图中以线图显示均值±标准误，比较了每个LPS处理与PBS在各时间点的差异（*p < 0.05，BH校正）。B部分列出了在1-4次LPS注射后，对焦虑样行为、重复行为、学习和记忆任务以及抑郁样行为的评估时间线。行为电池中每个任务的组间差异绘制在条形图中，均值±标准误显示，无显著差异（*p < 0.05，BH校正）。2.3 重复LPS导致脑区内基因表达的训练和耐受变化，可能由小胶质细胞驱动
为研究重复LPS刺激对基因表达的影响，我们在最后一次LPS或PBS注射后3小时对海马、纹状体和前额皮质的脑组织进行了RNA测序（图1A）。根据PBS对照组和各LPS条件之间的表达差异识别了不同的Difference expressed genes（DEGs），并根据不同脑区和处理的基因表达模式进行聚类分析（图3A, S1）。与炎症蛋白水平、病态行为和体重变化的影响类似，基因表达变化在2xLPS后最为显著。大多数基因在所有比较和脑区的响应中较少出现下降。我们识别出了“2xLPS敏感”、“4xLPS敏感”和“LPS降低”三种基因表达模式（图3A）。这些DEGs的不同聚类在GO术语中呈现出共享和独特的富集（图3B）。大多数2xLPS敏感基因在3xLPS和4xLPS时未被激活，表明大部分基因形成了耐受状态。2xLPS敏感基因富集于与免疫调节相关的生物过程，支持之前关于LPS激活下的基因表达研究。4xLPS敏感基因也富集于相似过程以及胶质细胞和星形胶质细胞的发育。LPS降低的基因则富集于神经调节相关的过程。这些发现表明，重复LPS注射引发了不同的基因表达特征。为了验证观察到的差异基因表达是否由小胶质细胞驱动，我们对DEGs进行了富集分析，结果显示2xLPS和4xLPS敏感基因与已发表的微胶质细胞基因列表存在共享和独特的富集。我们还分析了公开的单细胞图谱数据集，探索在稳态条件下哪些脑细胞类型高度表达观察到的DEGs，发现微胶质细胞、免疫细胞（血管周围巨噬细胞）和内皮细胞类型表达了2xLPS和4xLPS敏感基因，而神经元细胞类型则高度表达LPS降低的基因（图3B）。这些结果与基因本体分析的生物功能一致。进一步，具有LPS敏感性的基因Cxcl16和S100a9在微胶质细胞中显示了相同的训练和耐受基因表达模式，支持微胶质细胞可能是驱动2xLPS敏感和4xLPS敏感基因集差异表达的主要细胞类型。![]()
图3 重复LPS注射诱导了不同脑区之间共享的基因表达特征。
A部分展示了各样本（列）对于每个差异表达基因（DEG）（行）的标准化基因表达热图。仅显示显著的DEG（*p < 0.05，BH校正）。基因根据表达模式进行了层次聚类：2xLPS敏感簇（总共226个基因）、4xLPS敏感簇（总共120个基因）、LPS减少簇（86个基因）。每个基因的CPM值首先在每个脑区内进行了标准化，然后在不同脑区之间进行了标准化以进行绘图。热图颜色之间的间隔经过调整，以适应标准化基因表达值的分布，使得每个颜色间隔的量化比例中包含10%的数据（图S1A）。B部分是针对(A)中每个簇的GO术语富集点图，仅显示显著的GO术语（*p < 0.05，BH校正）。C部分为(B)中GO术语的网络图，展示了DEG簇中与GO术语基因列表相关的特定基因。2.4 重复LPS通过与IRF和NFκB家族转录因子的结合调节免疫记忆
为了研究哪些上游调控因子可能驱动重复LPS引起的基因表达，我们检查了差异表达基因（DEGs）启动子区域的转录因子结合位点富集情况（图4A,C）。2xLPS敏感的DEG簇的启动子显著富集了干扰素调节因子（IRF）、基本螺旋-环-螺旋/bZIP（bHLH/bZIP）、Rel同源域（RHD）、C2H2锌指（Zf）和信号转导与转录激活因子（Stat）等转录因子家族的结合位点，这些结合位点涵盖了新的和已知的Homer基序（补充文件S2）。在2xLPS敏感的DEG簇中，不同基因集合在富集的转录因子家族中结合位点的存在存在差异（图4D）。值得注意的是，对1xLPS的反应增加并在2xLPS后持续增加的2xLPS敏感基因并未在其启动子中发现bZIP家族转录因子的结合位点，而这些结合位点在大多数其他2xLPS簇基因中均有出现。此外，只有部分2xLPS敏感基因具有IRF家族转录因子的结合位点。RHD家族转录因子NFκB的结合位点在大多数2xLPS簇DEG启动子中被发现，NFκB是免疫基因的另一关键调控因子。DEG启动子还显著富集了来自公开可用ChIP-seq数据的RHD家族（NFκB, p65）和IRF家族（IRF8）的直接结合位点。这些结果进一步支持了这些转录因子在LPS诱导的基因表达差异、免疫训练和耐受中的主要调控作用（图4B；BH校正p < 0.05，补充表S3）。DEG启动子还富集了与成年小胶质细胞中的条件IRF8基因敲除相关的H3K27ac ChIP-seq峰，这表明IRF8可能与其他转录机制（如组蛋白乙酰转移酶和去乙酰化酶）相互作用，以在这些位点介导小胶质细胞的基因表达。![]()
图4 IRF和NFkB转录因子基序在2xLPS敏感DEG中富集。
A部分展示了在2xLPS敏感DEG的启动子（距离转录起始位点+1000到−200）内的Homer新生转录因子基序富集情况。显示了排名靠前的新生基序（p < 1e−10）。B部分显示了2xLPS敏感DEG在公开可用的微胶质细胞和骨髓衍生巨噬细胞（BMDM）研究中的ChIP-seq启动子峰的富集情况。红色圆圈表示DEG中包含ChIP-seq峰的比例显著富集，与RNA-Seq实验中所有基因中包含ChIP-seq峰的背景（灰色圆圈）相比，*p < 0.05，BH校正。C部分展示了2xLPS敏感DEG启动子中的Homer已知转录因子基序富集情况。蓝色圆圈表示DEG中包含该启动子基序的比例显著富集，与RNA-Seq实验中检测到的所有基因背景（灰色圆圈）相比，显示了排名靠前的已知基序（p < 0.05，BH校正）。D部分是2xLPS敏感DEG的标准化基因表达热图，展示了每个已知启动子基序（C）在2xLPS敏感DEG启动子中的结合位点是否存在（黑色=存在，白色=不存在）。2.5 小胶质细胞在免疫训练和耐受形成中 across 大脑区域改变形态
使用MicrogliaMorphology和MicrogliaMorphologyR工具，我们定量分析了在RNA-seq评估的相同大脑区域（额叶皮层、海马、纹状体）中，接受1-4次LPS的小鼠（雄性和雌性）的形态群体变化（图5A, S7A–E）。通过无偏聚类，我们识别了四种小胶质细胞形态：分枝状、杆状、肥大和变形。尽管分枝状和杆状小胶质细胞在不同大脑区域和性别中的比例大体保持一致，LPS处理却导致了变形状态与肥大状态之间的转变（图5A, B, S8A-B；BH校正p < 0.05，补充表S4）。在雄性小鼠中，海马和纹状体在免疫激活（2xLPS）期间从变形状态显著转变为肥大状态，随后在免疫耐受（4xLPS）时又恢复到变形状态。雄性小鼠的额叶皮层则维持了2xLPS诱导的肥大形态。在雌性小鼠中，额叶皮层、海马和纹状体均显示出向肥大形态的转变，并在免疫耐受期间持续维持。
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图 5 微胶质细胞形态在免疫记忆中主要在变形态和肥大型态之间转变。
A部分展示了LPS诱导的形态群体在不同脑区和性别之间的变化，包括变形态和肥大型态之间的转换（*p < 0.05，BH校正）。B部分展示了在PBS、2xLPS和4xLPS条件下的海马微胶质细胞的免疫荧光示例图像，细胞使用P2ry12（黄色）染色，细胞核使用DAPI（蓝色）染色。比例尺为200μm和30μm。补充图S8中包含了分析的所有脑区、LPS处理和性别的图像。
此外，我们还观察到小胶质细胞在接触LPS后逐渐呈端对端排列。在雄性小鼠中，随着LPS暴露的增加，端对端排列的小胶质细胞的发生率在2xLPS后显著增加，3xLPS后开始减少，并在4xLPS时再次出现，这一现象在额叶皮层、海马和纹状体均有观察到（图6A, B；BH校正p < 0.05，补充表S4）。在雌性小鼠中，这种排列行为在额叶皮层和海马中随着4xLPS显著增加，但在纹状体中没有观察到显著变化。重复LPS处理后，各大脑区域的小胶质细胞密度没有显著差异，表明观察到的小胶质细胞端对端排列的变化并非由于细胞数量的变化（图S7F；BH校正p < 0.05，补充表S4）。通过组织学进一步研究，我们发现，在LPS模型中表现出这种排列行为的小胶质细胞包裹在所有三个大脑区域的血管周围（图S9A–C）。
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图 6 微胶质细胞端对端排列的动态“列车”现象在重复LPS处理后出现并随之消退。
A部分展示了随着重复LPS处理，各脑区内性别间微胶质细胞列车事件的量化情况（*p < 0.05，BH校正）。B部分展示了在2xLPS和4xLPS条件下，海马区微胶质细胞列车的免疫荧光示例图像，细胞使用P2ry12（黄色）染色，细胞核使用DAPI（蓝色）染色。比例尺为300μm和50μm。箭头指向图像中微胶质细胞列车事件的示例。补充图S9中包含了微胶质细胞列车环绕血管的染色图像。3. 讨论
小胶质细胞在大脑中的活动中断已在多种脑部疾病的病理中得到了充分记录，但先天免疫记忆如何直接促成脑部疾病的发作和进展的分子机制仍然研究不足。在我们的研究中，我们使用了一种最近描述的重复LPS小鼠模型，调查了额叶、海马和纹状体中与免疫记忆形成相关的瞬时转录组和小胶质细胞形态变化，以及这些变化对与脑部疾病相关的各种行为的长期影响。实验小鼠在LPS诱导的免疫训练下表现出急性疾病行为、体重和促炎细胞因子表达的显著变化，这些变化在免疫耐受形成后得以缓解。我们发现了一组基因的转录组变化，这些基因在2次LPS后表现出训练反应，在3次和4次LPS后表现出耐受反应。这些“2xLPS敏感”基因在免疫调节相关的生物过程上富集，并被IRF和RHD家族（NFkB）转录因子靶向，这两个关键家族的协调活动之前已被关联到小胶质细胞和其他免疫细胞中先天免疫记忆的形成。结合LPS诱导的形态变化，我们的工作确定了小胶质细胞调节中在先天免疫记忆形成过程中发生的几个关键变化，这些变化与之前在脑部疾病背景下的免疫记忆发现相一致。小胶质细胞是大脑实质中的唯一组织驻留巨噬细胞，自我更新而不依赖于外周供给，并且在不同的大脑环境中展现出不同的形态和功能特性，这表明驱动小胶质细胞身份的脑内信号使其与其他组织中的巨噬细胞有所不同。然而，关于免疫训练和耐受调节的知识大多来源于培养的外周巨噬细胞的研究。体外巨噬细胞培养模型的研究表明，基因表达程序的表观遗传调控在训练和耐受中起着明确的作用。近期研究表明，重复外周注射LPS会在小胶质细胞中引发训练和耐受。Wendeln等的研究表明，在阿尔茨海默病模型中，LPS注射6个月后小胶质细胞的基因表达和增强子活性发生了改变，暗示了重复LPS后小胶质细胞功能的长期重编程。Zhang等发现，易于接近的增强子区域的表观遗传标记富集可以解释小胶质细胞对LPS的训练，而耐受反应则通过这些位点表观遗传标记的丧失进行调节。与这两项研究一致，我们的研究识别了LPS敏感的差异表达基因（DEGs），这些基因在其启动子中富含干扰素（IRF）家族和NFkB转录因子基序。IRF在干扰素、LPS和其他免疫刺激的作用下被诱导，并通过与IRF家族成员和其他转录因子（如PU.1、STAT1和NFkB）形成调控复合物来启动基因表达，进一步与干扰素敏感反应元件（ISRE）结合以调节干扰素和TLR信号通路。IRF家族转录因子在外周神经损伤后被证明对小胶质细胞中Il-1β的表达是必需的，并调节与疾病相关的小胶质细胞基因表达，包括Apoe和Trem2。IRF8在小胶质细胞中特别被充分表征，并被证明在出生后发育期间结合并调节小胶质细胞的增强子区域，以帮助建立小胶质细胞的身份和功能。缺失IRF8的小胶质细胞在形态和功能上表现出显著变化，表现为Iba-1表达减少、过程较少、吞噬能力降低、促炎基因表达减少和增殖潜力下降。NFkB的亚基p50/RelA在细胞核中的积累也与小胶质细胞中促炎细胞因子（如iNOS、Tnfα、Il-1β和Il-6）转录增加有关，这与小胶质细胞中促炎表型的形成有关。我们在我们的DEGs中发现了NfkB/p65和IRF8的直接结合位点的富集，提示这些转录因子的协调活动是大脑中免疫激活和耐受的关键调节因子。虽然外周给予LPS能够可靠地诱导大脑中的神经炎症反应，但研究表明，LPS在健康动物中大多无法穿透血脑屏障（BBB），除非以非常高的剂量施用。相反，外周施用LPS的影响可能通过脑膜和内皮细胞上的TLR4受体传递到大脑实质，随后向包括小胶质细胞在内的其他细胞类型发出信号。小胶质细胞可能与星形胶质细胞等其他细胞类型协作，持续表达促炎细胞因子，因为单独去除小胶质细胞并不能缓解LPS诱导的疾病行为。一旦免疫信号分子到达大脑实质，它们可以结合在神经元和胶质细胞上表达的细胞因子受体，直接或间接调节神经元的放电特性，从而最终影响电路功能和下游行为。在我们对公开可用的单细胞大脑图谱数据集的分析中，我们发现神经元细胞类型中LPS降低的基因表达最为显著，这些基因富含与神经调节和功能相关的基因本体术语。小胶质细胞、表现出边缘相关巨噬细胞（BAM）标志基因Mrc1高表达的血管周围巨噬细胞以及内皮细胞类型中，2xLPS敏感和4xLPS敏感基因的表达也较高，这些基因在免疫功能相关的基因本体上富集。尽管我们的分析暗示了可能驱动组织水平RNA-seq数据中观察到的基因表达差异的脑细胞类型，但用于分析的图谱数据集来自基线稳态条件下的小鼠。因此，LPS特异性的细胞类型贡献可能在此分析中被忽略。例如，我们研究中识别的4xLPS敏感差异表达基因簇独特地富含与星形胶质细胞发育相关的基因本体术语，表明星形胶质细胞在我们的免疫记忆模型中可能扮演着重要角色。已有研究显示，星形胶质细胞表现出LPS诱导的免疫训练和耐受，并在LPS暴露后对小胶质细胞的信号作出反应。未来在相同的重复LPS模型中进行的细胞类型特异性实验，如单细胞测序，可以进一步区分小胶质细胞与其他免疫细胞类型（如BAMs）以及其他脑细胞类型（包括神经元和星形胶质细胞）在我们观察到的基因表达差异中的贡献。最近的一项研究使用相同的重复低剂量LPS模型定义了2xLPS后的一种时间序列，其中小胶质细胞的形态、密度和吞噬标记物的表达变化先于GABA能突触的丧失，随后出现新物体识别任务中的记忆障碍。然而，该研究主要集中在2xLPS后6天内的短期变化，而对重复低剂量LPS在恢复后长时间对行为的影响尚未进行彻底调查。我们未能识别出重复LPS对与大脑疾病相关的一系列行为的长期影响。小鼠在2xLPS暴露后3小时表现出立即的疾病行为，包括嗜睡、眼睑下垂和毛发竖立，但在LPS处理几周后评估时未表现出学习和记忆任务或焦虑、抑郁和重复行为的长期缺陷。尽管我们的数据集样本量不足以按性别分开进行统计分析，但未来的实验可以专注于区分这些行为的性别特异性差异。虽然我们的数据表明，LPS模型未导致健康小鼠明显的长期行为缺陷，但已有研究显示，重复外周注射低剂量LPS的预处理可以减轻几个月后在阿尔茨海默病小鼠模型和中风、创伤性脑损伤的神经炎症反应中发展起来的疾病病理。这表明，二次疾病病理或损伤是揭示LPS对行为长期重编程效应的必要条件。在大脑中，伴随免疫初始和耐受的促炎基因表达变化已被充分记录，并伴随小胶质细胞形态的变化。我们研究中识别的2xLPS敏感和4xLPS敏感的差异表达基因（DEGs）富含之前在胚胎到后出生小鼠小胶质细胞发育过渡中动态表达的DEGs。在胚胎发育期间，未成熟的小胶质细胞显示出变形虫状的形态，有助于吞噬凋亡碎片、修剪发育中的突触，并在小胶质细胞沿发育的白质通路迁移至灰质时增加运动能力。随着后出生发育的进展，小胶质细胞的形态转变为完全分支的成熟形态，维持终生。我们LPS免疫记忆基因对变形虫状与成熟分支发育状态之间差异表达基因的富集表明，成人大脑对重复LPS暴露的形态适应可能涉及共享的发育基因和通路。虽然在LPS处理过程中，分支和棒状小胶质细胞的比例大致保持一致，但我们观察到在免疫记忆形成过程中，变形虫状与肥大形态状态之间的切换在大多数大脑区域中均有出现。肥大形态的特点是细胞体增大，突起更短、更粗、分支增多，这使小胶质细胞呈现“灌木状”外观。这种形态常见于阿尔茨海默病、亨廷顿病的人类病例及其小鼠模型，以及中风、加速衰老、慢性压力、抑郁和创伤性脑损伤的研究中。肥大的小胶质细胞在阿尔茨海默病的β-淀粉样蛋白斑块附近被描述为存在，并显示出与疾病相关的小胶质细胞（DAM）表型的表面标记物（如CD-33和TREM2）表达增加。TREM2在我们研究中使用的重复LPS模型中被描述为介导小胶质细胞对突触吞噬的减少及海马中免疫耐受形成时的形态变化。TREM2缺失抑制了与肥大形态相一致的微胶质细胞体积和突起长度及分支的急性增加。尽管在我们的整体组织分析中未将Trem2识别为显著的差异表达基因，但我们观察到2xLPS敏感DEGs在已发布的小胶质细胞特异性DAM表型基因列表中富集，指出肥大小胶质细胞形态在调节大脑中免疫记忆状态的重要性。我们还观察到，在对LPS的逐步暴露中，小胶质细胞沿血管端对端排列的情况（图6，图S9）。研究发现，大脑中空间上不同的小胶质细胞亚群会随着时间的推移与血管密切而稳定地相互作用，迁移至发育中的大脑实质，并调节毛细血管直径、血流和血管扩张反应。与血管相关的小胶质细胞在缺血性皮层中风、阿尔茨海默病和多发性硬化症的小鼠模型中也被发现数量发生变化。与我们的发现一致，单次腹腔注射LPS引起的全身炎症已被证明会导致小胶质细胞向脑血管迁移，并且随着重复LPS暴露，接触血管的小胶质细胞比例增加。此外，我们观察到的排列行为在文献中已有报道，其中棒状小胶质细胞在大鼠的弥漫性创伤性脑损伤中被发现与邻近的神经元过程端对端排列。这些棒状小胶质细胞的“列车”在脑损伤后的第一周内随着损伤和修复的变化而动态出现和消退。在受伤后的2小时和6小时，棒状小胶质细胞集聚，1天和2天后小胶质细胞比例下降，随后在受伤后7天再次重新聚集。与这些已记录的模式类似，我们研究中小胶质细胞端对端排列的发生在2xLPS处理后增加，在3xLPS处理时开始降低至基线水平，并在4xLPS处理时重新出现，这表明小胶质细胞可能在炎症后的不同延迟修复波次中参与，从免疫训练状态转变为耐受状态，此时细胞因子反应和明显的疾病行为已得到缓解。这可以解释Jung等人描述的短期学习和记忆障碍，这些障碍在LPS处理后6天观察到，而我们研究中未在LPS后几周的行为测试中观察到。未来的工作可以进一步特征化我们重复LPS模型中小胶质细胞与脑血管的相互作用，比如它们对血管直径的影响以及这些相互作用在LPS暴露后的时间动态，这将有助于深入理解我们观察到的LPS诱导的小胶质细胞排列行为的意义，以及其在炎症后的即时和延迟修复过程中的相关性。总的来说，我们研究的结果为免疫记忆形成中的小胶质细胞变化提供了新的见解。考虑到小胶质细胞是长寿命细胞（在人体中可存活4至20年），并且无需外周贡献即可自我更新，并通过差异化的增强子活性在局部大脑环境中表观遗传调节其功能，因此在先天免疫记忆形成过程中诱导的急性变化可能对大脑对疾病和损伤的反应产生持久影响。未来的研究可以将我们识别的急性变化与其他模型系统中发现的长期影响联系起来，以识别小胶质细胞如何维持先天免疫记忆并影响疾病风险。理解这些基本机制将有助于未来开发治疗方法，以增强或抑制在脑疾病背景下不当的小胶质细胞活性。原文网址：
https://jneuroinflammation.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12974-024-03198-1/figures/6
