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题目:
PGC-1b 与铁摄取在线粒体生成与破骨细胞活化中的协调作用
摘要
破骨细胞是分泌酸的多核细胞，具有很高的能量需求，并且含有大量的线粒体。如何将线粒体生成与破骨细胞分化整合在一起仍然未知。我们发现，随着破骨细胞的分化，PPARGC1B 基因（编码过氧化物酶体增殖物激活受体-γ辅激活因子 1β，PGC-1b）的转录在由活性氧（ROS）引发的cAMP反应元件结合蛋白（CREB）的作用下被诱导。在体外，敲低 PPARGC1B 抑制了破骨细胞的分化和线粒体的生成，而在小鼠中删除 PPARGC1B 基因则导致由于破骨细胞功能受损引起的骨质量增加。我们还观察到 PGC-1b 缺失的成骨细胞中存在缺陷。由于破骨细胞发育过程中对铁需求增加，通过铁调节蛋白2（IRP2）在转录后水平上诱导了转铁蛋白受体1（TfR1）的表达。TfR1 介导的铁摄取促进了破骨细胞的分化和骨吸收活性，这与线粒体呼吸的诱导、活性氧的产生以及 PPARGC1B 转录的加速有关。铁螯合剂抑制了破骨细胞的骨吸收，并在卵巢切除术（导致雌激素缺乏）后的骨质流失中起到了保护作用。这些数据表明，由 PGC-1b 调控的线粒体生成与通过 TfR1 进行的铁摄取，以及铁向线粒体呼吸蛋白的供应，共同组成了与破骨细胞活化和骨代谢相关的基本途径。1. 前言
破骨细胞的骨吸收是一个严格调控的过程，具有维持骨骼和矿物质稳态的基本生理功能。事实上，骨吸收的增加是多种疾病的显著特征，如骨质疏松症、癌症骨转移以及与类风湿性关节炎相关的关节破坏。破骨细胞是由单核-巨噬细胞系血液祖细胞分化而来的多核巨细胞。普遍认为，骨髓巨噬细胞（BMMs）在两种必需细胞因子——巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和肿瘤坏死因子（TNF）家族细胞因子核因子-κB受体活化因子配体（RANKL）的刺激下，分化为抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）阳性的前破骨细胞，随后这些细胞相互融合，形成多核的成熟破骨细胞。RANKL 与骨髓巨噬细胞（BMMs）上的 RANK 受体结合后，激活了 IkB 激酶（IKK）和丝裂原活化蛋白（MAP）激酶级联反应，进而激活了关键的核转录因子，如 NF-kB、c-Jun、c-Fos 和 NFATc1。越来越多的证据表明，RANK 下游的信号通路与由免疫受体酪氨酸活化基序（ITAM）含有的适配器所触发的信号通路汇聚，诱导细胞内钙水平的增加，随后激活了磷酸酶钙调神经磷酸酶（calcineurin）以及钙调素依赖性激酶（CaMK）IV，分别导致 NFATc1 和 CREB 的激活。作为分泌酸的多核细胞，破骨细胞处于高能量需求状态，并且拥有大量的线粒体。然而，目前尚不清楚在线粒体生成过程中，破骨细胞发育中的线粒体生物合成是如何被刺激的，以及这一过程如何与 RANKL 诱发的核分化程序协调。在此，我们证明了 PGC-1b（而非 PGC-1a）在骨髓巨噬细胞（BMMs）向前破骨细胞转变过程中被诱导，并在破骨细胞的终末分化中起到了重要作用。PGC-1b 调控的线粒体生成与通过上调的细胞表面转铁蛋白受体（TfR1）介导的铁摄取以及铁向线粒体的供应相协调。2. 结果
2.1 PGC-1b 在破骨细胞生成过程中的诱导线粒体的丰富性是破骨细胞的一个著名组织学特征，我们发现在线粒体DNA和蛋白质含量在骨髓巨噬细胞（BMMs）向抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）阳性前破骨细胞转变过程中显著增加（补充图1a）。我们通过线粒体荧光染料（Mitotracker）染色和荧光活化细胞分选（FACS）分析确认了线粒体含量的增加（补充图1b）。破骨细胞生成过程中，线粒体编码基因的mRNA水平也增加（补充图1c）。基因芯片分析结果进一步表明，当BMMs发生终末分化为破骨细胞时，编码线粒体呼吸复合物I–V成员的mRNA上调（补充图2）。
在线粒体生成的调控因子中，PGC-1b的表达在破骨细胞生成过程中显著且特异性地在mRNA（图1a和补充图3a）和蛋白质水平（图1b）上被诱导，而PGC-1a的mRNA则没有表达（补充图3a）。敲低Ppargc1b显著抑制了TRAP阳性破骨细胞的形成（图1c），并且伴随着线粒体基因表达的抑制（补充图3b）。这些结果表明，PGC-1b是通过促进线粒体生成调节破骨细胞分化的重要因子。在通过与PGC-1b相互作用来刺激线粒体基因表达的转录因子中，核呼吸因子（NRF）-1、NRF-2和雌激素相关受体（ERR）-α在破骨细胞系细胞中表达（补充图3a）。2.2 CREB 通过 ROS 诱导 Ppargc1b 的转录
基于先前观察到 CREB 调控破骨细胞生成并且诱导编码 PGC-1a 的 Ppargc1a 转录的结果，我们研究了 CREB 在连接破骨细胞生成与 PGC-1b 诱导中的作用。确实，Ppargc1b 的 5' 上游区域存在推测的 CREB 结合 DNA 元件（补充图 3c），并且逆转录病毒表达 CREB 增加了 Ppargc1b 的表达，而 CREB 的显性负性抑制剂 A-CREB 在破骨细胞分化过程中抑制了 Ppargc1b 的表达（图 1d）。染色质免疫沉淀（ChIP）实验表明，在破骨细胞分化过程中，CREB 与位于 Ppargc1b 启动子上游 5.4 kb 和 4.2 kb 的 CRE 元件 1 和 2 的结合增加了（图 1e，补充图 3c）。连接至荧光素酶报告基因构建体的 Ppargc1b 启动子片段（–5.6 kb 至 –4.2 kb）在 RANKL 刺激下响应 CREB 介导的转录激活，这一效应被显性负性 A-CREB 抑制（图 1f）。因此，Ppargc1b 是破骨细胞生成过程中 CREB 的直接转录靶点。与先前发现的活性氧（ROS）在某些细胞类型中是 Ppargc1a 和 Ppargc1b 的强效诱导因子的结果一致，使用 N-乙酰半胱氨酸（NAC）清除 ROS 显著抑制了 Ppargc1b 的诱导以及破骨细胞的分化（图 1g），并减少了线粒体基因的表达（补充图 3d）。这些数据支持了在破骨细胞生成过程中 ROS 的增加参与了 CREB 对 PGC-1b 的转录激活，从而加速了破骨细胞生成。![]()
图1 通过 CREB 介导的 ROS 诱导 Ppargc1b 在破骨细胞生成中的转录。
(a) 通过 RT-PCR 检测骨髓巨噬细胞（BMM）、前破骨细胞（preOC）和成熟破骨细胞（mOC）中的 Ppargc1b 表达。
(b) 免疫印迹分析检测 BMM 和 preOC 中的 PGC-1b 蛋白。在来自 PGC-1b 敲除（Ppargc1b–/–）小鼠的 preOC 中未检测到相应条带，证实了抗体的特异性。
(c) 通过短发夹 RNA（shRNA；顶部）敲低 PGC-1b。显示了在有或没有 shRNA 存在下形成的代表性 TRAP 阳性破骨细胞（底部），以及 TRAP 阳性多核细胞（MNC，含三个以上核）的数量（右侧）。Cont.，对照。比例尺，200 μm。**P < 0.01（n = 4）。
(d) 通过 CREB 增加前破骨细胞中内源性 PGC-1b 的表达，并且 A-CREB 抑制了这一表达。**P < 0.01（n = 4）。
(e) 通过 ChIP 分析 CREB 与 PGC-1b 启动子上 CRE1 和 CRE2 的结合（补充图 3c）。实验重复了三次；显示了两个代表性结果（实验1和3）。
(f) 在 RANKL 刺激下，RAW264.7 细胞中含有 PGC-1b 启动子 CRE 的荧光素酶报告基因实验。*P < 0.05；**P < 0.01（n = 3）。
(g) 通过 NAC 处理抑制前破骨细胞中 PGC-1b 的表达。P < 0.01（n = 3）。
2.3 PGC-1b 在体内骨代谢中的功能
为了表征 PGC-1b 在破骨细胞发育和骨吸收中的生理功能，我们分析了缺乏 Ppargc1b 的小鼠。血清中 I 型胶原降解产物 CTX 的浓度在 Ppargc1b 敲除（Ppargc1b–/–）小鼠中显著降低（图 2a），提示其骨吸收功能受损。对 Ppargc1b–/– 小鼠的组织学分析显示，大量骨组织未被吸收（图 2b），并且在骨小梁中存在软骨残余（图 2c）。详细的骨组织形态测量结果表明，尽管 Ppargc1b–/– 小鼠的骨体积比（BV/TV）显著增加，但覆盖骨表面的破骨细胞面积百分比（Oc.S/BS）与野生型小鼠无明显差异（图 2d）。然而，PGC-1b 缺失的破骨细胞显示出异常的形态，其骨吸收活性（通过侵蚀深度测定）显著受损（图 2e）。我们从 Ppargc1b–/– 小鼠的骨髓中分离出骨髓巨噬细胞（BMMs），并在 M-CSF 和 RANKL 存在的条件下在体外培养，结果显示这些细胞未能形成 TRAP 阳性的多核破骨细胞，这一现象通过逆转录病毒表达 PGC-1b 得到了逆转（补充图 4a），并且通过与成骨细胞共培养部分恢复了这一效应（补充图 4b）。在 PGC-1b 缺失的前破骨细胞中，线粒体编码基因的表达受到抑制（补充图 3e），线粒体酶的功能也受到抑制（补充图 3f）。此外，当我们将相同数量的成熟破骨细胞放置在牙本质切片上时，与野生型破骨细胞相比，PGC-1b 缺失的成熟破骨细胞吸收的凹坑面积显著减少（补充图 4c）。免疫印迹分析显示，Ppargc1b–/– 小鼠生成的破骨细胞中 Src 在 Tyr416 位点的磷酸化水平降低（补充图 4e），这可能与减少的肌动蛋白环形成（补充图 4d）一起，导致 PGC-1b 缺失的成熟破骨细胞的骨吸收功能受损。总体而言，这些结果表明，在缺乏 PGC-1b 的情况下，破骨细胞的骨吸收功能受损，尽管破骨细胞的形成在体内通过某些成骨细胞来源的因子得到了补偿。事实上，Ppargc1b–/– 小鼠骨中的 RANKL mRNA 表达增加了（补充图 4f）。详细的骨组织形态测量分析还意外地显示，骨形成参数，如骨形成率（BFR）、矿化表面（MS）、成骨细胞表面（Ob.S）和类骨质表面（OS），在 Ppargc1b–/– 小鼠中均显著降低（图 2d）。相应地，成骨细胞特异性产物骨钙素的血清浓度在 Ppargc1b–/– 小鼠中减少（图 2a），表明骨形成受损。因此，可以得出结论，在 Ppargc1b–/– 小鼠中，骨形成的减少可能会导致骨质减少；然而，由于骨吸收受损，通过微型 CT 扫描测定的三维骨体积比实际上比野生型小鼠更高（图 2f）。我们从 Ppargc1b–/– 小鼠的颅骨中分离出原代成骨细胞，发现碱性磷酸酶（ALP）活性以及成骨细胞标志基因 Runx2、Osterix 和骨钙素的表达与野生型成骨细胞相比显著减少（补充图 4g）。结合 PGC-1b 在原代成骨细胞中的表达（数据未显示），这些结果表明 PGC-1b 也在成骨细胞中发挥作用，而在 Ppargc1b–/– 敲除小鼠中观察到的骨形成受损至少部分归因于 PGC-1b 缺失的成骨细胞的自主性功能障碍（注：PGC-1β在成骨中也起作用）。![]()
图2 PGC-1b 敲除（Ppargc1b–/–）小鼠中骨吸收受损。
(a) 野生型（WT）和 Ppargc1b–/– 小鼠血清中的胶原降解产物（CTX）和骨钙素（Ocn）浓度。*P < 0.05（每组 n = 4 或 5）。
(b) 胫骨干骺端的 Von Kossa 染色。比例尺，500 μm。
(c) 骨小梁中的软骨残留物（黑色箭头）。比例尺，50 μm。
(d) 胫骨干骺端的组织形态测量分析。BV/TV，骨体积/组织体积；Oc.S，破骨细胞表面；OS，类骨质表面；Ob.S，成骨细胞表面；MS，矿化表面；BFR，骨形成率，分析对象为18周龄的雌性野生型和 Ppargc1b–/– 小鼠。数据已根据骨表面（BS）校正。*P < 0.05；**P < 0.01（每组 n = 4 或 5）。
(e) Ppargc1b–/– 小鼠骨中的破骨细胞数量增加，但其形态异常，且侵蚀深度减少。骨小梁上的代表性破骨细胞（顶部，用白框标示）用白线勾勒，侵蚀深度用黄色箭头标示（下方）。比例尺：25 μm（上）和 5 μm（下）。*P < 0.05；**P < 0.01。
(f) 通过 microCT-40 扫描近端胫骨，显示了代表性图像和三维骨体积分数（BV/TV）。比例尺，500 μm。P < 0.01（n = 6–9）。
2.4 在破骨细胞分化过程中 TfR1 的诱导
由于线粒体中许多呼吸复合物蛋白含有血红素，随着破骨细胞分化过程中线粒体生成的增加，按每个细胞计算的血红素含量显著增加（补充图 5a）。我们发现转铁蛋白受体1（TfR1）的转录本在骨髓巨噬细胞（BMMs）中几乎检测不到，但在破骨细胞生成过程中被诱导（补充图 5b）。通过逆转录 PCR（RT-PCR）分析证实了前破骨细胞和成熟破骨细胞中 TfR1 mRNA 的诱导（图 3）。我们在破骨细胞谱系细胞中未检测到 TfR2 或转铁蛋白本身（图 3a 和补充图 5b）。蛋白质印迹分析表明，随着 BMMs 分化为前破骨细胞和成熟破骨细胞，TfR1 蛋白显著诱导（图 3b）。因此，在与铁代谢相关的关键分子中，TfR1 特异性地在破骨细胞生成过程中被诱导。TfR 的表达受细胞铁状态的调控，在铁缺乏的情况下，铁调节蛋白（IRP）与 TfR mRNA 3' 非翻译区的铁响应元件（IRE）结合，稳定 mRNA 并增加其稳态水平。通过电泳迁移率变动分析（EMSA）检查细胞提取物，发现随着 BMMs 向破骨细胞分化，IRP2 与 IRE 的结合（图 3c）和 IRP2 蛋白的总细胞含量（图 3b）增加。这些结果表明，随着破骨细胞分化的进行，铁需求随着线粒体生成的增加而增加，而 IRP2 蛋白通过结合 TfR1 mRNA 的 IRE 在满足破骨细胞中增加的铁需求方面发挥重要作用。2.5 通过 TfR1 介导的铁摄取促进了破骨细胞的分化
接下来，我们研究了通过上调的 TfR1 蛋白摄取的铁在破骨细胞分化和/或骨吸收活性中的功能作用。用脱铁转铁蛋白（apo-transferrin）以及全铁转铁蛋白（即铁和脱铁转铁蛋白的预形成复合物）处理 BMMs，在 RANKL 的诱导下，剂量依赖性地刺激了 TRAP 阳性、多核破骨细胞的形成（图 3d、e、h）。这种效应是通过铁-转铁蛋白与 TfR1 的相互作用介导的，因为通过小干扰 RNA（siRNA）处理敲低 TfR1 的表达抑制了转铁蛋白的刺激效应（图 3f）。通过去铁胺（DFO）螯合铁剂剂量依赖性地抑制了破骨细胞的生成（图 3g、h），表明破骨细胞生成过程依赖于铁的摄取。DFO 的抑制作用是由于铁摄取的抑制，因为它可以通过增加铁的浓度而逆转（图 3h）。综合来看，这些结果表明，铁和转铁蛋白的复合物通过上调的 TfR1 蛋白被前破骨细胞摄取，并刺激了终末分化为成熟破骨细胞的过程。为了进一步了解铁-转铁蛋白摄取刺激破骨细胞形成的机制，我们通过蛋白质印迹分析检查了转铁蛋白对 RANK 下游破骨细胞生成激酶活化的影响。RANKL 刺激前破骨细胞诱导了 p44/42 ERK、JNK、p38 和 IkB 的磷酸化（图 3i）。转铁蛋白处理增强了这些关键分子的磷酸化强度和/或持续时间，而 DFO 抑制了它们的磷酸化（图 3i）。转铁蛋白处理增强了 c-fos 和 NFATc1 mRNA 的表达，而 DFO 通过铁螯合剂抑制了其表达（图 3j）。这些结果表明，铁摄取对于通过 MAP 激酶和 IKK 级联反应下游的 RANK 有效的破骨细胞生成信号传导是必要的。![]()
图3 转铁蛋白（Tf）受体在破骨细胞分化中的诱导及铁-转铁蛋白对破骨细胞生成的刺激作用。
(a) 通过RT-PCR检测骨髓巨噬细胞（BMM）、前破骨细胞（preOC）和成熟破骨细胞（mOC）中的 TfR1 表达。培养第3天、第7天和第14天的原代成骨细胞（OB）也被用于检测。
(b) 通过蛋白质印迹检测 TfR1 和 IRP2 的表达。
(c) IRP 与 IRE 结合的凝胶阻滞实验。未添加 2-巯基乙醇（2-ME）的样品检测到 IRE 结合活性，而添加 2-ME 激活潜在的 IRP1 与 IRE 结合，因此反映了总的细胞 IRP 含量。 表示 IRP2-IRE 复合物对应的条带。
(d–h) 转铁蛋白（Tf）（d、e、h）、TfR1 敲低（f）和去铁胺（DFO）螯合铁对破骨细胞生成的影响（g、h）。Cont.，对照。比例尺，200 μm。*P < 0.05；**P < 0.01（n = 6）。DFO 的抑制作用通过增加氯化铁浓度剂量依赖性地逆转（h，中）。小鼠脱铁转铁蛋白（Apo-mTf）（d、e）以及人全铁转铁蛋白（Holo-hTf，转铁蛋白和铁的预形成复合物）（h，右）剂量依赖性地刺激了破骨细胞生成。
(i) 通过蛋白质印迹分析前破骨细胞中总蛋白水平以及 p44/42 ERK、JNK、p38 和 IkB 的磷酸化形式。
(j) 通过定量 RT-PCR 检测 c-fos 和 NFATc1 mRNA 表达。P < 0.01（n = 4）。
2.6 铁摄取与 PGC-1b 之间的正反馈调节
如报道所示，单独强制表达 CREB 足以刺激破骨细胞的形成，而用 A-CREB 感染则显著抑制了基线破骨细胞生成以及转铁蛋白的刺激效应（补充图 6a）。当我们使用转铁蛋白刺激破骨细胞生成时，CREB 的磷酸化增加；相反，当我们通过去铁胺（DFO）螯合铁抑制破骨细胞生成时，CREB 的磷酸化减弱（补充图 6b）。转铁蛋白处理，刺激了破骨细胞生成（图 3d）和线粒体基因表达（补充图 6c），同时增加了活性氧（ROS）的产生（补充图 6d）和 PGC-1b 的表达（补充图 6e）。相反，铁螯合剂 DFO 抑制了 ROS 的产生（补充图 6d）和 PGC-1b 的表达（补充图 6e）。N-乙酰半胱氨酸（NAC）的处理抑制了 CREB 的磷酸化（补充图 6b）。这些数据支持了铁摄取与 PGC-1b 之间的正反馈调节模型；铁摄取和随后线粒体的激活伴随 ROS 的增加，增强了 CREB 对 PGC-1b 的转录激活，从而加速破骨细胞生成。事实上，强制表达 CREB 显著挽救了 PGC-1b 缺失的骨髓巨噬细胞（BMMs）的分化缺陷（补充图 6f）。2.7 铁摄取促进了成熟破骨细胞的功能
当我们将通过 M-CSF 和 RANKL 在体外生成的成熟破骨细胞培养在牙本质切片上时，吸收坑的面积在有转铁蛋白存在的情况下显著增加，而经过 DFO 处理后则减少（图 4a）。相应地，CTX 的释放量通过转铁蛋白显著增加，而经过 DFO 处理后减少（图 4b）。这些结果表明，成熟的破骨细胞具有功能性 TfR1，并且通过 TfR1 介导的铁摄取促进了成熟破骨细胞的骨吸收功能。细胞骨架重组，如肌动蛋白环的形成，对成熟破骨细胞的骨吸收功能非常重要。转铁蛋白刺激了肌动蛋白环的形成，而 DFO 明显抑制了这一过程（图 4c），这表明铁对成熟破骨细胞功能的影响至少部分通过细胞骨架的重组来介导。值得注意的是，在转铁蛋白存在的情况下，破骨细胞挖掘的吸收坑呈线性，而在没有转铁蛋白补充的对照培养物中，吸收坑呈点状（图 4d）。当追踪破骨细胞的足迹时，很明显在转铁蛋白的存在下破骨细胞的移动性显著增强（图 4d），这表明铁-转铁蛋白刺激了破骨细胞的迁移活性。我们通过跨膜迁移实验（Transwell）证实了转铁蛋白的刺激效应和 DFO 的抑制效应对前破骨细胞趋化性的影响（图 4e）。2.8 铁供应调节了体内的破骨细胞骨吸收
为了确定通过铁摄取调节破骨细胞分化和功能是否与体内相关，我们研究了铁螯合对雌激素缺乏后骨吸收活性的影响。因此，我们评估了 12 周龄卵巢切除（OVX）小鼠在有或无 DFO 处理下的骨吸收和骨量情况。OVX 刺激了破骨细胞骨吸收，表现为尿中 CTX 排泄增加（图 4f）和骨切片上 TRAP 染色的增加（图 4g），从而导致骨质减少（图 4h）。铁螯合剂 DFO 抑制了骨吸收的加速（图 4f，g），并防止了 OVX 后的骨质流失（图 4h）。详细的微观结构分析表明，OVX 导致的组织体积骨体积比（BV/TV）、连接密度（Conn-Dens）、结构模型指数（SMI）和骨小梁厚度（Tb.Th）的下降通过 DFO 处理显著改善（图 4i 和补充图 7）。这些数据表明，铁显然是体内骨吸收的重要调节因子。![]()
图4 转铁蛋白（Tf）促进，铁螯合剂抑制成熟破骨细胞的骨吸收。
(a) 转铁蛋白（500 nM）刺激了成熟破骨细胞的骨吸收，而去铁胺（DFO，100 mM）则抑制了这一过程。比例尺，250 μm。通过 NIH Image 定量吸收坑（右侧）。*P < 0.05（n = 3）。
(b) 通过测量 CTX 释放到条件培养基中评估骨吸收活性。*P < 0.05；**P < 0.01，与对照组相比（n = 3-5）。
(c) 转铁蛋白刺激了肌动蛋白环的形成，而 DFO 则抑制了这一过程。比例尺，250 μm。计算具有肌动蛋白环的破骨细胞数量（右侧）。*P < 0.05；**P < 0.01（n = 6）。
(d) 用考马斯亮蓝染色牙本质切片上成熟破骨细胞的足迹（左侧），并测量足迹长度（右侧）。比例尺，100 μm。
(e) 在跨膜迁移实验中，转铁蛋白刺激了前破骨细胞的趋化性，而 DFO 抑制了这一过程。*P < 0.05；**P < 0.01（n = 4）；- = 未处理（a–e）。
(f–i) 铁供应的阻断可以防止由雌激素缺乏引起的破骨细胞骨吸收加速和骨质流失。ddY 小鼠接受卵巢切除术（OVX）或假手术（Sham），随后接受载体（PBS）或去铁胺（DFO）处理。尿中 CTX 排泄量经过尿肌酐（Cr）浓度校正（f）。卵巢切除术后 TRAP 阳性破骨细胞显著增加（g，箭头），但在 DFO 处理的 OVX 小鼠中得到抑制。比例尺，100 μm。通过 microCT-40 扫描胫骨干骺端的骨小梁（h），并获得三维骨体积分数（BV/TV）（i）。比例尺，500 μm。*P < 0.05；P < 0.01（每组 n = 6）。
3. 讨论
破骨细胞富含线粒体，破骨细胞通过囊泡型质子泵主动分泌酸来溶解羟基磷灰石矿物，并通过降解蛋白质的酶吸收基质蛋白，同时在骨上迁移。因此，合理推测线粒体功能对于满足破骨细胞的高能量需求是至关重要的。在本研究中，我们证明了线粒体生物合成在破骨细胞中由 PGC-1b 调控的核程序与通过细胞表面的转铁蛋白受体（TfR1）介导的铁摄取相协调，这种机制通过转录后途径上调。PGC-1（现称为 PGC-1a）最初在棕色脂肪组织中作为一种与 PPARγ 互作的冷诱导辅激活因子被鉴定出来，而 PGC-1b 是 PGC-1a 的最接近同源物。PGC-1b 主要在具有高氧化代谢的组织中表达，如棕色脂肪组织、心肌和骨骼肌，功能缺失和功能获得实验表明 PGC-1b 参与了线粒体的氧化能量代谢。我们在本研究中表明，Ppargc1b 转录在破骨细胞分化过程中被诱导，并通过转录激活线粒体呼吸链相关基因在终末分化过程中发挥重要作用。这些数据提供了一个模型（图 5），其中破骨细胞生成过程中，RANK 和 ITAM 下游激活的 CREB 诱导了 PGC-1b 的转录，PGC-1b 反过来刺激线粒体的生物合成，导致铁需求增加；通过上调的 TfR1 蛋白摄取的铁被供应到线粒体中的血红素蛋白和铁硫簇中，增强线粒体呼吸和 ROS 的产生，进一步通过正反馈机制通过 CREB 加速 PGC-1b 的转录（图 5）。据报道，RANKL 通过 TRAF6、Rac1 和 NADPH 氧化酶增加骨髓巨噬细胞中的 ROS 产生，ROS 刺激破骨细胞的分化和骨吸收功能，并且破骨细胞本身通过 NADPH 氧化酶产生 ROS。因此，抗氧化剂如抗坏血酸和 NAC 可防止卵巢切除（OVX）引起的骨质流失，雌激素缺乏被认为通过降低破骨细胞中的抗氧化防御而加速骨吸收。我们的数据表明，ROS 增强了破骨细胞生成激酶的激活，并通过 CREB 磷酸化参与 Ppargc1b 的诱导，从而增加其转录活性。CREB 在破骨细胞生成中的关键靶点是 c-fos 和 NFATc1，我们的结果表明 PGC-1b 是 CREB 在破骨细胞中的另一个重要靶点，进而刺激线粒体生物合成。最近的研究发现，PPARγ 通过转录诱导 c-fos 基因调控破骨细胞生成，这提示 PGC-1b 可能在破骨细胞中支持 PPARγ 的转录活性。敲低实验和 Ppargc1b–/– 骨髓细胞体外培养的结果表明，PGC-1b 在体外破骨细胞形成中是必需的，而 Ppargc1b–/– 小鼠体内的破骨细胞数量似乎正常。然而，在体外观察到的破骨细胞分化缺陷在体内得到了补偿，这种现象在其他基因（如编码 DNAX 激活蛋白 12 (DAP12) 和 NF-kB 诱导激酶 (NIK) 的基因）中也有所观察。考虑到 Ppargc1b–/– 小鼠骨中的 RANKL mRNA 表达增加，以及 PGC-1b 缺失的破骨细胞祖细胞在体外的分化缺陷在成骨细胞的存在下部分得到挽救，可以推测 RANKL 表达的代偿性增加以及某些其他成骨细胞衍生的因子在体内支持了敲除小鼠中的破骨细胞发育。相反，PGC-1b 对成熟破骨细胞的骨吸收功能至关重要，在这种细胞类型中，其缺失在体内无法补偿，表现为骨吸收受损。铁对于许多生物过程（包括氧气输送和酶促反应）至关重要，而铁的过量会导致多种病理。因此，其供应受到严格调控。本研究揭示了破骨细胞中的高铁需求和 IRP2 在通过上调 TfR1 刺激铁摄取中的重要作用。铁摄取增加在破骨细胞发育中有两个功能性后果：首先，通过向线粒体提供铁增加线粒体的呼吸能力；其次，通过 ROS 产生加速 CREB 介导的 PGC-1b 转录诱导。铁在骨吸收中的作用通过发现铁螯合剂防止卵巢切除后骨吸收加速和骨质流失得到支持。![]()
图5 破骨细胞发育和骨吸收调控中新发现的线粒体通路模型。
该模型展示了通过细胞表面转铁蛋白受体（TfR1）介导的铁摄取与 PGC-1b 在线粒体生物合成和破骨细胞活化中的协调作用。它与 RANK 下游的信号通路协同作用，增强了破骨细胞的分化和功能。地中海贫血是全球最常见的遗传性疾病，曾经在儿童期是一种致命的疾病；然而，随着输血计划和螯合疗法延长了患者的寿命，骨质疏松症成为了一个重要的并发症。地中海贫血中骨异常的病理生理机制是多因素的，涉及次级内分泌功能障碍、骨髓扩展、铁沉积和去铁胺的不利影响。尽管其分子发病机制尚未完全了解，但其特点是高骨转换伴随过度的骨吸收和增加的 RANKL/OPG 比例。我们的数据提出了一种新的解释，即铁过载导致破骨细胞的产生和功能增加，可能是地中海贫血患者骨吸收加速的原因。此外，考虑到铁过载在红细胞以外的组织中是慢性炎症和恶性肿瘤的主要特征，通过白细胞介素-6 产生和刺激铁调素表达，这些情况经常与破骨细胞的活化有关。我们在本研究中揭示的通过铁摄取激活破骨细胞线粒体的途径可能在以过度骨吸收为特征的骨质疏松症的发病机制中具有更广泛的意义。总之，我们关于 PGC-1b 和铁摄取在破骨细胞生成网络中的重要功能的研究，通过协调线粒体生物合成和细胞分化程序，可能为开发针对骨质疏松症等伴随破骨细胞骨吸收加速的各种骨病的治疗策略提供了平台。原文网址：https://www.nature.com/articles/nm.1910
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