影响因子：14.7
神经血管单元（NVU）是一个复杂的多细胞结构，有助于维持大脑的稳态和血脑屏障（BBB）的完整性。虽然有大量证据表明NVU的改变与脑血管疾病和神经退行性疾病有关，但其背后的分子机制尚不清楚。在本文中，我们通过研究一种携带清道夫受体B2（Scavenger Receptor B2）突变的斑马鱼胚胎，来探讨不同NVU成分之间的相互作用。清道夫受体B2是一种高度保守的内溶酶体蛋白，主要在放射状胶质细胞（RGCs）中表达。通过实时成像和基因操作，我们展示了突变RGCs的内溶酶体酸化受损，导致Notch3信号通路受阻，从而引发过度的神经发生和胶质分化减少。我们进一步证明，神经元与胶质细胞平衡的改变导致了血管内皮生长因子（VEGF）和Wnt信号的受损，从而引发严重的血管缺陷、脑出血以及血脑屏障的渗漏。总的来说，我们的研究提供了关于NVU形成和功能的见解，并为研究涉及白质缺陷和血管异常的疾病提供了新思路。
近年来，神经血管单元（NVU）的概念在神经科学和血管生物学领域中获得了广泛关注。NVU指的是大脑中的一个复杂的多细胞结构，包括神经元、星形胶质细胞、周细胞以及特化的内皮细胞（ECs），它们协同作用，帮助维持大脑的稳态，调节血流并确保血脑屏障（BBB）的正常功能。形成BBB血管壁的内皮细胞表现出一系列独特的特征，与其他血管床中的内皮细胞不同。它们的器官特异性来源于其通过紧密连接严格控制血液和大脑实质之间物质的通透性，这些紧密连接形成了几乎不可渗透的屏障，保护着脆弱的神经环境，免受潜在毒素和体内成分波动的影响，并且含有一组特定的转运蛋白。最近的研究还揭示了BBB内皮细胞的独特基因表达谱。尽管内皮细胞的这种特化对于维持大脑的稳态和保护神经功能至关重要，但其背后的分子基础直到最近才开始被揭示。
大脑血管异常可能导致多种有时危及生命的脑血管疾病，包括缺血性和出血性中风、血管畸形、血管性认知障碍和痴呆。在这类疾病中，脑小血管疾病（CSVDs）包括一系列自发性或遗传性的大脑小动脉、毛细血管和小静脉的病理改变，主要发生在白质区域。这些改变导致脱髓鞘、BBB功能障碍、胶质激活和轴突损伤。尽管越来越多的研究表明神经-血管和胶质-血管接口在NVU和BBB的形成与功能中起着至关重要的作用，但有关脑血管疾病，特别是CSVD的研究，主要集中在周细胞和内皮细胞功能障碍的表征上。相比之下，我们对神经实质细胞如何影响CSVD及其与血管的病理相互作用的分子信号通路的理解还很有限。
在胚胎发育过程中，多能的放射状胶质细胞（RGCs）是神经元和胶质细胞（如星形胶质细胞和少突胶质细胞）的主要来源。少突胶质细胞是中枢神经系统的髓鞘形成细胞，而星形胶质细胞是一种具有特殊功能的胶质细胞，其末梢包裹着血管。它们从RGCs中产生，并经历增殖、迁移和分化，生成多样的胶质细胞群体。胶质细胞发育的时序和空间分布受到内在遗传程序、邻近细胞的外部信号和环境因素的严格调控。其中，Notch信号通路，特别是Notch3受体，被认为在促进RGCs向胶质细胞分化中起关键作用。
在此，我们报告了一种斑马鱼突变体，该突变体表现出RGC分化受损和异常胶质发生，进而导致脑血管生成缺陷、早期微出血、BBB功能障碍以及髓鞘形成受损，这些特征与CSVD的表现高度相似。该突变影响了溶酶体膜蛋白II（Limp2）/清道夫受体B2（SCARB2），这是一种存在于晚期内涵体和溶酶体膜中的蛋白质，在脊椎动物中高度保守，包括人类。通过实时成像和基因操作，我们发现Scarb2a缺失导致突变RGCs内溶酶体酸化受损，并揭示了该表型如何导致Notch3处理受损和Notch3信号受阻，从而引发过度神经发生和异常胶质分化。最后，我们证明，神经元/胶质细胞平衡的改变导致血管内皮生长因子（VEGF）和Wnt信号的激活受损，引发严重的血管缺陷、出血和BBB渗漏。总体而言，我们的研究突出了异常胶质细胞分化与脑血管缺陷之间的联系，并表明在非血管细胞中阻碍Notch信号处理会在整个中枢神经系统血管系统中引发显著的缺陷，进一步影响BBB的形成和功能。
scarb2a突变体表现出中枢神经系统血管生成缺陷、血脑屏障功能障碍和间歇性颅内出血
我们通过CRISPR/CAS突变筛选生成了scarb2a突变体，目的是识别控制CNS血管生成的基因。该突变在第73位氨基酸处引入了一个提前的终止密码子，导致保守的C端跨膜结构域和胆固醇结合位点的缺失（补充图1a、b）。
在受精48小时（hpf）时，scarb2a突变体与其野生型同胞在体长短小和躯干弯曲方面表现出显著差异。此外，约25-30%的突变体在大约40 hpf时，主要在后脑出现脑室内出血（图1b，箭头，补充图1c）。纯合幼鱼在受精后约8-14天（dpf）死亡，且与出血的存在无关（补充图1d），表明出血本身并不是致死的主要原因。相比之下，杂合体动物可以存活至成年，并具有生育能力。在4 dpf时，观察到了与癫痫发作相关的行为异常，例如爆发性活动和全身震颤。
为了确定出血表型的性质，我们首先获得了内皮细胞特异性报告基因Tg(kdrl:mCherry)的共聚焦图像，结果显示存在严重缺陷，特别是在环状中央动脉（CtAs）中。CtAs作为血管生成性芽从原始后脑通道（PHBCs）的背侧表面在32-36小时受精后（hpf）形成，并逐渐侵入后脑，在那里它们与基底动脉（BA）吻合（图1c）。在32-34 hpf时，scarb2a突变体的PHBCs、BA或CtAs中未观察到显著缺陷（图1d, e；补充图1e-g）。然而，在大约38 hpf时，野生型（wt）CtAs与BA建立连接，形成管腔，并失去丝状伪足（图1f），而突变体CtAs则严重紊乱，呈现大量丝状伪足延伸，并建立异常连接（图1g）。这一表型在52 hpf时进一步恶化，野生型后脑显示出结构良好的、具有典型图案的CtAs系统（图1h, j），而scarb2a突变体则呈现出一个围绕BA的紊乱、塌陷和过度分支的毛细血管网络（图1i–k）。在60 hpf时，我们还检测到CtAs中内皮细胞（EC）核的数量增加，这表明这些表型也涉及EC过度增殖（补充图1h–j）。值得注意的是，这些表型仅特异性地出现在脑血管系统中，因为在相似发育阶段的躯干体节间血管中未观察到缺陷（补充图1k, l）。随后，我们通过时间延迟成像评估了Tg(fli1:EGFP;gata1a:DsRed);scarb2a−/−胚胎在40-60 hpf期间的出血性出血情况（图1l, m和补充电影1）。这种双转基因报告基因结合了泛内皮标记物fli1和红细胞标记物gata1，能够同时可视化血管网络和循环的红细胞。我们发现，在野生型胚胎中，gata1+红细胞在整个实验过程中均正常局限于后脑毛细血管内。相比之下，从大约44 hpf开始，scarb2a突变体的后脑中检测到越来越多的出血区域（图1m，箭头所示），导致CtAs中的大量血液流入脑室。为了研究scarb2a突变体是否也表现出血脑屏障（BBB）功能障碍，我们在60 hpf时对胚胎进行了2000 kDa罗丹明葡聚糖（一种已知在斑马鱼胚胎BBB中保留的示踪剂）的血管内注射。如图1n, o所示，scarb2a突变体表现出从CtAs中明显的染料外渗，表明BBB完整性受损。此外，葡萄糖转运蛋白1（Glut1）的表达在60 hpf时显著降低，Glut1是脊椎动物BBB ECs的公认标志物，这一发现得到了Tg(glut1b:mCherry;kdrl:EGFP)共聚焦图像（图1p, q’）和整体原位杂交（补充图1m, n）的证据支持。因此，scarb2a突变体表现出中枢神经系统（CNS）血管生成缺陷，伴随BBB功能障碍和渗漏以及间歇性颅内出血。
值得注意的是，之前并未描述过scarb2在内皮细胞（ECs）中的存在。通过分析从小鼠发育中的大脑和脊髓获得的单细胞RNA测序（scRNA-Seq）数据，我们发现小胶质细胞、新形成的少突胶质细胞（NFOLs）和少突胶质细胞前体细胞（OPCs）是表达Scarb2的前十种细胞类型之一（补充图2a）。类似地，在人类中，Scarb2也主要由OPCs和小胶质细胞表达。在斑马鱼胚胎中，据报道在24小时受精后（hpf）时，scarb2a mRNA存在于脊索和整个发育中的中枢神经系统（CNS）中。然而，当时并未描述在大脑中表达scarb2a的具体细胞类型。为了准确绘制scarb2a的表达图谱，我们生成了一个转基因报告基因TgBAC(scarb2a:KalTA4)，该基因在scarb2a启动子下游表达KalTA4驱动子，同时去除了scarb2a的编码序列（补充图2b）。这种策略使我们能够在野生型和突变型胚胎中可视化表达scarb2a的细胞。在22、48和60 hpf时，对TgBAC(scarb2a:KalTA4;UAS:mkate2;kdrl:EGFP)的共聚焦图像确认了在kdrl+ ECs中不存在scarb2a表达（图2a, a”,b和补充图2c-d”）。相反，scarb2a报告基因突出了脑室区（vz，图2a’-a”，b）中的细胞，这些细胞与放射状胶质细胞（RGCs）非常相似，RGCs是一群多能祖细胞，是发育中胚胎中神经元和胶质细胞的主要来源。RGCs具有独特的伸长形态（图2a”’）并表达特定标记物，如胶质纤维酸性蛋白（GFAP）24和SOX2，SOX2是一种对于维持其祖细胞状态并防止其过早神经元分化至关重要的转录因子。对TgBAC(scarb2a:KalTA4;UAS:EGFP;GFAP:dTomato)胚胎的共聚焦成像显示，在24 hpf时，一部分scarb2a+细胞也被GFAP转基因（图2c–d’）和Sox2抗体（图2e–f’）在野生型和突变型胚胎中标记。为了进一步确定表达scarb2a的细胞身份，我们对TgBAC(scarb2a:KalTA4;UAS:EGFP)胚胎在36和48 hpf时进行了Fabp7a免疫染色，Fabp7a之前已被证明可标记斑马鱼后脑中的RGCs。如补充图2e-f'所示，我们发现scarb2a（绿色）和Fabp7a（红色）在脑室区的一小部分RGCs中共表达（黄色）。因此，基于它们的形态、基因表达和时间分布，我们确定scarb2a+细胞为RGCs，并得出结论，在此发育阶段，它们不受突变的影响。
在神经发生完成后，剩余的未分化放射状胶质细胞（RGCs）通过不对称细胞分裂产生少突胶质细胞（OLs）和星形胶质细胞。scarb2a突变体中RGC池的显著耗竭引发了一个问题，即这对胶质细胞生成有何影响。在斑马鱼的后脑中，Olig2标记的少突胶质祖细胞（OPCs）大约在30小时受精后（hpf）从位于菱脑节r5和r6中线处的pMN簇中出现。为了研究Scarb2a耗竭是否影响OPC和/或少突胶质细胞谱系，我们在olig2:EGFP和mbp:EGFP转基因背景下生成了scarb2a突变体。在30 hpf的共聚焦图像显示，野生型和scarb2a−/−胚胎的pMN中没有差异（补充图3i，j）。到60 hpf时，新生成的OPCs开始迁移到整个中枢神经系统（CNS）以进行定植，野生型olig2+细胞在pMN中以及在后脑中径向分布（图3a，a’，c，d）。相比之下，scarb2a突变体后脑中pMN内外的olig2+ OPC数量显著减少（图3b–d），这表明该突变影响了一组OPC的分化。成熟的少突胶质细胞产生髓鞘并表达髓鞘结合蛋白（MBP），这是髓鞘鞘的主要成分。在斑马鱼中，髓鞘生成始于3天受精后（dpf），此时OPC开始成熟为髓鞘化的少突胶质细胞。重要的是，Tg(mbp:EGFP);scarb2a−/−胚胎在5 dpf时髓鞘化的少突胶质细胞数量显著减少（图3e–g），表明早期的少突胶质细胞生成缺陷在后期发育阶段并未恢复。有趣的是，对从Tg(olig1:memEYFP)斑马鱼报告基因中分离出的310个细胞进行的公开单细胞RNA测序（scRNA-Seq）数据分析显示，在少突胶质细胞谱系中存在scarb2a（补充图3k），这表明Scarb2a可能在少突胶质细胞生成的后期阶段发挥额外的作用。
星形胶质细胞也来源于RGCs。为了评估scarb2a突变体中星形胶质细胞的生成是否也受损，我们对表达膜结合豆蔻酰化GFP（myrGFP）和核标记H2AmCherry的Tg(slc1a3b:MYRGFP-2A-H2AmCherry)胚胎进行了成像，这些标记在星形胶质细胞标记slc1a3b/Glast的控制下表达。在60 hpf的共聚焦图像显示，整个后脑中，特别是在中线、中脑-后脑交界处（MHB）和菱唇（rl）存在slc1a3b+细胞（图3h）。横向光学切面表明，这些细胞的细胞核（红色）位于脑室区（vz）和菱唇中，从那里伸出长的GFP+突起腹侧进入神经管（图3h’，j）。此外，双转基因Tg(slc1a3b:MYRGFP-2A-H2AmCherry;scarb2a:KalTA4:UAS:EGFP)胚胎的图像描绘了scarb2a-EGFP+和slc1a3b-mCherry+在vz细胞核中的共定位，表明在60 hpf时，scarb2a也在此细胞群中表达（补充图3l，l’）。与野生型同胞相比，scarb2a−/−胚胎在所有位置，特别是vz中，slc1a3b+细胞核的数量显著减少（图3i，i’，j）。这些缺陷在星形胶质细胞变得有功能的6 dpf时仍然存在。最后，我们确认这些缺陷不是由出血事件引起的形态畸形所导致的。如补充图3m，n所示，在60 dpf时，无论是否存在出血，少突胶质细胞和星形胶质细胞的数量减少并未改变。
为了了解与观察到的表型相关的遗传程序，我们对从野生型和突变体头部中分离出的scarb2a+细胞进行了bulk RNAseq分析，时间为60 hpf。对转录因子（TF）表达的分析显示，scarb2a突变体中与OPC分化相关的因子显著减少（补充图4a），同时驱动神经元命运的TF增加（补充图4b）。这些结果通过检查Tg(isl1a:GFP)胚胎得到了进一步验证，该胚胎显示在60 hpf和6 dpf时，与野生型同胞相比，scarb2a突变体后脑中分化的运动神经元数量显著增加（补充图4c–h）。综上所述，我们的数据表明，Scarb2a耗竭导致RGCs过早的神经分化并耗尽祖细胞池，最终导致胶质细胞生成受损。
为了功能上验证这些结果，我们通过在GFAP+细胞中表达野生型scarb2a编码序列进行了挽救实验。将UAS:scarb2a-P2A-RFP或UAS:scarb2a;cmcl2:EGFP构建体注射到Tg(GFAP:Gal4FF);scarb2a−/−胚胎中，完全挽救了60 hpf时OPC的数量和分布（图3n–q；补充图4i–k）以及星形胶质细胞（图3r–u；补充图4l–n）。在Tg(scarb2a:KalTA4);scarb2a−/−胚胎中表达野生型scarb2a也得到了类似的结果（补充图5a–j）。有趣的是，约40%的olig2+细胞共表达了注射的野生型scarb2a构建体（补充图5d，d’，f，n，n’，o），这大致对应于scarb2a突变体中丢失的OPC数量（图3c，d）。
在scarb2a突变体中观察到的显著神经发生表型与Notch缺乏导致的表型相似，这提出了一个可能性，即scarb2a耗竭可能阻碍了Notch信号传导，从而导致神经发生过度和胶质细胞分化受损。为了验证这一假设，我们使用Tg(EPV.Tp1-Mmu.Hbb:EGFP)（也称为12NRE:EGFP45）Notch报告基因在野生型和scarb2a突变体背景下，对不同阶段的神经发生过程中的Notch信号进行了时间延迟成像（补充电影3）。对横向光学切面的分析显示，在次级神经发生的初始阶段（28 hpf），野生型和突变体胚胎的菱唇中Notch活性水平相当（图4a–b’；补充图6a，b）。然而，在32 hpf时，虽然野生型胚胎的脑室区（vz）祖细胞显示出明显的Notch活性（图4c，c’；补充图6c），但在突变体同胞细胞中几乎检测不到EGFP信号（图4d，d’；补充图6d）。到40 hpf时，scarb2a突变体的菱唇和中线区域仅观察到残留的Notch衍生的EGFP信号（图4e–f’；补充图6e，f）。这些结果通过qRT-PCR分析进一步验证，该分析在从野生型和scarb2a−/−胚胎头部分离的Tg(scarb2a:KalTA4;UAS:mKate2)细胞中进行。Notch下游靶标her4.2和her6的表达显著降低（图4g），而notch1a和notch3的水平没有差异（图4h），表明Scarb2a耗竭损害了Notch信号传导，而不影响受体的转录。最后，将UAS:scarb2a-P2A-RFP注射到Tg(GFAP:Gal4FF;12NRE:EGFP);scarb2a−/−胚胎中显著挽救了RGCs中的Notch激活，其中约80%表达外源性Scarb2的细胞显示出Notch活性（补充图6g–l）。
Notch1a信号在神经发生的早期（18–24 hpf）活跃，而Notch3是在scarb2a表型变得明显的阶段（30–55 hpf）起主导作用的异构体。相应地，notch3fh332/fh332突变体显示出少突胶质细胞生成缺陷（补充图6m–o）以及过早的神经元分化，这与scarb2a−/−表型高度相似。类似地，Tg(slc1a3b:MYRGFP-2A-H2AmCherry)星形胶质细胞群在notch3fh332/fh332胚胎中也显著减少（补充图6p–r），这进一步加强了Scarb2缺失、Notch3信号传导缺陷和胶质细胞生成受损之间的联系。
在小鼠和人类中，Scarb2位于晚期内体和溶酶体的膜上，并已被证明具有多种功能。因此，我们推测Scarb2a的改变可能会破坏Notch3在内溶酶体隔室内的转运和/或加工。先前在果蝇、斑马鱼和人类细胞中的研究表明，内溶酶体活性与Notch信号传导之间存在联系。特别是，内溶酶体隔室的酸度，通过V-ATPase质子泵活性，可以显著影响接收细胞中γ-分泌酶依赖性NICD切割的效率，从而改变正常的Notch信号传导。
为了初步验证我们的假设，我们首先将32 hpf的Tg(12NRE:EGFP, scarb2a:KalTA4;UAS:mKate2)野生型胚胎暴露于Bafylomycin A1 (BafA1)，这是一种已知的V-ATPase抑制剂。如图4i–j’所示，该处理导致Notch信号减少，并且scarb2a+细胞侵入脑室空间的数量增加，这与在scarb2a突变体中观察到的表型非常相似。
接下来，我们询问scarb2a突变体中内溶酶体隔室的酸度是否确实受到影响。为了回答这个问题，我们利用了Tg(hsp70l:lamp1-RFP)鱼和Tg(h2afx:EGFP-rab7)胚胎。前者表达Lysosomal Associated Membrane Protein 1 (Lamp1)的RFP标记形式，后者在热休克启动子控制下普遍表达晚期内体标志物Rab7的EGFP融合形式。我们将这些转基因报告基因与scarb2a突变体胚胎结合，并使用远红耦合的Lysotracker进行染色，该染色剂标记酸性细胞器。高倍率图像显示，与野生型同胞相比，scarb2a−/−胚胎中Lamp1/Lysotracker（图4k–l”, o）和Rab7/Lysotracker（图4q–r”, u）双阳性点状物的数量减少，表明这些细胞内隔室的酸化受损。类似但更显著的结果在将Tg(hsp70l:lamp1-RFP)和Tg(h2afx:EGFP-rab7)野生型胚胎暴露于BafA1时获得，在这种情况下，未检测到点状Lysotracker染色（图4m–m”, o, s–s”, u），进一步支持了scarb2a突变体显示Rab7和Lamp1细胞器酸化受损的观点。有趣的是，我们还注意到突变体中Rab7和Lamp1囊泡显著增大（图4p, v），这可能是由于未降解物质的积累，如在几种溶酶体贮积病(LSDs)的上下文中所示，或由于融合缺陷。
两方面的证据证实了Notch3的S3切割受损和NICD的生成是scarb2a突变体表型的主要驱动因素之一。首先，通过LY-411575抑制γ-分泌酶导致OPC（补充图7a–c’, d）和星形胶质细胞（补充图7e–g’, h）数量显著减少，以及Lamp1（图4n, n’, p）和Rab7（图4t, t’, v）细胞器增大，完全模拟了scarb2a−/−表型。其次，我们设计了基于Notch3细胞内（N3ICD）或细胞外（N3ECD）域过表达的拯救实验。为此，我们使用了稳定的转基因报告基因Tg(hsp70I:N3ICD-EGFP)和Tg(hsp70I:N3ECD-EGFP)，它们在热休克启动子hsp70I的控制下表达N3ICD和N3ECD的组成性活性形式，并在约28–30 hpf时诱导其表达，以模拟Notch3的内源性表达。如图5a–c’, e所示，在olig2:GFP;scarb2a−/−胚胎中过表达N3ECD并不能防止少突胶质细胞生成缺陷，而与N3ICD诱导相比，N3ICD的诱导显著恢复了olig2+迁移细胞的数量（图5d, e）。同样，N3ICD的过表达（而非N3ECD）导致scarb2a−/−胚胎后脑中slc1a3b:MYRGFP-2A-H2AmCherry+细胞数量显著增加（图5f–j）。最后，我们可以确认这些表型主要归因于Notch3信号传导缺陷，因为使用Tg(hsp70l:myc-notch1a-intra;cryaa:Cerulean)过表达N1aICD片段并不足以恢复scarb2a突变体中的星形胶质细胞（补充图7i–l）或OPC（补充图7m–p）群体。
图5 在 scarb2a 突变体中，过表达 Notch3 的细胞内域（N3ICD）而非细胞外域（N3ECD）可以挽救神经胶质细胞生成
在确定了Scarb2缺失所影响的特定细胞群后，我们旨在研究RGC耗竭及其随后的神经胶质细胞减少是否是导致观察到的血管表型的原因，并探讨其潜在的分子机制。神经元、神经胶质和血管隔室之间的积极相互作用对于中枢神经系统和血脑屏障的正确发育和功能至关重要。与哺乳动物类似，斑马鱼的中枢神经系统血管生成和血脑屏障形成受到VEGF和Wnt信号通路的紧密协调。在后脑发育的特定阶段化学抑制VEGF信号传导会导致内皮细胞（EC）迁移和存活异常，从而导致中央动脉（CtA）畸形。在同一血管生成阶段，Wnt信号在萌发的CtA内皮细胞中高度活跃，其抑制导致glut1表达减少和CtA吻合缺陷，从而在后期发育阶段导致脑内出血。
首先，我们验证了通过在Tg(GFAP:Gal4FF);scarb2a−/−（图3n-u）或Tg(scarb2a:KalTA4);scarb2a−/−胚胎（补充图5a-j）中表达UAS:scarb2a-P2A-RFP或UAS:scarb2a;cmcl2:EGFP来减少神经发生并恢复正常的神经胶质细胞发生，可以显著恢复CtA形态，减少异位连接的数量（图6a-d；补充图8a-d），并将glut1b表达恢复到野生型水平（图6e-g’；补充图8e-g’），从而证实了RGC中scarb2a的耗竭阻止了神经胶质细胞的正常分化和成熟，进而导致后脑血管和血脑屏障建立的后续缺陷。
随后，我们评估了VEGF和Wnt信号通路中可能发生的改变。之前关于斑马鱼的研究强调了血管内皮生长因子aa（Vegfaa）在后脑血管网络发育中的关键作用。对TgBAC(vegfaa:EGFP)pd260报告基因的分析显示，在CtA萌发和迁移的初始阶段（约32 dpf），野生型和突变型胚胎中scarb2a+ RGCs中的vegfaa表达水平相似（补充图8h-k’）。这些结果与在scarb2a−/−中观察到的BA正常发育和CtA从PHBCs的初始萌发相一致（图1d）。相比之下，在60 hpf时，scarb2a−/−胚胎的后脑中vegfaa的表达水平更高（图6h-i’；补充图8l-o），这可能是由于RGCs采取了神经元命运，如之前所述，这会导致异常的血管生成。为了功能上证实这些结果，我们在约32 hpf时（血管表型初现之前）用VEGFR抑制剂SU5416处理野生型和突变型胚胎。如图6j-m所示，我们观察到CtA吻合的数量显著减少，这证实了scarb2a−/−中观察到的部分异常血管生成表型至少部分是由vegfaa过度产生介导的，而vegfaa的过度产生则是由于神经元分化过度。
我们进一步研究了Wnt信号在scarb2a−/−胚胎后脑中是否也发生了变化。先前的研究表明，Wnt7a在哺乳动物和斑马鱼的血脑屏障形成中起着重要作用。因此，我们在2 dpf时评估了GFAP+和scarb2a标记细胞中Wnt7Aa的表达，并证实在突变型大脑中表达量一致下降（补充图9a，b）。此外，通过Tg(7xTCF-Xla.Sia:GFP)报告基因所示的Wnt活化在突变型胚胎的CtA-ECs中降低（图7a-b’；补充图9c-d’），这证实了Wnt信号在scarb2a突变体的后脑中确实没有得到正确激活。
为了从功能上证实这些结果，我们对scarb2a突变体进行了Wnt通路激活剂LiCl的处理。这种处理在32 dpf时进行，显著挽救了CtA的吻合（补充图9e）、Glut1的表达（图7c-e’）和血脑屏障（BBB）的渗漏性（图7f-h）。这些数据表明，根据先前的报告，来自RGCs及其胶质细胞衍生物的Wnt负责诱导屏障生成。最后，在32 hpf时联合使用SU5416和LiCl处理导致CtA吻合和血管形态完全恢复正常（图7i-k；补充图9f）。综上所述，这些数据表明，scarb2a突变体中神经生成的增加和RGCs和/或其他胶质细胞群的耗竭直接影响VEGF和Wnt7Aa的产生，从而影响中枢神经系统（CNS）血管的正常建立及其屏障功能。
总体而言，我们的结果表明，由Scarb2耗竭引起的溶酶体功能障碍会阻碍RGCs中的Notch3信号传导，从而影响未分化RGC祖细胞池的维持并调节神经生成和胶质生成的平衡。我们进一步证明，这种平衡的改变会导致严重的血管缺陷、出血和BBB渗漏（图7l）。从更广泛的意义上说，我们的数据说明了在NVU（神经血管单元）的建立和功能中不同细胞类型之间精细的相互作用，并揭示了脑实质中非血管细胞（即RGCs和胶质细胞）中的溶酶体功能障碍与脑血管健康之间的关系。
斑马鱼 scarb2a 突变体的研究揭示了放射状胶质祖细胞（RGCs）在神经元与胶质细胞分化过程中所受机制的影响，当这些机制被破坏时，会导致与脑血管疾病和脱髓鞘神经病相关的表型。通过生成一个 scarb2a 转基因报告系统，我们发现 scarb2a 最初在RGCs中表达，随后在胶质细胞中表达，包括少突胶质前体细胞（OPCs）和少突胶质细胞（OLs）的一部分，以及星形胶质细胞。Scarb2 的缺失导致RGCs内溶酶体腔酸化受损，进而影响Notch3的切割和N3ICD的释放。因此，scarb2a 突变体表现出神经元分化过度，而胶质细胞分化不足。这种失衡影响了VEGF和Wnt信号通路的正常激活，导致中枢神经系统（CNS）血管生成的异常，包括CtAs异常连接、微出血和BBB受损。
值得注意的是，通过在RGCs中表达野生型 scarb2a，完全恢复了与 Scarb2a 缺乏相关的胶质和血管异常，强调了观察到的表型的特异性，并表明RGCs的正常分化、胶质生成和CNS血管生成之间存在重要联系。
在分子水平上，我们显示了 scarb2a 突变体后脑中Notch信号通路的显著下调，始于30 hpf，并证明这种下调特定归因于Notch3活性受损。通过一系列遗传操作，我们展示了仅恢复Notch3的胞内域（而非胞外域）能够使OPCs和星形胶质细胞群恢复。这些结果证实了Notch3在调控RGC命运决定中的关键作用，并强调了Scarb2a及内溶酶体功能在这一过程中的重要性。
N3ECD和N3ICD过表达实验表明，只有胞内片段能够挽救 scarb2a 突变体表型，这提示 Scarb2a 的缺乏可能影响由γ-分泌酶复合体进行的切割。Notch信号通路的激活需要对Notch受体进行两次连续的蛋白水解切割，首先产生Notch胞外域（NECD），随后产生Notch胞内域（NICD）片段。NECD在信号传递细胞中内化，而第二次（S2）切割产生的跨膜和胞内域（也称为Notch胞外截断体-NEXT）则通过γ-分泌酶在S3位点进一步切割，释放NICD，进而转移到细胞核中，激活下游目标基因的转录。果蝇和哺乳动物细胞的实验表明，内溶酶体腔的酸性显著影响S3切割的效率。进一步的研究显示，抑制V-ATPase（参与内涵体和溶酶体酸化的蛋白质）会阻碍Notch受体的处理和激活，支持了γ-分泌酶的S3切割需要酸化的细胞内环境这一观点。由于 SCARB2/LIMP2 主要位于晚期内涵体和溶酶体膜中，我们推测 scarb2a 突变体中观察到的N3ICD生成受损可能与这些细胞器的变化有关。在这一背景下，我们展示了 Scarb2a 缺失导致的Lamp1和Rab7腔酸性降低和体积增大，这与一些溶酶体贮积病（LSDs）中的特征类似。我们观察到的 scarb2a 突变体表型与用V-ATPase抑制剂BafA1或γ-分泌酶抑制剂LY-411575处理的野生型胚胎的表型高度相似，这进一步支持了Scarb2依赖的内溶酶体机制故障是导致 scarb2a−/− 突变体Notch3信号缺陷的基础。由此可见，Scarb2a 缺失可能引发内溶酶体机制和γ-分泌酶活性的变化，最终导致N3ICD切割的异常。
先前的研究表明，RGCs及其衍生的神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞控制胚胎及出生后CNS血管生成的不同方面。例如，在小鼠胚胎皮质的发育过程中，RGCs分泌的Wnt配体调控了Glut-1和Gpr124的表达，而它们的缺失会导致CNS血管生成受损和BBB完整性受损。此外，最近的研究表明RGCs分泌的TGF-β1可以促进体外的内皮细胞迁移和管状结构形成。最后，已知由神经前体细胞及其后代分泌的VEGFa以剂量依赖的方式调控CNS血管生成。我们的研究结果显示，scarb2a 突变体胚胎中CtAs的发芽和连接缺陷，伴随着BBB的受损和Glut1表达的显著下调，与这些先前的报道一致，强调了在发育中的大脑中细胞相互作用的协调性和严格调控的重要性，这对于CNS血管系统的正常功能至关重要。
大脑血管异常可能导致多种，甚至危及生命的脑血管疾病，包括缺血性和出血性中风、血管畸形、血管性认知障碍和痴呆。在这些疾病中，脑小血管病（CSVDs）包括一系列自发性或遗传性的小动脉、毛细血管和小静脉的病理变化，主要发生在白质区域。这些改变导致脱髓鞘、BBB功能障碍、胶质细胞激活和轴突丧失。值得注意的是，最常见的遗传性CSVD——CADASIL，由NOTCH3基因突变引起，这些突变主要影响血管平滑肌细胞和周细胞。一个尚未解决的关键问题是，血管表型如何与CADASIL及其他小血管病中的白质变化相关。目前的主流观点是，最初的血管缺陷导致了白质损伤，但也有可能是胶质细胞中的Notch3处理和/或信号受损在细胞自发性上导致了观察到的变化。这一假设还可以解释为何尽管CADASIL是一种单基因疾病，患者的表型表现却高度多样，并且基因型与表型的关联不明确。我们的研究结果为脑血管疾病提供了一个全新的视角，提示除了常规研究的血管细胞外，血管微环境中的其他细胞群体的缺陷也可能在疾病中发挥重要作用。
方法与材料
斑马鱼按照标准方法进行饲养，并遵循魏茨曼研究所动物护理与使用委员会的指导方针。对于所有成像、原位杂交和免疫荧光实验，胚胎从8小时受精后（hpf）开始用0.003%苯基硫脲（PTU，Sigma-Aldrich）处理，以抑制色素沉着。本研究中使用的斑马鱼品系包括：Tg(fli1:EGFP)yl；Tg(gata1a:DsRed)sd2；Tg(kdrl:EGFP)s843；Tg(kdrl:mCherry)y206；Tg1(kdrl:NLS-mCherry)y173；Tg(7xTCF-Xla.Sia:GFP)ia4；TgBAC(vegfaa:EGFP)pd260；Tg(gfap:Tomato)nns17；Tg(gfap:GAL4FF)wa32；Tg(olig2:EGFP)vu12；Tg(olig2:dsRed)vu19；Tg(isl1a:EGFP)rw0；Tg(slc1a3b:MYRGFP-2A-H2AmCherry)；Tg(EPV.Tp1-Mmu.Hbb:EGFP)ia12；Tg(kdrl:TagBFP)mu293；Tg(glut1b:mCherry)sj1；Tg(mbp:EGFP)ck1；Tg(hsp70I:N3ECD-EGFP)co15；Tg(hsp70I:N3ICD-EGFP)co17；Tg(hsp70l:MYC-notch1a,cryaa:Cerulean)fb12；notch3fh332/fh332；Tg(hsp70l:lamp1b-RFP)pd1064；Tg(h2ax:EGFP-rab7a)mw7。
使用CRISPR/CAS技术生成了scarb2a突变体。CRISPR引导序列使用CHOPCHOP设计，并通过MIT CRISPR Design网站评估潜在的脱靶序列。将引导序列GGCTGAGAACAGCAGAGTAT克隆到pT7-gRNA质粒（Addgene质粒46759）的BsmBI位点。使用mMACHINE T7 ULTRA试剂盒（Ambion, AM1345）从pCS2-nCas9n质粒中生成Cas9 mRNA。将Cas9 mRNA（250 ng/μL）和引导RNA（100 ng/μL）共同注射到1细胞期胚胎中。对于基因分型，提取基因组DNA并使用引物5′-TGTCTGTGTTTGGTTACAGGAG-3′和5′-TTCCCCGCCAAGAACTCA-3′（138 bp）进行扩增，然后在2%琼脂糖凝胶上进行分析。
使用包含完整scarb2a序列的DKEY-177l10 BAC（BioScience, HUKGB735J035Q）生成了TgBAC(scar2ba:KalTA4)品系。在移除scarb2a CDS后，将KalTA4片段克隆到ATG下游。将所得BAC(scar2ba:KalTA4)构建体注射到AB斑马鱼的1细胞期，并通过转座子介导的BAC转基因整合，生成稳定的报告基因品系，然后将其与scarb2a突变体鱼进行杂交。
使用以下引物扩增scarb2a的编码序列：F 5‘- ATGACTAGAAGATCTTGTACTATTTACGCC-3‘；R 5‘- TCAACACTTTTGTGCCTCCACT-3‘。将所得片段克隆到pDONR221质粒中，并使用Gateway系统（如前所述）与p5E-UAS、p3E-P2A-mKate2和pDestTol2pA2组合。
将Tg(UAS-scarb2a-P2A-RFP)和Tg(UAS-scarb2a;cmcl2:EGFP)构建体分别注射到Tg(GFAP:Gal4FF);scarb2a−/−和Tg(scarb2a:KalTA4);scarb2a−/−转基因品系的1细胞期胚胎中（每胚胎800 pg），进行拯救实验。
血管造影是通过向麻醉后的幼鱼血管内注射四甲基罗丹明葡聚糖（Tetramethylrhodamine Dextran，分子量为2,000,000 Da，来自Thermo Fisher Scientific，产品编号D7139）来实现的，具体方法如先前所述。注射后5分钟内开始进行成像。
原位杂交按照先前描述的方法进行。使用以下引物生成核糖核酸探针：
反向引物：5′- ATGAAAACGTATGGGCCGGT-3′
反向引物：5′-CACCAATTCATCTGACTGATGCCG-3′
免疫染色：将60小时受精后（hpf）的胚胎在4%多聚甲醛（PFA）中固定过夜，然后在冰上用丙酮渗透30分钟。随后，在室温（RT）下用含有2%牛血清白蛋白（BSA）、10%山羊血清和0.1%吐温20（Tween20）的磷酸盐缓冲液（PBS）中封闭3小时。之后，在4°C下与一抗（兔抗Sox2抗体，1:100稀释，来自Abcam，编号ab97959；兔抗fabp7a抗体，1:100稀释，来自Millipore，编号ABN14；或小鼠抗HuC抗体，1:400稀释，来自Thermo Fisher Scientific，编号A-21271）孵育过夜。用PBST充分洗涤后，再在4°C下与Alexa Fluor 633偶联的二抗（山羊抗兔二抗，1:500稀释，来自Invitrogen，编号A21070；山羊抗小鼠二抗，1:500稀释，来自Invitrogen，编号A21053）孵育过夜。
溶酶体追踪剂染色（Lysotracker™ Deep Red，Thermo Fisher L12492）的方法如先前所述。简而言之，将25-30个胚胎转移到含有溶酶体追踪剂Deep Red的6孔板中，该追踪剂在PTU水中溶解至最终浓度为10 μM，然后在28.5°C的暗环境中孵育45分钟。之后，用约1 ml的新鲜鱼水冲洗胚胎3次，并立即使用633 nm激光进行远红染色成像。
热休克在37°C下进行45分钟。对于Tg(hsp70I:N3ECD-EGFP)co15、Tg(hsp70I:N3ICD-EGFP)co17和Tg(hsp70l:MYC-notch1a,cryaa:Cerulean)fb12实验，从28 hpf开始，每隔6-7小时对胚胎进行一次热休克，直至60 hpf。
为了抑制γ-分泌酶，我们在28小时受精后（hpf）手动脱壳的胚胎中，将其置于含有0.4%二甲基亚砜（DMSO）的胚胎水中，并加入LY-411575（Sigma, SML0506）至最终浓度为50 μM，然后在28.5°C的暗环境中孵育。为了特异性阻断V-ATPase质子泵活性，我们将28 hpf的斑马鱼胚胎与Bafylomicin A1抑制剂（Sigma, B1793）一起孵育，该抑制剂直接添加到鱼的培养基中至最终浓度为100 nM。使用0.4% DMSO作为对照。另外，在30 hpf时，向脱壳的胚胎中加入50 mM的LiCl（Merck）和5 μM的SU5416（EMD Millipore），并在含有0.4% DMSO的胚胎水中于28.5°C的暗环境中孵育至60 hpf。对于所有治疗，胚胎均保持在28.5°C的孵育介质中直至60 hpf。
对于每个实验条件，从安乐死的48 hpf scarb2a突变体和野生型（wt）同胞中解剖出50个头部的混合样本（3个生物学重复），并将其解离成单细胞悬液。经过Liberase Blendzyme 3（Roche）、胰蛋白酶B（BI）和DNAseI（Roche）的短暂酶处理后，将细胞悬液通过70 µm过滤器过滤，并用SYTOXTM blue（ThermoFisher）染色以区分活细胞和死细胞。将5000个活的scarb2a+单细胞分选到含有RNA酶抑制剂RNasinTM（Promega）的40 µl裂解/结合缓冲液（ThermoFisher）中。流式细胞术分析和分选在BD FACS Aria III上进行，使用70 µm喷嘴。
为了对wnt7aa进行qRT-PCR分析，在48 hpf时解剖出50个头部的样本，并从Tg(gfap:Tomato)nns17和TgBAC(scar2ba:KalTA4; UAS-mKate2)胚胎的野生型和突变型背景下分选出50000个细胞。
在文库制备之前，使用Dynabeads™ mRNA DIRECT™ Purification Kit（ThermoFisher）捕获RNA。采用MARS-seq协议的批量适应版本来生成scarb2+突变体和野生型细胞的表达谱RNA文库。RNA进一步被片段化，并通过在连接、逆转录（RT）和聚合酶链式反应（PCR）过程中用Illumina序列标记样本来转化为测序就绪文库。使用Qubit、TapeStation和qPCR对斑马鱼肌动蛋白进行测定，以确定最终文库浓度，如先前所述。测序在Nextseq500/550 High Output Kit v2.5 75 cycles（Illumina；双端测序）上进行，每个样本测序600万次读取。使用用户友好的转录组分析管道进行初步的质量控制报告。使用来自Uniprot.org的基因本体论，在测序数据集中识别出上调和下调的转录因子。
从48小时受精后(hpf)的野生型和突变型胚胎中解剖出10-20个头部的样本池。样本在TRIzol（Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, 15596026）中均质化，并按照标准程序进行RNA提取。每个反应使用1μg RNA，通过High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, 4368814）进行逆转录。
wnt7aa 5′-CACGGGAGATCAAGCAGAAC-3′;5′-TGGTGCAGGATCCAGATACG-3′。
5′-TGACAGGATGCAGAAGGAGA-3′和5′-GCCTCCGATCCAGACAGAGT-3′。
共聚焦成像使用Zeiss LSM780直立式共聚焦显微镜或配备Airyscan模块32通道GaAsP-PMT区域探测器的LSM880直立式共聚焦显微镜进行，使用水浸×20/1.0 NA或×10/0.5 NA物镜。胚胎安装在1.5%（w/v）低熔点琼脂糖上。
共聚焦图像使用ImageJ（NIH）的Fiji版本或Imaris v.9.3（Bitplane）进行离线处理。本研究中显示的图像是单视图，即收集的z系列堆栈的2D重建。使用Imaris Colocalization Module创建共定位通道。共定位阈值手动设置。使用ImageJ的ComDet v.0.5.3插件在GitHub[https://github.com/UU-cellbiology/ComDet]和Zenodo[https://zenodo.org/record/4281064]上进行了Lysotracker、Lamp1和Rab7阳性斑点的检测、共定位和定量分析。
补充图1a：从Uniprot.org获得了斑马鱼（Q8JGR8，531个氨基酸）、小鼠（O35114，478个氨基酸）和人类（Q14108，478个氨基酸）的氨基酸序列。使用Uniprot.org计算了序列的同源性百分比。
补充图2a：使用了先前发表的小鼠脑和脊髓发育过程中的单细胞RNA测序数据。使用R（版本4.3.1）及其ggplot2包制作了条形图。
补充图3k：从Tg(olig1:memEYFP)转基因斑马鱼在受精后5天（dpf）时分离的310个细胞中获取了单细胞转录组数据，这些数据来源于文献34。这些图是通过一个可搜索的数据库获得的，该数据库在 https://castelobranco.shinyapps.io/zebrafish_OPCs/ 上公开提供。
除非另有说明，否则使用未配对双尾Student's t检验（假设至少三次独立实验中的方差不等）计算两个样本之间的统计学显著性。当比较两个以上组以测试均值差异时，使用普通单因素ANOVA与Tukey多重比较检验。在所有情况下，均假定数据呈正态分布，且各组间的方差具有可比性。根据之前评估实验变异性的经验，以经验方式选择样本量。除非另有说明，否则每项实验至少独立重复3次。实验过程中和结果评估时，研究人员对样本分配保持盲态。除非另有说明，否则数值数据以平均值±标准误差（s.e.m.）表示。使用Prism 8软件（GraphPad Software）进行数值数据的统计计算和图形绘制。
