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题目：
TGF-β 和 RAS 共同揭示了被激活的增强子，推动了癌症转移的发生
亮点
TGF-β 和 RAS 驱动上皮间质转化（EMT）和纤维化基因的表达，联合促进肿瘤转移。
表观遗传决定因素将全球 TGF-β 反应中的不同程序分开。
RAS/MAPK 途径调控的 RREB1 启动增强子，由 SMAD 招募的 INO80 进行激活。
靶向 RREB1 可选择性抑制肺腺癌（LUAD）的转移。
摘要
上皮间质转化（EMT）和细胞外基质（ECM）重塑是癌细胞侵袭和转移过程中两个独立但重要的过程。转化生长因子 β（TGF-β）和 RAS 通过 SMAD 和 RAS 反应元件结合蛋白 1（RREB1）的信号通路，共同触发癌细胞中 EMT 和纤维化因子的表达，形成一个共同的转录反应的两个分支。在此，我们证明了这两个分支联合形成了肺腺癌转移的一个程序，并确定了将组成基因的表达与 TGF-β 和 RAS 信号连接的染色质决定因素。RREB1 定位于含有 H4K16acK20ac 标记的组蛋白 H2A.Z 装载的核小体增强子上，这些增强子包括纤维化基因白介素 11（IL11）、血小板衍生生长因子-B（PDGFB）、透明质酸合酶 2（HAS2），以及 EMT 转录因子 SNAI1，为 SMAD4-INO80 核小体重塑复合物响应 TGF-β 的激活做好了准备。这些调控特性将纤维化 EMT 程序与 RAS 非依赖性的 TGF-β 基因反应分开，阐明了一个促进肿瘤转移的双功能程序的运行机制及其脆弱性。1. 引言
上皮间质转化（EMT）是一种表型可塑性过程，在发育和损伤修复过程中起着关键作用，并在癌细胞侵袭和转移期间重新出现。EMT 支持转移，具体依赖于癌细胞扩散后入侵宿主组织的能力。在 EMT 过程中，表皮细胞失去顶底极性，获得运动能力，并重塑细胞粘附接触，以便入侵周围的间质。EMT 是由专门的转录因子（EMT-TFs）驱动的，这些因子抑制上皮基因的表达并诱导间质特征的表达。EMT 通常伴随着其他关键过程。例如，在原肠胚形成过程中，经历 EMT 的外胚层前体细胞还会分化为中胚层和内胚层。在癌症转移过程中，经历 EMT 的恶性前体细胞通常与活化的成纤维细胞和细胞外基质（ECM）重塑相关。理解这些过程如何相互关联，将有助于阐明 EMT 在正常发育和癌症等疾病中的作用。多效性细胞因子转化生长因子 β（TGF-β）在发育、伤口愈合、纤维化和癌症中强力诱导 EMT。TGF-β 需要来自 RAS 信号通路的协同输入才能触发 EMT，这种协同作用依赖于 RAS/丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号的专门效应器 RAS 反应元件结合蛋白 1（RREB1）。MAPK 激活的 RREB1 与 TGF-β 激活的 SMAD 转录因子相互作用，在胚胎和成人的上皮前体细胞以及癌细胞中诱导 EMT-TFs 的表达。此外，SMAD-RREB1 协同作用将 EMT 的诱导与外胚层前体细胞中的中胚层/内胚层身份因子的表达，以及癌细胞中的纤维化因子的表达相结合，从而协调 EMT 与其他基因的上下文依赖性表达。为何 EMT-TFs 和纤维化基因组成的 TGF-β 转录反应的特定子集需要 RREB1 的输入仍然未知。同样未知的是，TGF-β/RAS 反应的 EMT 和纤维化分支是否会合并为癌细胞中转移性生长所需的功能性程序。在本文中，我们在全球癌症死亡率居首的肺腺癌（LUAD）背景下探讨了这些问题。我们证明了 SMAD 和 RREB1 转录程序中的 EMT 和纤维化分支都对于肺部转移的生长是必要的。我们阐明了 RREB1 介导的 EMT-TFs 和相关纤维化基因激活所需的特定染色质特征。基于这些见解，我们提供了概念验证，证明 RREB1 竞争性抑制剂可以用于减弱 TGF-β 纤维化 EMT 程序并抑制 LUAD 转移。2. 结果
2.1 在人类肺腺癌（LUAD）转移中的纤维化和EMT标志物KRAS突变激活定义了人类肺腺癌（LUAD）的主要遗传亚型。RAS突变型LUAD细胞系通过RREB1依赖性激活，响应TGF-β的刺激，表达一套典型的基因，这些基因编码上皮间质转化转录因子（EMT-TFs），包括SNAIL（SNAI1）、SLUG（SNAI2）、锌指E-box结合蛋白1（ZEB1）和ZEB2；纤维化细胞因子白细胞介素-11（IL11）和血小板衍生生长因子-B（PDGFB）；ECM修饰酶透明质酸合酶2（HAS2）；以及ECM相关蛋白结缔组织生长因子（CTGF）和WNT1诱导信号通路蛋白1（WISP1），以及其他纤维化因子。为研究这一基因组在临床样本中的表达情况，我们分析了先前生成的来自患者来源的LUAD转移癌细胞的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集。我们基于EMT标志基因的表达对单个细胞进行排序，并查询了纤维化和EMT转录因子基因的表达（图1A）。除CTGF和WISP1外，所有纤维化基因均与表达EMT标志的癌细胞中的EMT转录因子一致。表达纤维化EMT程序的细胞还显示了TGF-β三种形式TGFB1、TGFB2和TGFB3的高峰表达（图1A）。
我们从患者来源的异种移植瘤（图S1A）中生成了肿瘤球培养物（简称“肿瘤类器官”），并将这些培养物与TGF-β1（以下简称TGF-β）或TGF-β受体抑制剂SB505124（SB）共同孵育，以消除内源性TGF-β信号（图S1B和S1C）。在三种独立的肿瘤类器官中，与TGF-β孵育会快速（2小时内）诱导代表性的EMT转录因子和纤维化因子的表达（图1B）。因此，TGF-β依赖的纤维化EMT程序的表达是人类LUAD转移的一个临床相关特征。2.2 EMT 和纤维化因子在 LUAD 转移中的作用
RREB1 是 393T3 细胞（来自 Kras^G12D; p53^-/^- (KP) 基因工程小鼠模型的 LUAD 细胞系）转移生长所必需的。我们在 393T3 细胞中敲除了纤维化因子和 EMT 转录因子（图 S1D-S1F）。野生型（WT）393T3 细胞与 TGF-β 共孵育后，显示出典型的 EMT 特征，包括上皮标志物 E-cadherin 的下调、细胞集落的分散以及 Snai1 的诱导（图 S1G 和 S1H）。敲除 TGF-β 受体 Tgfbr2 或同时敲除 Snai1 和 Zeb1 可以阻止 TGF-β 诱导 EMT，而敲除 Il11、Pdgfb、Has2、Wisp1 或 Ctgf 则不能（图 S1G）。敲除 Snai1/Zeb1、Il11、Pdgfb、Has2、Wisp1 或 Ctgf 不会阻止 TGF-β 诱导其他基因的表达，Has2 的敲除对 Wisp1 有一定影响（图 S1H）。值得注意的是，缺乏 Rreb1、Il11、Pdgfb、Has2、Tgfbr2 或同时缺乏 Snai1 和 Zeb1 的 393T3 细胞在同系免疫健全小鼠中静脉注射后，肺部转移的形成受到了抑制（图 1C 和 S1I）。Masson 三色染色法显示，WT 393T3 细胞形成的转移灶中有肿瘤内纤维化，而敲除细胞形成的大小匹配的小病灶中没有发现纤维化（图 1D 和 S1J）。敲除 Ctgf 和 Wisp1 对肿瘤内纤维化或转移的影响有限（图 1C、1D 和 S1J）。为了评估这些基因在原发性肿瘤形成中的功能作用，我们通过气管内递送编码 Cre 重组酶和针对 Rreb1、Il11、Pdgfb 或 Has2 的 sgRNA 的载体，在 Kras^LSL-G12D; Trp53^flox/flox; Rosa26^LSL-Cas9-EGFP/+ KP 小鼠中诱导肺部肿瘤的形成。这些复合 KP LUAD 小鼠与对照 KP 小鼠在原发性肿瘤的发生率或负担上没有显著差异，除了 KP-Rreb1 敲除的肿瘤，其发展速度较慢（图 S2D 和 S2E）。Rreb1、Il11、Pdgfb 和 Has2 敲除肿瘤的组织学特征表现出更多的腺泡状和乳头状，而对照肿瘤则不同（图 1F 和 S2F）。在 10 只携带肿瘤的 KP 小鼠中，有 4 只出现了自发转移，转移至纵隔淋巴结和/或肾上腺，而在 34 只缺乏 Rreb1、Il11、Pdgfb 或 Has2 的肿瘤小鼠中未检测到转移（p = 0.0015，Fisher 精确检验）（图 1G 和 S2H）。接下来，我们从这组复合 KP 肺肿瘤中生成了肿瘤类器官。通过使用 TGF-β/SMAD 依赖性 mCherry 报告基因，我们验证了需要 SB 来阻断内源性 TGF-β 信号，并为这些类器官设定基线。在与 TGF-β 共孵育时，对照类器官以及缺乏 Il11、Pdgfb 或 Has2 的类器官显示了 E-cadherin 的下调、细胞分散和 Snai1 的表达。缺乏 Rreb1 或同时缺乏 Snai1 和 Zeb1 的类器官未能在 TGF-β 诱导下经历 EMT。敲除 Snai1/Zeb1、Il11、Pdgfb 或 Has2 不会阻止 TGF-β 诱导其他基因的表达。KP 类器官细胞在免疫健全小鼠中形成了肺部转移，而缺乏 Rreb1、Il11、Pdgfb、Has2 或同时缺乏 Snai1 和 Zeb1 的类器官显示出有限的转移活性（图 1H、1I 和 S2O）。在由 KP 类器官形成的肺部转移中，肿瘤内胶原沉积和 SMA+ 细胞丰富，而在大小匹配的由敲除类器官形成的小病灶中则几乎不存在。在 393T3 或 KP 类器官转移中的富胶原区域相比于纤维化较差的区域，Il11、Pdgfb 和 Has2 转录物水平较高，通过 RNA-荧光原位杂交（FISH）检测得出。TGF-β 信号在 393T3 肺转移灶中存在，使用 TGF-β/SMAD 报告基因进行了验证。由这些细胞形成的肺部转移灶显示出较高的 mCherry 表达，而 Tgfbr2 敲除的对应细胞形成的转移灶中则表达较低。总体来说，这些结果表明，在 LUAD 中，TGF-β 反应的 EMT 和纤维化分支是驱动 LUAD 转移的关键组成部分。![]()
图1. TGF-β 反应的 EMT 和纤维化分支对于 LUAD 转移的必要性
(A) 热图展示了标志性 EMT 基因特征、TGF-β 反应特征、EMT 转录因子（EMT-TFs）、纤维化因子和 TGF-β 形式在患者来源的转移性 LUAD 细胞中的表达情况。每个细胞（列）根据其标志性 EMT 分数从左到右排列。对于每个基因，归一化的 z 值表示其在所有细胞中的归一化表达。n = 991 个细胞，来自 5 位患者的脑、椎骨和肾上腺转移。
(B) 在 Matrigel 中生长 2 天的 LUAD PDX 衍生类器官，分别用 SB505124（SB, 2.5 μM）或 TGF-β1（TGF-β, 100 pM）处理 2 小时。数据为平均值 ± SD；n = 3。
(C) 在同基因免疫健全小鼠中尾静脉注射 WT、Tgfbr2-KO、Rreb1-KO、Snai1/Zeb1-KO、Il11-KO、Pdgfb-KO、Has2-KO、Ctgf-KO 或 Wisp1-KO 的 393T3 细胞 21 天后的肺部定殖负担。通过离体萤火虫荧光素酶生物发光成像（BLI）进行定量分析。数据为平均值 ± SD；n = 5–20 只小鼠每组；单因素方差分析（ANOVA）。相对于 WT，ns：无显著差异，*p < 0.05，****p < 0.0001。
(D) 来自 (C) 实验中的肺部肿瘤的代表性苏木精和伊红（H&E）染色、Masson 三色染色以及 α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）免疫荧光（IF）。比例尺，100 μm。
(E) 生成复合 KP LUAD GEMMs 的示意图。
(F) 这些 GEMMs 的肺肿瘤的代表性 H&E 染色。比例尺，100 μm。
(G) GFP+ 细胞集落在 GEMMs 中纵隔淋巴结和肾上腺的发生率。
(H) 在免疫健全小鼠中尾静脉注射对照、Rreb1-KO、Snai1/Zeb1-KO、Il11-KO、Pdgfb-KO 或 Has2-KO 的 KP LUAD 类器官 56 天后的肺部转移的代表性 H&E 染色、Masson 三色染色和 α-SMA 免疫荧光。顶部显示了肿瘤直径的范围。比例尺，100 μm。
(I) 图 1H 中的肺定殖负担通过萤火虫荧光素酶生物发光成像（BLI）进行定量分析。数据为平均值 ± SD；n = 8–10 只小鼠每组；单因素方差分析；****p < 0.0001。
(J) 表达诱导性 SMAD 报告基因构建的 WT 和 Tgfbr2-KO 393T3 细胞，在 SB 或 TGF-β 处理 24 小时后的 GFP IF、mCherry IF 和 DAPI 染色代表性图像。比例尺，100 μm。
(K) 在喂食多西环素饮食的小鼠肺部转移结节中，表达诱导性 SMAD 报告基因构建的 393T3 细胞的 GFP IF、mCherry IF 和 DAPI 染色代表性图像。比例尺，100 μm。
(L) RAS 依赖的 TGF-β 反应在 LUAD 细胞中纤维化和 EMT 分支的图示总结。这两个分支及其各自的组成基因均是肺转移生长所必需的。
参见图 S1 和 S2。
2.3 TGF-β 和 RREB1 依赖的染色质可及性
与其他 TGF-β 靶基因不同，Snai1、Has2、Il11 和 Pdgfb 的诱导需要 TGF-β 激活的 SMAD 与 RREB1 的协同作用。为了解这种需求的基础，我们使用转座酶可及染色质测序法（ATAC-seq）测量了野生型（WT）和 Rreb1 敲除的 393T3 细胞的全局染色质可及性。在暴露于 TGF-β 后，WT 细胞全基因组的染色质可及性显著增加（图 2A）。这些增加中近一半在 Rreb1 敲除细胞中缺失。大多数 RREB1 依赖的可及性增加发生在与 EMT、TGF-β 信号通路和 RAS 信号通路相关的基因附近（图 2B）。SMAD 结合元件是这些区域中最显著富集的转录因子（TF）基序（图 2C）。在 Snai1、Has2、Pdgfb 和 Il11 位点的 ATAC-seq 轨迹中，所有 RREB1 和 TGF-β 依赖的可及性峰均位于转录起始位点（TSS）远端（图 2D）。相反，两个 RAS 非依赖的 TGF-β 靶基因 Smad7 和 Skil 缺乏 RREB1 和 TGF-β 依赖的染色质可及性峰（图 2D）。总的来说，RREB1 和 SMAD 转录因子协同增加了纤维化 EMT 基因位点的特定区域的染色质可及性。2.4 RREB1 为 TGF-β 诱导的增强子激活做好准备
通过染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq），我们发现 RREB1 在 393T3 细胞中已广泛结合于基因组各处，且在 TGF-β 刺激之前即存在（图 S3A 和 S3B）。在 TGF-β 信号通路中，SMAD2 和 SMAD3 由 TGF-β 受体磷酸化，与 SMAD4 形成三聚体复合物，随后与靶增强子和启动子结合。已知 SMAD2 和 SMAD3 招募组蛋白乙酰转移酶 p300 和 CBP，但 SMAD4 在转录中的具体功能尚不清楚。大约 75% 的 RREB1 初始结合位点和 92% 的注释基因在 TGF-β 刺激后也被 SMAD2/3 和 SMAD4 占据，且这些占据位置在纤维化和 EMT 转录因子基因位点中尤为明显（图 2E）。RREB1 结合区域分为两类。一类是位于 TSS 附近的开放染色质区域，这些区域靠近 RREB1 结合的共识 RAS 反应元件（RRE）DNA 序列基序（图 2E 和 S3D）。另一类则是染色质在 TGF-β 刺激后变得可及的区域，这些区域缺乏可识别的 RRE 基序，表明 RREB1 在这些区域接触染色质以为 TGF-β 反应做好准备。在 Smad7 或 Skil 基因中未检测到 RREB1 结合（图 2E）。我们使用目标下的组蛋白 3（H3）修饰的切割释放核酸酶（CUT&RUN）分析技术对组蛋白 3（H3）修饰进行了分析。H3K4me3 是活性启动子的标记，在 TGF-β 刺激下富集于 Snai1、Has2、Pdgfb、Smad7 和 Skil 的 TSS 附近（图 2F）。相反，在 Snai1、Has2、Il11 和 Pdgfb 的 RRE 缺乏的 RREB1 结合区域，基础条件下富含 H3K4me1，并在 TGF-β 刺激下获得 H3K27ac（图 2F），标记这些区域为 RREB1 准备的增强子，在 TGF-β 反应中被激活。Smad7 和 Skil 位点包含活性增强子。这与之前将 TGF-β 响应增强子分为准备增强子（H3K4me1 高；H3K27ac 低；H3K27me3 低）和活性增强子（H3K4me1 高；H3K27ac 高；H3K27me3 低）的分类相一致。Rreb1 敲除抑制了 TGF-β 依赖的 H3K27ac 和 SMAD 在准备增强子中的积累，但并未阻止 SMAD2/3 结合到启动子区域。RNA 聚合酶 II（RNAPII）CUT&RUN 分析表明，TGF-β 促进了 RNAPII 在 Snai1、Has2、Il11 和 Pdgfb 的加载，而 RNAPII 在 Smad7 和 Skil 上已预加载。这些结果表明，RREB1 介导的纤维化和 EMT 基因增强子准备对于这些基因在 TGF-β 作用下的转录激活是必要的。![]()
图2. RREB1 为 TGF-β 激活做好增强子的准备
(A) 热图显示 WT 和 Rreb1-KO 393T3 细胞在 SB 或 TGF-β 处理 1.5 小时后的 ATAC-seq 峰。通过 DESeq2 分析（log2 转换倍数变化 ≥ 1；错误发现率 [FDR] ≤ 0.05）确定 ATAC-seq 峰。
(B) 火山图显示在 WT 和 Rreb1-KO 393T3 细胞的 TGF-β 依赖性 ATAC-seq 峰中差异表达的基因特征。
(C) 转录因子结合基序在 WT 和 Rreb1-KO 393T3 细胞的 TGF-β 依赖性 ATAC-seq 峰中的差异富集，使用 DESeq2 分析确定。
(D–G) ATAC-seq（D）、HA-RREB1、SMAD2/3 和 SMAD4 ChIP-seq（E）、H3K4me3、H3K4me1、H3K27ac 和 H3K27me3 CUT&RUN（F）、以及 RNA 聚合酶 II（RNAPII）CUT&RUN（G）在 393T3 细胞中的指定基因位点轨迹。这些细胞表达 HA-RREB1 并与 SB 或 TGF-β 孵育 1.5 小时。Rreb1-KO 细胞在 (D) 中也包括在内。根据 RREB1 JASPAR 基序确定了 RAS 反应元素（RRE）的位置。P，启动子；E，增强子。
(H) 示意图表示 RAS 依赖和 RAS 非依赖 TGF-β 靶基因中不同的增强子和启动子状态。SBEs，SMAD 结合元素。
2.5 RREB1重要共因子的鉴定
我们结合蛋白质组学和CRISPR敲除筛选，识别了介导纤维化EMT激活的RREB1共因子（图3A）。RREB1存在多个剪接变体，包含多达15个C2H2型锌指（ZF）结构域。小鼠RREB1的一种亚型，包括前11个ZF（RREB1残基1-1,291，RREB1[ZF1-11]），能够恢复Rreb1敲除细胞中的RAS依赖性TGF-β基因反应。因此，我们将HA表位标签的RREB1(ZF1-11)载体转导到393T3 LUAD细胞中，并分别使用SB或TGF-β进行孵育。通过质谱（MS）分析免疫沉淀的RREB1(ZF1-11)复合物，鉴定出82种与RREB1相关的蛋白质，其中28种在TGF-β处理的细胞样本中比SB处理的细胞富集超过两倍（图3B，表S1）。TGF-β/SMAD和RAS/RREB1通路协同诱导这一组EMT转录因子和纤维化基因的另一种背景是在胰腺导管腺癌（PDAC）中。PDAC和LUAD细胞的关键区别在于，在PDAC中，这一反应会导致凋亡，因为SNAIL破坏了一个重要的转录网络，而在LUAD细胞中，EMT与凋亡并不耦合。PDAC细胞源自基因工程的Pdx1-Cre；Kras^LSL-G12D；Cdkn2a^flox/flox；Smad4^flox/flox小鼠，恢复SMAD4的表达会导致TGF-β和RAS/RREB1介导的纤维化EMT的诱导，随后发生细胞凋亡。通过转导HA-RREB1(ZF1-11)，并分别使用SB或TGF-β进行孵育以及MS分析免疫沉淀的HA-RREB1(ZF1-11)复合物，鉴定出84种与RREB1相关的蛋白质，其中47种在TGF-β处理的细胞中富集超过两倍，22种与在393T3细胞中鉴定的RREB1相关蛋白质重叠（图3C和3D，表S1）。我们设计并筛选了一个针对84种RREB1相关蛋白的CRISPR-Cas9敲除文库（每个靶点6个sgRNA）（表S2）。作为阳性对照，我们包含了靶向Smad3的sgRNA。我们通过深度测序从基因组DNA中扩增的sgRNA来确定文库的代表性，采样时间点为转导早期（T0）和3次倍增后的时间点（T3）。为量化基因靶向在这一过程中的影响，我们通过计算T3和T0之间sgRNA丰度的中位log2倍变化来评估基因评分（GS）。Smad3靶向sgRNA在筛选中表现最好，其次是Fosl1、JunB、Dhx9、Meaf6、Rbbp5和Ino80靶向的sgRNA（图3E）。通过独立的基因敲除实验，确认了这些基因在TGF-β诱导的凋亡中的作用。SMAD3、DHX9、INO80和RBBP5是TGF-β处理的细胞中显著与RREB1结合的蛋白质（图3B和3C）。先前报道的EMT调控因子，如HMGA2和KDM6B，也被识别为RREB1相关蛋白质，但在我们的功能筛选中得分不高，与其敲除对TGF-β依赖的Snai1诱导影响较弱的结果一致（图S4B和S4C）。在恢复SMAD4的PDAC细胞中，单独敲除Smad3、Dhx9、Meaf6、Rbbp5或Ino80可减弱TGF-β诱导的Snai1、Has2和Il11的表达（图S4D）。JunB和Fosl1的敲除对TGF-β诱导的纤维化EMT基因的表达影响有限，表明JUNB和FRA1（Fosl1编码的Fos相关抗原1）在EMT的下游起作用（图3F）。我们还排除了RBBP5，因为其敲除还抑制了Smad7的诱导，这是一种RAS非依赖的TGF-β效应。具有正常Smad4的PDAC肿瘤在Pdx1-Cre；Kras^G12D/+；Trp53^R172H/wt小鼠中形成，这些肿瘤具有完整的SMAD4，TGF-β信号与凋亡解耦，在TGF-β诱导纤维化和EMT基因时表现较弱。因此，我们决定在LUAD细胞中重点研究DHX9和INO80。Dhx9和Ino80的敲除并不影响393T3细胞的增殖，但削弱了TGF-β依赖的Snai1、Has2和Il11的表达，而Meaf6敲除影响较小。更广泛的RNA-seq分析显示，Dhx9或Ino80敲除细胞中TGF-β基因反应的特定丧失，包括整个RREB1依赖的TGF-β基因表达程序。393T3细胞中的CUT&RUN分析表明，Rreb1、Dhx9或Ino80的敲除抑制了TGF-β依赖的RNA聚合酶II（RNAPII）在Snai1、Has2和Il11启动子上的招募（图3H）。![]()
图3. INO80 和 DHX9 被鉴定为关键的 RREB1 共因子
(A) RREB1 靶向的蛋白质组学与 CRISPR 敲除筛选相结合的示意图，用于识别 TGF-β 依赖的 EMT 的关键介质。
(B 和 C) 在 HA-RREB1 免疫复合物中鉴定出的 82 个（B）和 84 个（C）与转录相关的蛋白质（参见表 S1），分别来自 393T3 LUAD 细胞（B）和恢复 SMAD4 的 PDAC 细胞（C）。根据 TGF-β 对这些复合物中蛋白质丰度的影响进行绘制。参与 CRISPR 敲除筛选的 RREB1 相关蛋白标示在图中（参见 E）。
(D) Venn 图显示了 (B) 和 (C) 中 HA-RREB1 相互作用蛋白的重叠部分。
(E) sgRNA 在恢复 SMAD4 的小鼠 PDAC 细胞中被富集，这些细胞存活于 TGF-β 诱导的 EMT 过程。图中标示了与最富集的 sgRNA 相对应的基因。
(F) TGF-β 信号通路的简要总结，显示了失功能分析确定的各步骤所需的特定因子。红色代表 PDAC 和 LUAD 细胞中 RAS 依赖性纤维化和 EMT-TF 基因诱导所特定需要的因子；蓝色表示测试的所有其他因子。
(G) RNA-seq 分析生成的热图，显示了 WT、Dhx9-KO 和 Ino80-KO 393T3 细胞中 RAS 依赖性和 RAS 非依赖性 TGF-β 响应基因在 TGF-β 处理 1.5 小时后的表达情况。n = 2。
(H) RNAPII CUT&RUN 轨迹显示 Snai1、Has2、Il11、Smad7 和 Skil 基因位点在 WT、Rreb1-KO、Dhx9-KO 和 Ino80-KO 393T3 细胞在 SB 或 TGF-β 处理下的染色质占据情况。
(I) 小鼠静脉注射 WT、Dhx9-KO 或 Ino80-KO 393T3 细胞后的肺组织代表性 H&E 染色、Masson 三色染色和 a-SMA 和 GFP 免疫荧光染色。Dhx9-KO2 393T3 细胞没有生成可检测到的转移性结节。
(J 和 K) 在小鼠静脉注射（J）或心脏内注射（K） WT、Dhx9-KO 或 Ino80-KO 393T3 细胞 21 天后的转移性肿瘤负担，使用 BLI 进行定量分析。数据为平均值 ± SD；n = 6–14；单因素方差分析（one-way ANOVA）；****p < 0.0001。
(L 和 M) 转移性结节中三色染色（L）和 a-SMA 染色（M）的定量分析。图中指示了每组的样本数量。Dhx9-KO2 393T3 细胞没有生成可检测的转移性结节。
(N) 在免疫健全小鼠中静脉注射 WT、Dhx9-KO 或 Ino80-KO KP 类器官 56 天后的肺组织代表性 H&E 染色、Masson 三色染色和 a-SMA 免疫荧光染色。
(O) 图 3N 中的小鼠肺部转移负担，通过萤火虫荧光素酶 BLI 进行量化。数据为平均值 ± SD；n = 9–12 只小鼠每组；单因素方差分析；****p < 0.0001。
(P 和 Q) 转移性结节中三色染色（P）和 a-SMA 染色（Q）的定量分析。
(R) 在无胸腺小鼠中尾静脉注射 WT、DHX9-KO 或 INO80-KO 人 LUAD A549 细胞 63 天后的肺部转移负担，通过萤火虫荧光素酶 BLI 进行量化。数据为平均值 ± SD；n = 6–7 只小鼠每组；单因素方差分析；****p < 0.0001。
参见图 S4 和表 S1、S2。
2.6 DHX9和INO80在纤维化EMT反应和LUAD转移中的作用
Dhx9和Ino80敲除抑制了通过静脉注射或心脏内注射的393T3细胞的肺部转移。与大小匹配的对照病灶相比，由Ino80敲除和Dhx9敲除细胞形成的小病灶中胶原沉积减少，SMA+细胞也减少，这与Rreb1或纤维化EMT成分缺失的LUAD细胞表型相符。在KP肿瘤类器官中敲除Dhx9和Ino80并不影响类器官的形成，但阻碍了TGF-β诱导的纤维化EMT基因反应，并抑制了免疫健全小鼠中的肺部转移。我们还在KRAS突变的A549人LUAD细胞系和患者来源的KRAS突变LUAD异种移植体中敲除了TGFBR2、RREB1、DHX9和INO80。在这些细胞中，DHX9、INO80或RREB1的敲除抑制了TGF-β介导的纤维化EMT基因反应的诱导，但不影响SMAD7的表达诱导，而TGFBR2的敲除则抑制了所有这些反应。敲除DHX9或INO80可抑制A549细胞在无胸腺小鼠中的肺部转移。因此，INO80和DHX9与RREB1一起作为TGF-β反应和转移的介质发挥作用。2.7 SMAD 与 DHX9 和 INO80 的相互作用
TGF-β 诱导了 DHX9、INO80 和 SMADs 在全基因组范围内与预先结合的 RREB1 区域结合（图 4A），并在 Snai1、Has2、Il11 和 Pdgfb 的已准备增强子处结合（图 2E 和 4B），这些通过 ChIP-seq 分析确定。Rreb1 敲除削弱了 TGF-β 诱导的 DHX9 和 INO80 与这些区域的相互作用（图 4B 和图 S5A）。TGF-β 诱导的 DHX9 招募到 Snai1 和 Has2 增强子需要 INO80，而 INO80 的招募则不依赖于 DHX9（图 S5B）。接近连接分析和免疫共沉淀实验显示，RREB1 在 TGF-β 加入后30分钟内与核内的 SMAD2/3、SMAD4、DHX9 和 INO80 发生了相互作用（图 4C–4F）。我们研究了 SMAD 蛋白是否在招募 DHX9 和 INO80 到 RREB1 准备的增强子中起作用。在没有 TGF-β 处理的情况下，DHX9 与 SMAD3 形成复合物，而 INO80 与免疫沉淀的 SMAD4 形成复合物，并且这些相互作用并不会因细胞与 TGF-β 的孵育而增加（图 4G）。SMAD3 是 DHX9 与 RREB1 相互作用所必需的（图 4H）。SMAD4 则是 TGF-β 诱导 INO80 与 RREB1 相互作用所必需的（图 4I）。SMAD3 和 SMAD4 分别是 TGF-β 诱导 DHX9 和 INO80 与 RREB1 准备的增强子相互作用的必要条件（图 4J 和 4K）。INO80 与 DHX9 之间存在基础水平的相互作用（图 4G），而 INO80 与 RREB1 之间也存在相互作用（图 4I）。SMAD 转录因子由 N 端（MH1）DNA 结合域和通过柔性连接区域连接到 C 端（MH2）的结构域组成。SMAD2 和 SMAD3 具有广泛的序列同源性，但它们与 DNA 相互作用的变构调控不同。尽管 SMAD2 在 393T3 细胞中响应 TGF-β 与 SMAD4 发生相互作用，但 SMAD2 基本上排除在 SMAD3、SMAD4、DHX9 和 INO80 组成的 RREB1 复合物之外。Smad3 的敲除或 Smad4 的敲低消除了 TGF-β 对纤维化和 EMT 转录因子的基因响应，而 Smad2 的敲低则没有类似的效果。这些结果表明，预先存在的 SMAD3-DHX9 和 SMAD4-INO80 复合物在 TGF-β 的作用下共同作用于 RREB1 准备的增强子上。![]()
图4. SMAD 介导的 INO80 和 DHX9 招募到 RREB1 准备的增强子
(A) 在 SB 或 TGF-β 处理 1.5 小时后的 393T3 细胞中，SMAD2/3、SMAD4、DHX9 和 INO80 在 RREB1 ChIP-seq 峰中心 ±2 kb 的基因组区域的染色质占据情况的 metaplot 和 tornado plot。
(B) 在 WT 和 Rreb1-KO 393T3 细胞中的 SMAD4、INO80 和 DHX9 ChIP-seq 轨迹，显示 Snai1、Has2、Il11 和 Pdgfb 基因位点。启动子（绿色）和准备增强子区域（粉红色）已突出显示（参见图 2D）。
(C) 接近连接分析（PLA）显示 HA-RREB1 在 393T3 细胞中与 DHX9、INO80、SMAD2/3 和 SMAD4 的 TGF-β 依赖性相互作用。比例尺，100 μm。
(D) 图 4C 中核 PLA 信号的定量分析。单因素方差分析（one-way ANOVA）；****p < 0.0001。
(E–G) 表达 HA-RREB1 的 393T3 细胞与 SB 或 TGF-β（Tb）孵育 1.5 小时（E 和 G）或指定的时间段（F），使用指定抗体进行免疫共沉淀（IP），然后使用左侧指定的抗体进行西方印迹分析。
(H 和 I) WT 和 Smad3-KO（H）或 Smad4 击倒（KD）的 393T3 细胞（I）在 SB 或 TGF-β 处理 1.5 小时后，用指定的抗体进行免疫共沉淀（IP），然后使用左侧指定的抗体进行西方印迹分析。
(J) ChIP-PCR 分析显示 DHX9 在 WT 或 Smad3-KO 393T3 细胞中与 Snai1 和 Has2 增强子的结合情况。数据为平均值 ± SD；n = 3；双因素方差分析；****p < 0.0001。
(K) ChIP-PCR 分析显示 INO80 在 393T3 细胞中与 Snai1、Has2 和 Smad7 增强子的结合情况，细胞表达对照或靶向 Smad4 的短发夹 RNA（shRNA）。数据为平均值 ± SD；n = 3；双因素方差分析；****p < 0.0001。
参见图 S5。
2.8 SMAD3-DHX9 招募 CBP 到准备好的纤维化 EMT 增强子
DHX9（又称 RNA 解旋酶 A）包括一个解旋酶结构域，用于解开三链 DNAR 环结构，还有一个双链 RNA 结合域（RBD）、一个 DNA 结合域（RGG）和一个最小转录激活域（MTAD）。虽然解开 R 环对转录很重要，但使用 DNA-RNA 免疫沉淀和 cDNA 转换结合高通量测序（DRIPc-seq）的 R 环图谱绘制仅在加入 TGF-β 后检测到了 Snai1、Has2、Il11、Pdgfb、Smad7 或 Skil 中的 DNA-RNA 杂合体。此外，携带解旋酶失活突变（K417R）的 DHX9 以及野生型 DHX9 都可以在 Dhx9 敲除细胞中恢复 TGF-β 诱导的 Snai1 和 Has2 表达。结构域图谱实验显示 SMAD3 的 MH2 结构域介导了 SMAD3 与 DHX9 的相互作用，而 DHX9 的 RBD 结构域并不需要参与这种相互作用。然而，删除 RBD 的构建体（DHX9-ΔRBD）无法在 Dhx9 敲除的 393T3 细胞中恢复 TGF-β 诱导的 Snai1 和 Has2 表达。RBD 与共激活因子乙酰转移酶 CREB 结合蛋白（CBP）相互作用。确实，Dhx9 的敲除抑制了 TGF-β 诱导的 CBP 与 SMAD3 的相互作用。此外，TGF-β 诱导了 CBP 在 Snai1、Has2、Il11 和 Pdgfb 的 RREB1 准备增强子上的招募，而在 Dhx9 敲除细胞中，这种招募被抑制。TGF-β 依赖的 H3K27 乙酰化的增加也需要 DHX9。相反，CBP 在 Smad7 增强子上的招募较弱，并且不依赖 DHX9，这与 Smad7 增强子中观察到的 H3K27ac 增加有限相一致。这些结果表明，SMAD3 结合的 DHX9 招募 CBP 来激活 TGF-β 反应中的 RREB1 准备增强子。![]()
图5. SMAD4 介导的 INO80 招募在 LUAD 转移中的重要作用
(A) 比较了 SMAD3（PDB: 1U7F）和 SMAD4（PED00194 条目）的 WT 和突变 MH2 结构，突出显示了它们之间的差异。SMAD4 M1 突变体模型（薄荷绿色）通过 ColabFoldv1.5 生成。标注了感兴趣的结构元素。底部，SMAD3 和 SMAD4 全长结构域的示意图，标明了在 M1 和 M2 突变体构建中修改的区域。
(B) 包含一个 SMAD4 MH2 结构域（蓝色）和两个 SMAD3 MH2 结构域（黄色和橙色）的异三聚体。SMAD4 的结构独特区域已进行颜色编码并标注。SMAD4 MH2 结构域包含在溶液中可见的延伸 α-螺旋和 C 端尾部（PED00194 条目），但在 X 射线数据中缺失。
(C 和 D) 表达 WT 或 M1 或 M2 SMAD4 构建体的 Smad4-KD 393T3 细胞按指示与 SB 或 TGF-β 共孵育 1.5 小时，进行免疫共沉淀（IP），然后对免疫复合物进行左侧指示抗体的西方印迹分析。
(E) Snai1、Has2、Il11、Pdgfb 和 Smad7 的 mRNA 水平在表达空载体（−）、SMAD4（WT）或 SMAD4 M1 载体的 WT 和 Smad4-KD 393T3 细胞中被测量，并用 SB 或 TGF-β 处理 1.5 小时。n = 3；双因素方差分析（two-way ANOVA）；****p < 0.0001。
(F) 小鼠尾静脉注射（E）中描述的细胞 21 天后，代表性的离体肺部 BLI 图像。小鼠喂食多西环素饮食。
(G) 同一实验中小鼠的肺转移负担，通过离体萤火虫荧光素酶 BLI 进行量化。数据为平均值 ± SD；n = 5 只小鼠每组；单因素方差分析（one-way ANOVA）；****p < 0.0001。
2.9 SMAD4 招募 INO80 的关键作用
SMAD4 与 SMAD2 和 SMAD3 的结构区别之一在于其连接区和 MH2 结构域的区域。该区域为 MH2 结构域贡献了一条平行链以及一个柔性环。在现有的三聚体 SMAD 复合物的 X 射线晶体结构中，仅显示了 MH2 结构域的刚性核心及其相互作用界面，但在 SMAD4 MH2 单体结构中观察到了额外的结构元素。通过对 SMAD4 的 MH2 结构域进行建模，显示这些额外的元素并不属于 SMAD 三聚体界面的一部分，而是保持了可接近性。我们构建了一个名为“M1”的突变体 SMAD4，该突变体将延伸的 α 螺旋和环结构的三圈（SMAD4 残基 454-493）替换为 SMAD3 的 GFEAVY 序列（残基 359-364），并删除了最后 8 个 C 端残基。我们还构建了“ M2”突变体，通过用三次重复的 GGGGS 序列替换柔性环中的 15 个残基（SMAD4 残基 294-310）。在 Smad4 敲低的 393T3 细胞中，WT、M1 和 M2 蛋白的表达水平相似。M1 突变体完全丧失了在基础条件下与 INO80 形成复合物的能力；相比之下，M2 突变体保留了这种能力，接近 WT SMAD4。在 TGF-β 刺激下，这些突变体保留了与 SMAD3 结合的能力，尽管 M1 在这一活动中有所受损。这些结果表明，SMAD4 延伸的 α 螺旋/环结构和 C 端尾部形成的突出结构在结合 INO80 中起作用。在 Smad4 敲低的 393T3 细胞中，重新表达 WT SMAD4（但不是 M1 突变体）恢复了 TGF-β 诱导的纤维化 EMT 基因表达和转移能力，表明 SMAD4 招募 INO80 对 TGF-β 激活促转移的 EMT 转录因子和纤维化基因至关重要。2.10 INO80 清除 RREB1 准备的增强子上的 H2A.Z 核小体
INO80 是一个依赖 ATP 的染色质重塑复合物的核心 ATP 酶亚基，参与 DNA 转录、复制和修复。INO80 通过与 DNA 和组蛋白的多个接触来调节启动子和增强子上的核小体位置及组成，甚至可以将靶向核小体中的 H2A 交换为变异体 H2A.Z。已显示 H2A.Z 介导了基因的抑制。Ino80 敲除削弱了 393T3 细胞中 TGF-β 诱导的全基因组染色质可及性的增加，包括纤维化和 EMT 基因的启动子和 RREB1 准备的增强子。INO80 的表达可以恢复 TGF-β 在 Ino80 敲除细胞中对 Snai1 和 Has2 的诱导，而缺少催化结构域的构建体（INO80-ΔSNF）则无法恢复。H2A.Z 的 ChIP-seq 分析显示 H2A.Z 在全基因组范围内的 RREB1 结合位点处积累。与 TGF-β 共孵育的细胞排除了 RREB1 结合峰中心的 H2A.Z，而不影响 H2A。H2A.Z 存在于 Snai1、Has2、Il11 和 Pdgfb 的 RREB1 准备的增强子中，与 TGF-β 共孵育后（<2小时内），这些增强子中的 H2A.Z 载荷的核小体被快速清除。这一效应依赖于 RREB1 和 INO80。我们通过微球菌核酸酶消化和深度测序（MNase-seq）评估核小体占据情况，发现 TGF-β 刺激后 RREB1 准备的纤维化和 EMT 基因增强子上的核小体被清除。2.11 H2A.Z 抑制 RREB1 准备的增强子
接下来，我们研究了 H2A.Z 在维持 RREB1 准备增强子的抑制状态中的作用。为了避免永久性耗尽 H2A.Z 对细胞产生的全局影响，我们在 393T3 细胞中使用多西环素控制的条件性 CRISPR 干扰（CRISPRi）暂时耗尽 H2A.Z。两种独立的 gRNA 下调 H2afz（编码 H2A.Z）的表达后，恢复了 TGF-β 在 Ino80 敲除细胞中对 Snai1、Has2、Il11 和 Pdgfb 的诱导。此外，H2afz 的下调恢复了这些 Ino80 缺失细胞的肺部转移能力。相反，H2afz 的下调仅在 Rreb1 敲除细胞中略微恢复了这些基因反应，这表明 RREB1 还具有其他如招募 SMADs 和 DHX9 的功能。MNase-qPCR 测试显示，H2afz 敲低可以恢复 TGF-β 在 Ino80 敲除细胞中对增强子染色质可及性和核小体移动性的诱导。![]()
图6. INO80 从 RREB1 准备的增强子中清除抑制性的 H2A.Z 核小体
(A) 热图展示了 TGF-β 调控的 ATAC-seq 峰。使用 DESeq2 分析（log2 转换的倍数变化 ≥ 1；错误发现率 [FDR] ≤ 0.05）比较 WT、Rreb1-KO 和 Ino80-KO 的 393T3 细胞在 SB 或 TGF-β 处理 1.5 小时后的变化。
(B) WT 和 Ino80-KO 393T3 细胞在 SB 或 TGF-β 处理下，目标位点的 ATAC-seq 轨迹。
(C) TGF-β 对 WT 细胞和表达指定 INO80 突变体的 Ino80-KO 393T3 细胞中 Snai1 和 Has2 mRNA 水平的影响。数据为平均值 ± SD；n = 3；双因素方差分析（two-way ANOVA）；****p < 0.0001。EV，空载体；FL，全长 INO80；DSNF，INO80-DRBD。
(D) 在 SB 或 TGF-β 处理的 393T3 细胞中，±3kb 以内的基因组区域内 H2A.Z 在 RREB1 ChIP-seq 峰中心的染色质占据情况的 metaplot 和 tornado plot。
(E) 393T3 细胞中 Snai1、Has2、Il11 和 Pdgfb 位点在 SB 或 TGF-β 处理 1.5 小时后的 ATAC-seq、H2A.Z ChIP-seq 和 MNase-seq 轨迹。
(F) ChIP-PCR 分析显示 H2A.Z 在 Snai1 和 Has2 增强子中的富集情况，比较 WT、Rreb1-KO 和 Ino80-KO 393T3 细胞。数据为平均值 ± SD；n = 3；双因素方差分析；****p < 0.0001。Enh，增强子。
(G) Ino80-KO 393T3 细胞通过两种独立的 sgRNAs 靶向 H2afz 进行 CRISPR 干扰，并进一步转导使 Cas9 在多西环素诱导下表达的系统。在尾静脉注射这些细胞 21 天后，代表性小鼠肺部的离体 BLI 图像显示。小鼠被喂以含有多西环素的饮食。
(H) 通过离体萤火虫荧光素酶 BLI 量化这些小鼠的肺部转移负担。数据为平均值 ± SD；n = 6–7 只小鼠每组；单因素方差分析（one-way ANOVA）；****p < 0.0001。
参见图 S6。
2.12 RREB1 的抑制抑制了转移
我们的发现提出了干扰 RREB1 功能可能会削弱纤维化 EMT 基因反应并抑制 LUAD 转移的可能性。通过使用不同的 HA 表位标记 RREB1 片段转导 393T3 细胞，定义了这些过程中所需的功能性 RREB1 结构域。RREB1(ZF1-11) 包含前 11 个 ZF 结构域，能与 Snai1 和 Has2 的启动子和 RREB1 准备的无 RRE 增强子结合。RREB1 片段仅包含 ZF1-5（RREB1[ZF1-5]）也可以与这些增强子和启动子区域结合，而包含 ZF6-11 的另一个突变体（RREB1[ZF6-11]）则无法与这些区域结合。HA-RREB1(ZF1-5) 可以直接结合 Snai1 和 Has2 的 RRE 区域的探针，表明 RREB1 通过 ZF1-5 区域与 RRE 结合。RREB1(ZF1-5) 仍能在 TGF-β 处理的细胞中与 SMADs 和 INO80 结合，但不能与 DHX9 结合。在 Rreb1 敲除的 393T3 细胞中表达 RREB1(ZF1-5) 无法恢复 TGF-β 诱导的纤维化和 EMT-TF 基因表达或这些细胞的转移能力。RREB1(ZF1-5) 还显著抑制了 TGF-β 在 LUAD A549 细胞和患者来源的 RU631 类器官中诱导的纤维化和 EMT 基因反应。因此，RREB1(ZF1-5) 可作为内源性 RREB1 的竞争性抑制剂。为了增强 RREB1(ZF1-5) 作为分子工具抑制内源性 RREB1 的潜力，我们引入了 MAPK 磷酸模拟突变（S161D）生成 RREB1(ZF1-5;S161D) 变体。该变体在 393T3 细胞中过表达即可抑制肺部转移和肿瘤内纤维化。这些研究建立了一个具有吸引力的概念验证策略，通过治疗性破坏 RREB1 功能来阻止恶性过程，尤其是 TGF-β 依赖的 EMT 和纤维化。![]()
图7. RREB1的抑制抑制了转移
(A) RREB1的结构示意图，标明了UniProt中注释的锌指位置和保守的ERK磷酸化位点。
(B) 重组RREB1(ZF1-5)与组蛋白修饰肽阵列结合的信号强度定量分析，H4K16acK20ac含量的肽用红色突出显示（参见图S7C）。
(C) 在WT 393T3细胞中，IgG、H4K16ac和H4K20ac的ChIP-seq 轨迹显示在Snai1、Has2、Il11、Pdgfb、Smad7和Skil基因上。
(D) 表达HA-RREB1(ZF1-11)或HA-RREB1(ZF1-5)的393T3细胞与SB或TGF-β共同孵育1.5小时后，使用指定抗体进行免疫共沉淀（IP），然后用左侧指示的抗体进行西方免疫印迹分析。
(E) 表达空载体、WT或HA-RREB1(ZF1-5;S161D)的393T3细胞在SB或TGF-β孵育1.5小时后，Snai1、Has2、Il11、Pdgfb和Smad7的mRNA水平分析。数据为平均值 ± SD；n = 3；双因素方差分析（two-way ANOVA）；****p < 0.0001。
(F) 小鼠尾静脉注射WT或表达HA-RREB1(ZF1-5;S161D)的393T3细胞21天后，代表性的肺部H&E染色、Masson三色染色和a-SMA免疫荧光图像。每种细胞类型显示两个切片。
(G 和 H) 本实验中，代表性的离体生物发光成像（BLI）图像（G）和肺部转移负担（H），通过萤火虫荧光素酶BLI定量分析。数据为平均值 ± SD；n = 7只小鼠每组；双尾独立t检验；****p < 0.0001。
(I) TGF-β诱导纤维化和EMT-TF基因的两个分支的示意总结，这些分支共同支持肿瘤侵袭、成纤维细胞活化和ECM沉积，促进肺转移的生长。
参见图S7和表S3。
3. 讨论
3.1 纤维化 EMT 程序的两个分支共同促进 LUAD 转移
这项研究表明，LUAD 细胞中 TGF-β 反应的 EMT 和纤维化分支对于肺部转移的生长是必要的，并且它们共同形成一个驱动这一恶性过程的程序。暴露于 TGF-β 的 LUAD 转移细胞中 EMT-TF 和纤维化基因的表达相互独立但协调一致。SNAIL 和 ZEB1 的表达对于 LUAD 小鼠模型和患者来源类器官的转移生长是必要的，但不足以单独推动转移，还需要 IL11、PDGFB 和 HAS2 的共同表达。尽管 EMT 和纤维化分支在表达上不依赖于彼此，但它们的组成基因由共同的 TGF-β 和 RAS 信号输入调控，并且在功能上汇聚为推动转移的关键程序。3.2 纤维化 EMT 程序激活的决定因素
我们阐明了 TGF-β 通路在癌细胞中通过 RREB1 激活纤维化和 EMT 基因的分子基础。Snai1、Il11、Pdgfb 和 Has2 共享一组染色质特征，使它们对 TGF-β 的响应依赖于 RAS 激活的 RREB1。这些特征包括位于启动子附近的开放染色质中的 RREB1 结合 RRE 基序，以及被含有 H2A.Z 组蛋白变体和 H4K16acK20ac 双组蛋白标记的核小体占据的增强子。RREB1 结合在启动子附近的 RRE，并与含有 H4K16acK20ac 的核小体接触，为 SMAD 介导的激活做好准备。在 TGF-β 刺激后，SMAD4-INO80 和 SMAD3-DHX9 复合物结合到 RREB1 准备的增强子上。INO80 核小体重塑因子介导纤维化和 EMT 基因增强子上 H2A.Z 含量的清除，而 DHX9 则招募组蛋白乙酰转移酶 CBP 和 RNA 聚合酶 II（RNAPII）来激活这些基因。这些特性将纤维化 EMT 程序与 RAS 非依赖的 TGF-β 靶基因区分开来，后者在基础状态下有活性增强子和预加载的 RNAPII，并且不需要 INO80 或 DHX9 来激活。3.3 SMAD4 在 INO80 介导的染色质重塑中的作用
SMAD4 介导了 TGF-β 对许多发育、免疫和稳态过程的调节，此外还在胃肠癌中的肿瘤抑制以及 LUAD 和其他癌症的转移进程中发挥作用。SMAD4 与受体磷酸化的 SMADs 形成转录活性复合物。尽管不是所有的基因对 TGF-β 的反应都需要 SMAD4，但大多数都依赖于它，这一需求也延伸到 TGF-β 超家族的其他成员。尽管 SMAD4 在 TGF-β 通路中的中心地位已被确认，其具体功能在数十年中一直模糊不清。我们的证据表明，SMAD4 通过其 MH2 结构域的独特结构元素与 INO80 结合，并将其招募到 RREB1 准备的增强子上，以清除含有 H2A.Z 的核小体。据我们所知，SMAD4 在 TGF-β 信号传导中招募 INO80 进行核小体清除是其首个已知功能。SMAD4 招募的 INO80 可能细微地调节 H2A.Z 含量的核小体，以便在 TGF-β 刺激结束后仅暂时增加这些增强子的染色质可及性，从而让增强子返回到抑制状态。4. 研究局限性
本研究集中在 LUAD 肺部转移上，肺部转移是 LUAD 的一个主要临床并发症。然而，转移性 LUAD 也会影响骨骼、大脑、肝脏和肾上腺，这些器官的基质成分差异很大。TGF-β 纤维化 EMT 程序在损伤修复和纤维化疾病的发病机制中可能也很重要，这些推论还有待进一步研究。TGF-β 是广泛的多效性因子，几十年来一直难以作为治疗纤维化、癌症等与 TGF-β 失调相关的重大疾病的靶点。相比之下，RREB1 专门参与 RAS 依赖的 TGF-β 纤维化 EMT 程序，因此为选择性抑制这些致病性形式提供了潜在的靶点。我们的概念验证表明，经过合理设计的 RREB1 抑制剂可以用于抑制这些程序并抑制转移，这为测试该方法在 RREB1 参与的 TGF-β 驱动的疾病中的潜在应用打开了可能性。原文网址：https://www.cell.com/cell/abstract/S0092-8674(24)00905-X
