【文献解读】bmp10通过调节铁稳态维持心脏功能
文摘
科学
2024-10-26 17:00
江苏
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文献：Hu R, Li G, Hu P, Niu H, Li W, Jiang S, Guan G, Xu Q, Liu M, Chen L. bmp10 maintains cardiac function by regulating iron homeostasis. J Genet Genomics. 2024 Oct 14:S1673-8527(24)00263-7. doi: 10.1016/j.jgg.2024.10.003. Epub ahead of print. PMID: 39414074.
杂志：Journal of Genetics and Genomics
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心脏病仍是全球范围内的首要致死原因。铁元素失衡，无论是缺乏还是过载，都会引发心力衰竭。然而，心脏中铁元素稳态的分子调控机制尚不清楚。本研究发现，bmp10（一种对胚胎心脏发育至关重要的心脏发育形态发生素）发生突变会导致斑马鱼出现严重贫血和心脏肥大。起初，bmp10缺乏会导致心脏铁缺乏，随后由于心脏细胞中hepcidin/ferroportin轴失调，发展为铁过载，进而导致铁死亡和心力衰竭。在bmp10−/−突变体中早期补充铁元素可挽救红系造血，而在幼鱼中螯合铁则能显著减轻心脏肥大。本研究还进一步证实，HIF1α驱动的缺氧信号与IL6/p-STAT3炎症通路之间的相互作用对调控心脏铁代谢至关重要。本研究结果揭示了BMP10是脊椎动物心脏中铁稳态的关键调控因子，并强调了靶向BMP10-hepcidin-铁轴作为铁相关心肌病的潜在治疗策略的重要性。铁对于能量需求高和高度有丝分裂活跃的组织（如心肌、骨骼肌和造血组织）的正常功能至关重要。它在血红蛋白合成、红细胞分化和关键的氧化还原反应中发挥着至关重要的作用。不稳定铁池（LIP）的变化会导致心肌病和心力衰竭，因为无论是铁缺乏还是过载都是有害的。心肌中LIP升高可触发铁死亡，这是一种由铁依赖性脂质过氧化驱动的受调控的细胞死亡形式。相反，心肌细胞中铁水平严重降低会导致致命的收缩和代谢功能障碍，进而导致小鼠心力衰竭。在脊椎动物中，铁稳态受到铁调素（Hepcidin）的严格调控。这种肽类激素主要由肝脏产生，通过与铁输出膜蛋白——铁调素受体（ferroportin，FPN）结合来调节全身铁代谢。这种结合会触发FPN的内化和降解，从而抑制铁的释放。FPN和铁调素是各种组织中铁吸收、回收、储存和排泄的关键调节因子，而这些过程又受到一系列复杂的生理和病理条件（如缺氧、炎症和组织特异性细胞铁负荷）的调节。缺氧和贫血会抑制肝脏中铁调素的表达，从而促进铁的吸收和巨噬细胞中铁的释放。然而，研究表明，缺氧会强烈上调大鼠心脏中铁调素的表达，尤其是在心肌间质病中，这表明铁调素表达的调控在心脏中发挥着重要作用。此外，炎症触发的白细胞介素6（IL-6）及其受体（IL-6R）的激活会激活JAK酪氨酸激酶，导致信号转导子和转录激活子3（STAT3）复合物的形成，从而增强铁调素的表达。铁调素浓度的变化对健康有着严重影响：乳蛋素食儿童中铁调素水平较低，会出现亚临床铁缺乏，而铁调素过度表达则会导致转基因小鼠在出生时因严重铁缺乏伴炎症性贫血而死亡。骨形态发生蛋白10（BMP10）是一种属于转化生长因子β（TGF-β）超家族的肽类生长因子。它通过ALK1和形态发生蛋白受体II型或激活素受体2A型组成的受体复合物引发细胞内信号传导。在鸡、小鼠和人类中，BMP10主要在心脏中表达。在斑马鱼中，bmp10的高表达主要发生在心脏的心内膜中，而在肝脏、大脑和肾脏中的表达相对较低。BMP10的表达在发育过程中受到时间和空间的严格调控。Bmp10的缺乏或过度表达会导致小鼠胚胎出现严重的心脏缺陷而死亡。即使在小鼠中诱导性敲除Bmp10也会导致小鼠心脏增大并提前死亡。在斑马鱼中，bmp10的缺失会导致体长减少和心血管缺陷，表现为血管异常、心脏形态异常和提前死亡。有报道称，血管畸形/出血与心脏肥大和心室组织完整性受损之间存在相关性，这表明bmp10缺失的斑马鱼中出现了由血管缺陷引起的继发性高输出量心力衰竭。综上所述，目前的研究表明，BMP10在调节脊椎动物的心血管功能方面具有保守作用。包括BMP2、BMP6、BMP4和BMP9在内的多个BMP家族成员在调节铁代谢中发挥着重要作用。BMP2和BMP6以旁分泌的方式激活肝脏中的铁调素基因。BMP2和BMP6基因敲除小鼠由于BMP-SMAD通路下调导致肝脏铁调素表达减少，从而表现出铁过载。据报道，BMP10信号通路的改变与两种血管疾病——肺动脉高压（PAH）和遗传性出血性毛细血管扩张症（HHT）有关，并且发现干扰铁代谢可能是治疗PAH和HHT的潜在选择。这些发现表明，心血管疾病中BMP10的功能障碍可能与铁稳态失调有关。然而，BMP10与全身铁调节之间的关系尚待探索。在本研究中，我们提供证据表明，斑马鱼中bmp10的缺乏会导致多个组织中的铁代谢发生严重紊乱。bmp10突变体鱼的血清铁水平急剧下降，心脏铁含量失调，表现为严重贫血、心肌细胞铁死亡和脂质过氧化过度，以及先前报道的血管缺陷、出血和心脏肥大等表型。本研究确定了BMP10是心脏铁稳态的关键调节因子，为阐明出生后心血管功能的机制提供了见解。结果
bmp10的缺失导致斑马鱼出现严重的贫血和心脏肥大
为了探索bmp10在斑马鱼发育中的作用，我们使用CRISPR/Cas9系统生成了bmp10突变体。我们鉴定出三个携带移码无义突变的创始者，这些突变都发生在bmp10的第一个外显子中（图1A）。所有三个bmp10−/−纯合子品系从受精后第五周（wpf）开始表现出死亡率增加，大量死亡发生在第八周左右，并且大多数在第九周之前死亡。此外，只有一小部分（~18%）bmp10−/−突变体在这一时期后存活（图1B）。由于这三个突变品系产生了相同的表型，我们选择了p.E41Rfs*12品系进行进一步研究，该品系在第一个外显子中具有最早的翻译终止密码子（图S1A）。到第八周（大约半数死亡）时，大多数bmp10−/−纯合子表现出多种形态缺陷，包括体型较小（图1C和S1C）、鳞片突出和脱落、严重腹部水肿和皮肤出血（图1B）。因此，bmp10的破坏导致斑马鱼出现严重的形态学症状并缩短其寿命，这与先前的报道一致。![]()
图1 CRISPR/Cas9诱导的斑马鱼bmp10缺失及其相关表型与野生型（WT）相比，我们注意到bmp10−/−突变体的血液颜色较浅（图1D）。我们量化了从野生型、bmp10+/−杂合子和bmp10−/−纯合子幼鱼相同体积血液中抽取的红细胞总数。bmp10−/−纯合子的红细胞数量少于野生型和bmp10+/−杂合子。然而，bmp10−/−个体中红细胞的减少程度在4到10周之间有所不同（图1E），这通常与形态学症状的严重程度相对应。在相同的发育阶段（例如8周），具有严重形态学症状（如鳞片突出、水肿、血管扩张和体表可见出血）的个体被指定为bmp10−/−_ss（严重形态学症状）。与没有严重形态学症状的个体（被指定为bmp10−/−_ns，非严重形态学症状）相比，bmp10−/−_ss的红细胞数量减少得更多（图1F），这表明随着形态学缺陷的恶化，存活率和血细胞比容水平都在逐渐下降（图1G和1H）。bmp10−/−斑马鱼的另一个显著解剖学特征是心脏增大。具体来说，bmp10−/−_ss突变体的心脏增大，心肌纤维排列紊乱，而同龄的bmp10−/−_ns同胞的心脏增大则不那么显著（图1I）。bmp10−/−_ss突变体增大的心脏中，心房钠尿肽（nppa）和脑钠尿肽（nppb）的水平急剧增加（图1J），这两者都是心脏肥大的诊断标志物。这些发现表明，bmp10的破坏导致红细胞数量减少并诱发心脏肥大。我们在8周受精后（wpf）根据体表是否可见缺陷，将斑马鱼分为bmp10−/−_ns和bmp10−/−_ss两类。尽管这种分类可能无法清晰界定体内表型，但它有效地代表了心血管缺陷的不同阶段以及形态学症状从轻微到严重的进展。这两组之间最明显的区别是，bmp10−/−_ss具有鳞片严重突出和脱落、严重腹部水肿和皮肤出血等形态学缺陷，并且很快就会死亡。然而，在同一时期，bmp10−/−_ns没有这些形态学缺陷；它可能会发展成bmp10−/−_ss或存活更长时间。RNA-seq分析揭示bmp10−/−斑马鱼心脏中铁代谢失调为了探索bmp10缺乏诱导心脏肥大的机制，我们对8周受精后（wpf）收集的野生型和bmp10敲除（所有研究均使用pE41Rfs*12品系）心脏样本进行了RNA-seq分析。对这些差异表达基因（DEGs）进行KEGG富集分析发现，与野生型相比，bmp10−/−_ns和bmp10−/−_ss突变体中存在多个差异富集的通路。在bmp10−/−_ns心脏中，显著富集的通路包括细胞周期、p53信号通路、铁死亡和脂肪酸代谢，而bmp10−/−_ss心脏中特定富集的通路则与心血管功能、免疫反应、谷胱甘肽代谢以及DNA复制和修复相关（图S2A）。bmp10−/−突变体的心脏产生的DEGs远少于其他组，且仅有一个显著富集的KEGG通路：氨基酸的生物合成（图S2B）。值得注意的是，与野生型相比，“铁离子结合”这一GO分子功能术语在bmp10−/−_ss心脏中显著富集（图S2C）。相应地，bmp10−/−_ns和bmp10−/−_ss样本中有11个参与铁稳态调节的基因发生改变（图S2D）。这些发现与在bmp10−/−突变体心脏中鉴定出的富集的KEGG通路一致。因此，转录组分析表明bmp10−/−突变体心脏中铁调节被破坏。为了研究bmp10缺失对铁代谢的影响，我们首先测量了bmp10突变体血液和心脏中的铁浓度。bmp10的缺失导致bmp10−/−_ns和bmp10−/−_ss突变体血清铁浓度大约降低了三倍（图2A）。由于红细胞是血清中铁的主要来源，突变体中红细胞的持续减少可预期地导致所有突变体血清铁含量严重降低。bmp10−/−_ns突变体血清铁浓度更早降低（图2A）表明，在bmp10−/−_ss鱼出现严重形态学症状之前，bmp10−/−突变体中已发生系统性铁代谢紊乱。![]()
图2 bmp10的缺失导致斑马鱼心脏铁代谢失调和铁死亡相比之下，心脏中铁浓度表现出不同的变化：在无症状表型组（即bmp10−/−_ns）中，心脏铁浓度约为野生型的一半，但在严重症状表型组（即bmp10−/−_ss）中，心脏铁浓度显著高于野生型鱼类（图2B和S3A），这表明随着严重症状的出现，铁缺乏转变为铁过载。此外，细胞铁结合蛋白铁蛋白在bmp10−/−_ns中适度诱导，但在bmp10−/−_ss突变体心脏中显著增加，表明在疾病严重阶段铁迅速积累（图2C）。细胞铁过载是触发铁死亡的原因。通常，进入心脏细胞的铁通过与铁蛋白结合储存在细胞质中，从而减轻芬顿反应和活性氧（ROS）的产生。我们检查了与不稳定铁释放相关的两个基因的表达水平，发现自噬相关基因LC3和ncoa4在bmp10−/−突变体心脏中的表达逐渐增加，这表明铁蛋白自噬增强，细胞不稳定铁可能增加（图2D和2E）。同时，铁死亡的分子标志物ptgs2a在bmp10−/−_ss心脏中的表达急剧升高了10倍，表明存在强烈的铁死亡（图2F）。脂质过氧化是铁死亡的一个标志，由此产生的氧化应激可导致心脏损伤。我们的转录组数据表明，bmp10−/−心脏中的细胞氧化还原调节发生了变化，有利于氧化应激因子的积累（图2G）。这些变化包括抗氧化剂（nqo1）的减少，以及对于脂质过氧化物积累至关重要的酰基辅酶A合成酶（acsl）和脂氧合酶（lox）的增加。此外，bmp10−/−心脏中脂质过氧化的增加与丙二醛（MDA）的逐渐增加相关（图2H），丙二醛是脂质过氧化最常见的副产物，也是细胞损伤的指标。流式细胞术分析进一步揭示了bmp10−/−_ns和bmp10−/−_ss心脏中脂质过氧化和ROS含量的逐渐增加（图2I，S4A，S4B），这与在这些样本中观察到的更高水平的线粒体和DNA损伤相一致（图S4C和S4D）。此外，与细胞增殖和心肌病相关的基因表达改变表明bmp10−/−突变心脏中存在细胞损伤（图S4E和S4F）。铁死亡的经典途径是过氧化保护失活，而非经典途径则涉及已传导过度脂质过氧化的不稳定铁。为了确定铁是否是bmp10−/−心脏中的关键因素，我们检查了GPX4的水平，GPX4在经典途径中被认为是保护生物膜免受过氧化损伤的唯一谷胱甘肽过氧化物酶。结果表明，bmp10缺失导致bmp10-KO心脏中GPX4显著增加，这更倾向于铁参与严重疾病阶段的非经典铁死亡途径（图2J）。基于综合数据，我们得出结论：bmp10−/−_ss突变体中发生了完全的铁死亡，这由ptgs2a的显著上调和严重的脂质过氧化所证实。另一方面，bmp10−/−_ns突变体可能经历轻度氧化应激或不完全的铁死亡，这表现为脂质过氧化，但铁死亡途径未完全激活。这些结果证实了bmp10−/−_ss心脏中铁过载和氧化应激共同作用诱导的铁死亡。总体而言，bmp10对于维持斑马鱼心脏的铁稳态至关重要，其缺失会导致铁代谢失调和铁死亡。铁干预改善bmp10−/−突变体的红系造血并缓解心力衰竭为了进一步确定铁代谢失调是否导致bmp10−/−突变体中红细胞减少和心力衰竭，我们使用柠檬酸铁铵（FAC，一种铁补充剂）和去铁胺（DFO，一种铁螯合剂）对胚胎和幼鱼的铁代谢进行干预。我们首先使用来自杂合bmp10+/−亲本的同胞胚胎评估了红系造血。不同基因型的同胞胚胎在红细胞数量上显示出高度变异性（图3A和S5）。基因型鉴定和统计分析揭示了胚胎低色素现象与bmp10破坏之间的直接关联（图3B）。然后，我们尝试通过向一细胞期胚胎中引入bmp10 mRNA或FAC来挽救胚胎低色素现象。bmp10 mRNA和FAC注射均显著挽救了bmp10−/−胚胎中的低色素现象（图3C），从而验证了铁缺乏与bmp10−/−胚胎中红系造血减少之间的直接联系。![]()
图3 铁干预改善了bmp10−/−鱼的红细胞生成，缓解了心脏肥大，并降低了死亡率鉴于先前的研究发现bmp10突变体在严重疾病阶段心脏出现铁过载，我们测试了铁螯合剂（DFO）的效果。由于bmp10突变体大约在6周龄鱼龄（wpf）时开始死亡（图1B），且从出现表型病理到死亡大约需要一周时间，因此救援实验需要提前1-2周进行。因此，应在4周龄鱼龄时进行，此时尚未出现严重的形态学症状，但仍有与bmp10−/−突变体相当的缺氧反应，如HIF1α水平升高（图S6）。结果表明，与未治疗组仅约20%的存活率相比，DFO治疗组在14周龄鱼龄时约有90%的突变体存活（图3D）。根据存活率来看，添加DFO并未使情况恶化。铁螯合显著减轻了形态学表型和心脏肥大（图3E）。相应地，DFO处理的bmp10−/−突变体的心脏铁含量显著降低（图3F），这表明DFO螯合铁使bmp10−/−胚胎的心脏铁水平保持在向严重疾病进展之前的bmp10−/−_ns胚胎的水平。此外，获救的bmp10−/−突变体的红细胞数量增加（图3G）。与改善的心脏状况一致，与未治疗的bmp10−/−突变体相比，nppa、nppb和ptgs2a的水平显著降低（图3H-3J）。DFO处理过的鱼中，由MDA水平指示的脂质过氧化水平也显著降低（图3K）。对各种组织的组织学分析表明，所使用的铁干预水平对野生型（WT）斑马鱼没有不良影响。然而，它确实显著减轻了bmp10−/−斑马鱼心脏、肝脏和肠道的损伤（图3L和3M）。例如，心肌纤维结构得到改善；肝脏中观察到的空泡化减少，更多肝细胞表现出正常形状的细胞核；肠道中黏膜皱襞的形态和杯状细胞的数量显著恢复。我们还进行了铁补充救援实验，发现与未治疗的bmp10−/−相比，治疗后的鱼存活率提高，心脏肥大减轻（图S7）。因此，铁干预减轻了心脏肥大，改善了其他器官的病理状况，并降低了bmp10突变体的死亡率。这些结果表明bmp10在心脏铁代谢中具有调节作用，并暗示铁代谢失调促进了bmp10−/−突变体中疾病状况的发生。bmp10缺失通过心脏中的IL6/STAT3途径影响缺氧反应并改变hepcidin（HAMP）表达Hepcidin（HAMP）和铁调素调节蛋白（FPN）是通过HAMP诱导FPN结合、内化和降解来调控各种组织中铁的吸收、再利用、储存和排泄的关键因子。心肌细胞中的铁水平主要由自分泌HAMP/FPN轴控制。在bmp10−/−_ns斑马鱼心脏中，hamp表达降低而FPN表达增加，表明铁排泄过多，导致铁缺乏（图4A、4B、S3B）。然而，在bmp10−/−_ss心脏中，hamp表达急剧增加，而FPN减少，表明铁外流减少并发生铁积聚（图4A和4B）。已知低hepcidin会导致促炎状态，而包括铁死亡在内的调节性坏死则具有极强的促炎和免疫原性。![]()
图4 bmp10的缺失导致斑马鱼心脏缺氧和炎症反应升高以及铁稳态失调bmp10−/−的血液生化分析显示，bmp10−/−_ss突变体存在慢性炎症性贫血，这表现为总铁结合力（TIBC）降低（图4C）。此外，如转录组比较所示，bmp10−/−_ss突变体的差异表达基因（DEGs）富含炎症途径，如“Toll样受体信号通路”、“肠道免疫网络IgA产生”和“胞质DNA感应途径”（图S2A）。此外，铁死亡和炎症是紧密相关的过程。ptgs2a编码环氧化酶-2（COX-2），这是一种不仅参与铁死亡还参与炎症的关键酶。铁死亡期间ptgs2a的上调既反映了铁死亡的特征性脂质过氧化，也与这种类型的细胞死亡相关的促炎信号有关。在差异表达基因中，炎症因子白细胞介素6（IL6）是在炎症期间诱导hepcidin产生所必需且充分的细胞因子，并负责炎症期间的低铁血症。Western blot证实了bmp10−/−_ns和bmp10−/−_ss斑马鱼心脏中IL6蛋白的持续增加（图4D），表明炎症状况逐渐加重。已知hamp的表达受到多种因素的复杂调控，包括铁水平、红细胞生成、炎症和缺氧。缺氧通过HIF1α抑制hamp表达，而炎症途径IL6/p-STAT3则促进hamp转录。为了揭示导致bmp10−/−突变体心脏中hamp和铁代谢失调的因素，我们分析了与这些信号通路相关的几种转录因子的表达谱。发现与铁死亡相关的转录因子hif1ab、hif1al和stat3在bmp10−/−斑马鱼心脏中上调（图4E）。Western blot也验证了HIF1α表达的上调（图4F）。bmp10−/−_ns和bmp10−/−_ss突变体心脏中Nagar-olsen（NOS）染色揭示的显著程度的缺氧损伤进一步证实了心脏缺氧的存在（图4G）。同样，在bmp10−/−_ss心脏中观察到IL6/p-STAT3途径高度上调，表现为pSTAT3水平显著升高（图4H）。然而，在bmp10−/−_ns心脏中，pSTAT3水平仅适度增加，这与其诱导剂IL6在bmp10−/−_ns和bmp10−/−_ss中的逐步上调相一致。在疾病早期阶段，bmp10−/−心脏中升高的HIF1α水平似乎抑制了hamp表达（图4A）；随着疾病进展到后期阶段，bmp10−/−_ss心脏中炎症反应途径占据主导地位，导致hamp表达急剧诱导（图4A）。这种转变可能由增强的HIF1α水平和伴随的缺氧细胞损伤触发，这两者都是IL6的已知强效诱导剂。这些过程逐步改变hamp表达，最终导致铁代谢失调并触发铁死亡。为了在哺乳动物心肌细胞系中进一步确认BMP10对铁稳态的自主调节，我们在大鼠心肌细胞系H9C2中敲低了BMP10（图5A）。利用H9C2细胞研究BMP10的敲低，发现这导致铁蛋白表达升高，与细胞中测得的铁含量增加相一致（图5B–5D）。同时，在BMP10敲低的H9C2细胞中，HIF1α和IL6的蛋白水平均显著增加（图5E–5G）。BMP10敲低的心肌细胞显示出HAMP（hepcidin，铁调素）表达大幅上调（图5H）。因此，FPN（ferroportin，铁输出蛋白）下调并伴随过度的脂质过氧化（图5I–5K），这表明在大鼠心肌细胞中存在与bmp10突变体斑马鱼心脏中相同的BMP10诱导的铁调节信号级联。![]()
图5 bmp10敲低导致H9C2细胞铁过载和脂质过氧化综上所述，我们的研究描绘了bmp10在调节心脏铁平衡中涉及的信号通路，如图6所示。这项研究揭示了bmp10先前未被认识的角色，即作为心脏铁平衡的关键调节因子，从而扩展了我们对维持心脏铁稳态微妙平衡的复杂分子相互作用网络的理解，这种网络可能在脊椎动物中高度保守。![]()
图6 斑马鱼bmp10缺失介导的心脏铁代谢紊乱的示意图本研究揭示了BMP10-Hepcidin（铁调素）-铁轴在维持心脏铁稳态和出生后心脏功能中的重要作用。这些发现包括：（1）bmp10缺乏导致铁缺乏和贫血逐渐加重；（2）铁缺乏性贫血导致缺氧，进而在bmp10−/−突变体心脏中引发继发性铁死亡和炎症；（3）BMP10-Hepcidin轴似乎通过HIF/Hepcidin和IL6/STAT3/Hepcidin途径介导，BMP10缺失后这两条途径的过度激活促进了心脏肥大和心力衰竭。这些发现为心脏铁稳态和心血管疾病的机制提供了另一种见解。心力衰竭（HF）影响着大约1%–2%的成年人群，使其成为现代的一种流行病。在临床上，肥厚最初是对生理和病理刺激的一种适应性反应，但病理性肥厚通常会发展为心力衰竭。铁代谢紊乱是导致心脏肥厚的关键因素之一，并且与炎症因子IL6直接相关，IL6在体内和体外均能直接诱导肥厚。过量的活性氧（ROS）可激活参与肥厚性生长和心脏重塑的各种信号通路。研究结果表明，KEGG富集分析反映了bmp10−/−_ns心脏中铁死亡早期的分子触发因素，而bmp10−/−_ss心脏中强烈的铁死亡表型则与铁过载和ROS产生直接相关。本研究强调了BMP10在调节心脏中铁代谢、缺氧、炎症和ROS产生中的关键作用，并指出维持BMP10-铁轴稳态对出生后心血管健康至关重要。心肌细胞的铁水平是通过心脏HAMP/FPN轴实现的局部稳态与由全身HAMP/FPN轴控制的全身铁稳态之间的平衡。尽管调节肽铁调素主要在肝脏中合成并在全身循环，但它也可在其他组织（包括心脏、肾脏、脾脏和肺泡巨噬细胞）中产生。值得注意的是，心脏中铁调素的表达水平位居第二。在我们的研究中，BMP10缺乏破坏了全身和局部的HAMP/FPN轴，最初导致心脏铁缺乏，随后发展为铁过载并伴有严重炎症。BMP10突变体斑马鱼心脏铁状况早期和晚期之间的转换被证明是由缺氧和炎症途径之间的相互作用触发的，许多研究已将这两者联系起来。在bmp10−/−突变体贫血状况的早期阶段，心脏中HAMP表达降低而FPN升高，这与先前的研究不一致，在该研究中，贫血状况导致铁储存增加且心肌细胞中FPN降低。然而，随着bmp10−/−_ss突变体中炎症途径急剧上调（图4H），贫血状况恶化，心脏细胞损伤加重（图2H、2I、4G），心脏HAMP表达被急剧诱导，同时FPN降低，心脏铁积聚。bmp10−/−突变体疾病后期HAMP/FPN的表达模式与之前的研究结果一致。疾病早期HAMP/FPN/铁调节的差异可能源于这两种情况下bmp10的存在与否，或斑马鱼与哺乳动物之间的遗传差异。然而，突变体疾病后期与另外两项研究的一致性表明，斑马鱼和啮齿类动物之间心脏HAMP/FPN调节的总体保守性。本研究表明，bmp10缺失引起的贫血和缺氧与下游hamp表达和铁稳态失调相关，但是否存在直接调节途径仍需进一步的机制研究，如组织特异性敲低和拯救实验，以更准确地确定bmp10及其下游效应的作用。缺铁性贫血通过降低肌肉运动能力和限制心肌细胞内氧化磷酸化的氧气供应来影响心脏。总体而言，近一半的慢性心力衰竭（HF）患者表现出可利用铁水平降低，补铁已显示出在降低HF风险方面的潜力，且被证明既安全又有效。目前，针对HAMP/FPN轴作为治疗慢性HF中铁过载和铁缺乏的治疗方法引起了极大的兴趣。我们的研究表明，在适当阶段进行铁螯合和补充，以及干预HIF/HAMP和IL6/HAMP途径等策略，可能作为有效手段来减轻由BMP10缺乏引起的心力衰竭。此外，在大多数突变鱼中，bmp10−/−突变体经历了从无病理症状到严重病理症状的贫血和炎症性贫血过程。心脏疾病的渐进性表明，炎症对bmp10−/−突变体的全身铁紊乱和存活有重要影响。一旦炎症被触发，它将引发一系列下游反应，如hamp上调、铁死亡和心脏肥大。如果未发生炎症，bmp10−/−突变体将不会表现出严重病理症状，如bmp10−/−_ns所示。因此，控制炎症的发生也是治疗心力衰竭的一种有前景的方法。BMP10是转化生长因子β（TGF-β）家族的一员，作为ALK1的配体发挥作用。值得注意的是，ALK1的突变会导致遗传性出血性毛细血管扩张症（HHT）这种遗传性疾病中的动静脉畸形。与该疾病相关的血管短路、出血和贫血可能导致高输出量心力衰竭。先前的研究报道了斑马鱼bmp10突变体中的血管畸形，以及血管畸形/出血与心脏肥大之间的相关性，这些心脏肥大伴随着心室组织完整性受损和高输出量心力衰竭。我们的研究也指出了相同的表型；然而，它还揭示了BMP10除了血管畸形之外的另一层调节作用，即维持红细胞生成和心肌细胞中的铁稳态。谱系追踪研究表明，血液和内皮均起源于腹侧中胚层，其诱导和模式形成受到TGF-β家族（特别是活化素/淋巴节点和Bmp）的影响。ENG、ACVRL1和SMAD4是TGF-β信号通路的重要组成部分，对血管完整性和血管生成重塑至关重要。内皮细胞可以起源于人原始生殖细胞（hPSC）衍生的心血管中胚层，其中BMP10在人内皮细胞的特化和维持中发挥着关键作用。我们的研究创新性地确定了异常铁代谢是BMP10缺失导致贫血的诱因。通过调节铁代谢，可以减轻由bmp10缺乏引起的贫血和心脏肥大症状。这些发现强调了bmp10在血管发育、红细胞生成和成年心脏中铁稳态调节中的关键且相互关联的作用。本文所呈现的数据表明，BMP10在胚胎发育过程中具有造血功能。这一功能的机制尚待进一步研究。然而，如图3所示，在这一阶段对bmp10−/−胚胎的铁池进行干预，部分挽救了红细胞的产生，这表明BMP10作为一种强大的铁调节剂发挥作用。同时，胚胎阶段的结果表明，bmp10 mRNA和FAC（铁载体）注射对bmp10−/−胚胎有益，这为bmp10突变体中的贫血与心脏缺陷之间的关联提供了证据。我们并没有排除红细胞减少可能影响心脏肥大发展的可能性，因为所有bmp10−/−突变体中HIF1α的表达均有所升高。然而，HIF1α的升高本身并不足以导致肥大，而是HIF1α与p-STAT3复合物共同引起的铁调素（hepcidin）表达变化才导致了肥大。我们推测，BMP10在铁调节中的作用可能是其在心脏和造血组织中发挥的主要功能之一，如图3所示，其中通过铁干预可以部分挽救心脏肥大。在正常情况下，心脏产生的铁调素可能以旁分泌的方式发挥作用，形成心脏自主调节铁稳态的机制。在大鼠中，我们敲低了大鼠心肌细胞系H9C2中的bmp10，结果表明BMP10在心脏自主调节铁代谢中发挥作用。有趣的是，BMP10似乎比其他调节铁的BMP（骨形态发生蛋白）具有更系统的功能，这体现在bmp10敲除斑马鱼中一致的血清铁剥夺和严重贫血。这种差异可能源于各个BMP的组织特异性和BMP10的循环性质。BMP10主要由心脏产生，并通过血液运输到其他器官，而BMP2和BMP6主要由肝脏窦状隙内皮细胞产生，并作为旁分泌因子诱导铁调素基因表达。与BMP2和BMP6突变体相比，bmp10敲除突变体在非严重形态症状阶段表现出肝脏铁调素表达的显著增加，但在严重形态症状阶段则显著降低（图S8）。这种肝脏铁调素相反调节的潜在机制，以及BMP10如何调节哺乳动物心血管系统中的铁平衡，是有趣且值得进一步研究的话题。尽管如此，在大鼠心肌细胞系H9C2中敲低BMP10所获得的结果表明，BMP10在心脏自主调节铁代谢中发挥作用。一些研究表明，BMP10在心脏修复过程中促进心肌细胞的增殖，再次表明BMP10对心肌细胞具有调节作用。在本研究中，我们注意到一小部分（约18%）bmp10−/−突变体在心脏肥大发展方面显著较慢，且在12周前无明显形态异常（图1B）。有趣的是，这些突变体还表现出炎症发生延迟的现象。炎症的触发因素是多方面的；在肺动脉高压（PAH）患者中，常在重建血管周围观察到炎症改变，且循环细胞因子如IL-6水平升高。其他重要的介质包括生长因子，如转化生长因子（TGF-β）。最近的研究还强调了表观遗传机制的参与，这可能是bmp10突变体中疾病发作时间高度可变的原因之一。在斑马鱼中，bmp10主要在心内膜表达，而其同源旁系基因bmp10-like在心肌中表达，这与只有一个bmp10基因的哺乳动物不同。然而，qRT-PCR分析显示，在bmp10突变体中，bmp9和bmp10-like没有转录补偿（图S9）。本研究未明确其他BMPs潜在的相互补偿作用是否参与bmp10突变体的疾病进展，这是一个值得进一步探索的有趣话题。斑马鱼饲养
本研究使用的斑马鱼（Danio rerio，AB品系）在标准化的水族系统中按标准条件饲养，该系统提供持续水流和生物过滤，保持恒定温度28.5°C，以及14小时光照和10小时黑暗的循环。研究中使用的发育中的胚胎在培养皿中维持3天，然后转移到标准水族箱中饲养。对于需要分析成年表型的实验，我们以每2.5升水族箱饲养15条鱼的密度饲养斑马鱼。所有鱼类处理均按照上海海洋大学动物实验伦理委员会（IACUC）制定的科学目的动物饲养和使用指南进行，并遵循协议（SHOU-DW-2021-061）。本研究利用CRISPR-Cas9系统从斑马鱼基因组中敲除了bmp10位点。CRISPR-Cas9靶位点是通过在线工具ZiFiT Targeter软件（http://zifit.partners.org/ZiFiT）设计的。gRNA的合成遵循了MAXIscript T7试剂盒（Ambion）制造商的协议。向每个胚胎中注射约800皮克（pg）的Cas9蛋白（GenScript）和100皮克的gRNA。将显微注射后的胚胎在恒定温度28.5°C下饲养和维持。具体的引物列在表S1中。为了检测bmp10-KO斑马鱼的基因型，我们使用TIANamp基因组DNA试剂盒（天根）从尾部提取基因组DNA。DNA样本经PCR扩增，扩增所用的引物混合物包含两个正向引物（一个位于缺失位点之前，另一个位于bmp10缺失位点内）和一个位于缺失位点之后的反向引物。PCR反应在98°C进行10秒、54°C进行30秒、72°C进行18秒的条件下循环34次。然后，使用2%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物并进行分析（图S1B）。用于筛选突变体的PCR引物序列列在表S1中。我们从三对杂合亲本的子代中取心脏样本作为三个生物学重复，每个重复由相同基因型的五个心脏混合而成。按照制造商的协议（Invitrogen），使用TRIzol试剂从斑马鱼心脏中分离出总RNA。使用Qubit荧光计（Life Technologies）测定总RNA的浓度。每个样本取1微克RNA，按照制造商的说明使用TruSeq RNA Sample Prep Kit（Illumina）制备mRNA-Seq文库。然后使用Illumina HiSeq 2500系统对样本进行测序。我们使用Trimmomatic（版本0.33，参数设置为AVGQUAL:20 TRAILING:20 MINLEN:50）对RNA-seq读数进行修剪。然后，使用HISAT2比对器（版本2.0.4）将每个样本的清洁Illumina配对末端读数映射到注释的斑马鱼基因组（GRCz11）。使用Cufflinks对每个基因的读数进行计数，并将其转换为FPKM。我们使用R中开发的edgeR包来确定基因型之间差异表达的基因（DEGs）。使用ClusterProfiler包（截止值，P值<0.05）对DEGs进行GO富集和KEGG富集分析。我们用log2Foldchange（FC）>1或<−1表示DEGs，其中FC是三个生物学重复的平均值。根据有效抗体的商业可用性，通过Western blot或定量实时PCR验证了与铁死亡和心脏肥大相关的重要DEGs。我们使用GraphPad Prism 7（美国加利福尼亚州圣地亚哥）生成热图和条形图。使用玻璃毛细管针采集血液样本，并立即转移到无抗凝剂的PCR管中。为了获得足够的样本量，将十条斑马鱼的血液混合。血液凝固后，将试管以3000转/分钟的速度离心10分钟以提取血清。分别使用血清铁测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）和微量血清总铁结合力测定试剂盒（Solarbio）评估血清铁水平和血清总铁结合力（TIBC）。将成年斑马鱼的心脏解剖出来，并在4°C下用4%多聚甲醛固定液中固定24小时。随后，将固定后的样本嵌入石蜡中，并连续切片，切片厚度为5微米。经过脱蜡和复水后，使用苏木精-伊红（H&E）（Beyotime）和Nagar-olsen（NOS）（TIANDZ）染色法对切片进行常规组织学检查。使用共聚焦显微镜（Zeiss）拍摄图像。使用一步式末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）凋亡检测试剂盒（Beyotime）评估DNA断裂情况。切片经过脱蜡和复水后，在室温下用20 μg/mL的无DNase蛋白酶K处理30分钟。用PBS洗涤后，向组织切片中加入50 µl的TUNEL反应混合物，然后在37°C下避光孵育1小时。用PBS冲洗切片三次，并在观察前用抗荧光淬灭剂封片（Zeiss）。组织铁含量测定：心脏、肝脏和肠道的总元素铁含量采用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）进行测定，方法如文献所述。使用配备有Agilent ASX 520自动进样器的Agilent 7700x ICP-MS来测量元素。细胞铁含量测定：细胞铁含量根据说明书（Solarbio生命科学）进行检测。简而言之，细胞用提取溶液在冰浴中超声破碎，然后在4℃下以8000g离心10分钟，取上清液进行测量。从多对杂合子bmp10+/−亲本产生的同窝胚胎被随机分配到两个装有系统水（每个水箱40条）的2升静态水箱中。在4周龄鱼苗（wpf）时，分别向实验水箱中加入0.05mmol/L的去铁胺（DFO）和0.05mmol/L的柠檬酸铁铵（FAC）。同时，对照组鱼类在相同条件下饲养，但不添加试剂。在干预期间（从4周龄鱼苗到13周龄鱼苗），我们每天换水以保持DFO和FAC的稳定浓度。在6周龄鱼苗时进行基因分型，并统计每种基因型的数量。然后，将不同基因型的个体合并到不同的水箱中，并继续进行治疗或未治疗。每天记录死亡率和形态缺陷的出现情况，包括鳞片凸起和脱落、严重腹水以及皮肤出血，并使用死亡率绘制生存曲线。在13周龄鱼苗时，采集心脏、肝脏和肠道样本用于后续实验，包括组织化学染色、铁含量测定、蛋白质提取进行蛋白质印迹分析以及基因表达谱分析。拯救实验进行了三个生物学重复。大鼠胚胎心脏来源的H9C2细胞系培养在含有10%（v/v）胎牛血清（FBS，Gibco）和1%青霉素/链霉素组合的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中，置于37°C、湿度为5% CO2的恒温培养箱中。H9C2细胞接种于6孔板中，在37°C下孵育24小时。根据制造商的说明，使用lipo3000（Invitrogen）进行siRNA转染。siRNA由公司（GenePharma）合成。使用序列为5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'和5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'的阴性对照siRNA（NC-siRNA）作为对照。bmp10-120-siRNA的正义链和反义链序列分别为5'-CUGGAGCUCUACAACAAAUTT-3'和5'-AUUUGUUGUAGAGCUCCAGTT-3'。bmp10-659-siRNA的正义链和反义链序列分别为5'-GCAGAAAGAAGAGCUGAAUTT-3'和5'-AUUCAGCUCUUCUUUCUGCTT-3'。bmp10-1141-siRNA的正义链和反义链序列分别为5'-GCGUCCCAUAGCUUAUUUATT-3'和5'-UAAAUAAGCUAUGGGACGCTT-3'。继续孵育48小时后，收集H9C2细胞，并通过RT-qPCR和Western blot评估BMP10沉默的效率。对于每组H9C2中的贴壁细胞，首先用1×PBS洗涤，然后在4%多聚甲醛中固定20分钟，之后用0.2% Triton X-100进行通透化处理。用PBS洗涤后，用2% BSA封闭细胞30分钟。接着，将细胞与一抗抗铁调素抗体（HUABIO，1:200稀释）在37°C下孵育2小时。最后，用PBS洗涤细胞三次（每次5分钟），并用相应的高度交叉吸附的二抗（Life Technologies，1:500稀释）进行染色。通过用DAPI染色细胞来可视化细胞核。然后，使用荧光显微镜观察并分析荧光图像。使用ImageJ软件获取染色的平均强度。血红蛋白检测采用之前描述的邻联茴香胺染色法。首先，将活胚胎去壳，然后置于邻联茴香胺染色溶液（含0.6 mg/mL邻联茴香胺、166 μL 3M醋酸铵、20 mL无水乙醇、30 mL ddH2O）中，在暗处染色15分钟。随后，用PBS洗涤胚胎两次，并在体视显微镜（ZEISS）下拍照。根据之前的报告，将经邻联茴香胺染色后野生型（WT）胚胎中观察到的血红蛋白染色定义为正色素，而低色素则表现为血红蛋白染色较浅。然后，根据邻联茴香胺染色的强度对胚胎进行排序，并按照上述方法进行基因型鉴定。将全长bmp10 cDNA亚克隆到pCS2+载体中，并使用SP6 mMessage mMachine（Ambion）合成带有多聚腺苷酸尾（polyA）的mRNA。将约200 pg编码BMP10的合成mRNA注射到由bmp10+/−亲本产生的1细胞期胚胎中。在48小时受精后（hpf），收集胚胎，用邻联茴香胺染色，并进行基因型鉴定。使用柠檬酸铁铵（FAC）进行铁补充。斑马鱼胚胎的显微注射操作如之前所述。将FAC稀释至0.05 mmol/L的浓度，并向每个胚胎注射总体积为1 nL的FAC溶液。显微注射使用的胚胎来自bmp10+/−杂合亲本。在48 hpf时，收集胚胎进行邻联茴香胺染色和基因型鉴定。使用TRIzol试剂（Ambion, 279506）从五个合并的心脏样本中提取总RNA。使用Qubit荧光计（Life Technologies）测定RNA的浓度和纯度。随后，使用PrimeScript RT试剂盒（TaKaRa）对每个样本的1 μg总RNA进行逆转录。定量实时荧光PCR使用SYBR Green I（Roche）进行。数据分析采用标准的2-ΔΔCt方法。引物序列见表S2。用于Western blot的蛋白质是从五个合并的心脏样本中使用RIPA裂解缓冲液（SIGMA）提取的，并使用二喹啉甲酸（BCA）蛋白质测定试剂盒（Thermo）测定蛋白质浓度。简而言之，每个样本中等量的蛋白质（20 μg）通过SDS-PAGE分离，然后电转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Immobilon）上。随后，将膜与指定的一抗和二抗孵育。本研究中使用的一抗包括抗铁蛋白（HUABIO, ET1610-78, 1:1000）、抗白细胞介素6（IL-6）（HUABIO, EM1701-45, 1:1000）、抗磷酸化信号转导子和转录激活子3（p-STAT3，Y705位点）（HUABIO, ET1603-40, 1:1000）、抗STAT3（HUABIO, ET1607-38, 1:1000）、抗微管相关蛋白1轻链3（LC3）（Cell Signaling, 4108S, 1:1000）、抗低氧诱导因子1α（HIF1α）（BOSTER, PB9253, 1:1000）、抗铁转出蛋白（FPN）（HUABIO, ER1916-80, 1:1000）、抗谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）（HUABIO, ET1706-45, 1:1000）、抗铁调素（Hamp）（HUABIO, ET1704-22, 1:100），以β-肌动蛋白（HUABIO, ET1701-80, 1:2500）作为上样对照。使用增强化学发光（ECL）检测试剂（Thermo）可视化得到的免疫反应性条带。使用ImageJ量化蛋白质条带，并将数据归一化为β-肌动蛋白的表达水平。心脏丙二醛（MDA）水平使用试剂盒（Beyotime，货号S0131）按照制造商的说明进行测量。细胞内脂质ROS水平使用BODIPY-C11染料（Invitrogen）进行测定。首先，按照之前描述的方法将每组斑马鱼的心脏消化成细胞悬液。将细胞与1 mL含有5 μM BODIPY-C11染料的培养基孵育30分钟。然后收集细胞，用PBS洗涤三次，并重悬于500 μL PBS中，用于使用流式细胞仪（BD Accuri C6）进行分析，并通过荧光显微镜拍照。BODIPY染色的心肌细胞的荧光几何平均值被作为细胞内ROS水平。所有实验均至少重复三次。使用GraphPad Prism 7软件（美国加利福尼亚州圣地亚哥）绘制条形图，并计算代表标准差（SD）的误差条。统计分析采用Student’s t检验或双向方差分析（ANOVA）结合Tukey事后检验。所有值均以均值±SD表示，P<0.05被认为具有统计学显著意义。*、**、***分别表示P<0.05、P<0.01和P<0.001的显著性水平。本研究中生成的RNA-seq数据已存储在中国国家生物信息中心Big Sub数据库中，登录号为PRJCA029992。原文地址：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1673852724002637?via%3Dihub注：因文章篇幅有限，所有相关引用文献，以及补充素材可以点击至原文查阅。
苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过六年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。
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