【文献解读】全氟辛酸（PFOA）通过激活Keap1/Nrf2通路在斑马鱼胚胎中诱导心脏毒性
文摘
科学
2024-10-09 17:00
江苏
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文献：Liu X, Chen R, Peng Y, Zhou Y, Xia M, Wu X, Wang Y, Yin W, Han Y, Yu M. Perfluorooctanoic acid (PFOA) induces cardiotoxicity by activating the Keap1/Nrf2 pathway in zebrafish (Danio rerio) embryos. Ecotoxicol Environ Saf. 2024 Oct 3;285:117098. doi: 10.1016/j.ecoenv.2024.117098. Epub ahead of print. PMID: 39366304.
杂志：ECOTOXICOLOGY AND ENVIRONMENTAL SAFETY
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全氟辛酸（PFOA）作为一种全氟烷基化合物，与先天性心脏病有关，但其潜在机制尚不明确。我们假设PFOA通过抑制Keap1/Nrf2通路诱导心脏缺陷，从而导致心肌细胞的氧化损伤。在本研究中，暴露于PFOA的斑马鱼胚胎出现了显著的心脏畸形和功能障碍，表现为过量的活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）产生，以及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性降低。此外，心脏发育相关关键基因（vmhc、gata4、nkx2.5和sox9b）的表达失调。PFOA还降低了keap1、nrf2和ho-1的表达。在Nrf2过表达后，ROS和MDA水平降低，而SOD、CAT和GSH-Px水平则增加。此外，心肌细胞凋亡和心脏畸形得到缓解。这些发现表明，PFOA通过抑制Keap1/Nrf2通路诱导氧化应激，最终导致心脏缺陷。先天性心脏病（CHD）每千人中影响8-12人，占全球产前死亡的40%。早期妊娠是胚胎心脏发育的关键时期，也是CHD发生的高风险阶段。研究表明，虽然仅有15%的CHD是遗传因素造成的，但约30%与环境因素有关。这一早期阶段尤其容易受到影响，可能干扰胎儿心脏发育。流行病学研究显示，母体在此期间接触药物、病毒、环境污染物等因素显著增加了CHD的风险。全氟和多氟烷基物质（PFAS）是一类氟化物，其特征是至少含有一个不带氢的全氟甲基或亚甲基碳原子。由于其卓越的热稳定性、化学抗性及疏水性和疏油性，PFAS在各类工业和消费领域被广泛应用。尽管如此，PFAS的高生物累积潜力导致其在饮用水、地表水、地下水、食物、生物体及人类组织中普遍存在。监测研究表明，孕期母体血清样本中PFOS的水平最高，其次是PFOA、PFNA和PFDA。研究发现，孕期接触PFAS与CHD发生之间存在显著相关性，并且对心房和导管缺损的风险均有所增加。然而，产前PFAS暴露导致CHD的具体机制尚不清楚。全氟辛酸（PFOA）是使用最广泛的PFAS之一。多项研究指出，PFOA在生物体中的生物累积对健康构成多种风险，包括中度急性毒性、氧化应激和肝毒性。越来越多的证据表明，PFOA能够穿越各种生物屏障，导致心脏发育毒性。实验研究显示，以25 mg/kg的剂量给小鼠施用PFOA会导致显著的心脏病理变化和线粒体功能障碍。此外，在鸡胚胎中也观察到了PFOA引起的发育性心脏毒性。PFOA在暴露于1、2、5、10和20 mg/L浓度下72小时的斑马鱼中增加了细胞色素P450酶的活性，产生了氧化应激和心室水肿。尽管已有这些发现，但关于PFOA对心脏发育及其分子机制的研究仍然较为稀缺。因此，有必要深入探讨PFOA的心脏毒性机制。氧化应激在心脏发育中起着至关重要的作用，它通过维持氧化还原平衡确保正常的心脏形态发生。适量的活性氧（ROS）对细胞功能是必要的，但过量的ROS会损害蛋白质、脂质和DNA，导致心脏发育受损和缺陷。升高的氧化应激与先天性心脏异常、心肌细胞增殖变化及不正常的心脏结构形成相关。抗氧化防御机制，如核因子E2相关因子2（Nrf2）通路的激活，对于减轻心脏发育中的氧化损伤、保护心脏组织免受有害ROS的影响及支持正常心脏形成至关重要。近期研究将Keap1/Nrf2通路与PFOA诱导的毒性及氧化应激联系在一起。例如，接触PFOA（0.01–1 mg/L）的黑斑蛙显著增加了ROS的产生和肝毒性，且通过Nrf2通路进行调控。在另一项研究中，接触PFOA（1–10 μg/L）21天的黑斑蛙显示出氧化应激升高和Nrf2表达显著下降。Alharthy等发现，Nrf2缺失的星形胶质细胞在接触PFOA（400–1000 μM）24小时后，氧化应激、脂质过氧化和凋亡显著增加，相较于野生型细胞。此外，人类HepaRG细胞接触PFOA（10和100 μM）后，Nrf2表达下调，氧化应激增加。这些研究表明，PFOA通过抑制Nrf2通路加重氧化应激，导致组织损伤。然而，目前尚未有研究探讨Nrf2通路在PFOA诱导的心脏毒性中的作用。斑马鱼（Danio rerio）因其透明的胚胎、快速的发展和易于繁殖，被广泛用于毒理学研究，是研究发育毒性的理想模型。在心脏毒理学研究中，斑马鱼相较于小鼠和鸡模型具有优势，因为其心血管发育可观察，并且早期生命阶段对环境压力特别敏感。因此，选择斑马鱼胚胎和幼鱼来研究PFOA诱导的发育毒性及其对基因表达的影响。我们假设Nrf2介导PFOA诱导的氧化应激，导致内源性凋亡和心脏畸形。本研究探讨斑马鱼的胚胎发育、氧化应激、凋亡以及PFOA与Nrf2通路之间的分子相互作用，以揭示PFOA诱导的心脏缺陷的机制。PFOA处理后斑马鱼胚胎的心脏毒性
图1A中，斑马鱼的心包腔在所有处理组中以相同的放大倍数进行观察。在对照组中未见心脏畸形，但在PFOA暴露组中普遍存在心包水肿，高剂量组（1 mg/L）表现尤为显著。图1B显示，与对照组相比，PFOA 1 mg/L组的心包面积增加。72小时后（hpf）和96 hpf时，PFOA 0.1 mg/L和1 mg/L组的心率显著降低，如图1C和D所示。此外，PFOA暴露的0.1 mg/L和1 mg/L组胚胎中，心脏特异性基因vmhc、gata4、sox9b和nkx2.5的mRNA表达水平显著下降（图1E和H）。然而，在较低剂量（0.001 mg/L和0.01 mg/L）下未观察到显著变化。这些结果表明，PFOA可能通过下调关键心脏基因来损害心肌细胞功能，从而导致斑马鱼的心脏毒性。此外，我们还发现PFOA暴露会影响斑马鱼的发育，并与斑马鱼的孵化率和存活率呈负相关（图S1）。![]()
与对照组相比，PFOA 0.1 mg/L和1 mg/L组的暴露导致ROS生成显著增加（图2A）。此外，PFOA 0.1 mg/L和1 mg/L组的暴露还与MDA水平显著增加以及抗氧化酶CAT、SOD和GSH-PX活性降低相关（图2B-D）。为探讨PFOA诱导的氧化应激是否引发凋亡，进行了AO染色实验。PFOA暴露的0.1 mg/L和1 mg/L组显示出明显的颗粒状绿色荧光，表明凋亡的发生（图2F）。此外，PFOA暴露后，凋亡促发基因bax和caspase-3的mRNA表达显著上调（图2G和I）。相反，抗凋亡基因bcl-2的mRNA表达下调，进一步证实了凋亡的发生（图2H）。然而，在较低剂量（0.001 mg/L和0.01 mg/L）下未观察到显著变化。![]()
PFOA诱导的氧化应激和凋亡在斑马鱼胚胎中通过Keap1/Nrf2通路介导为阐明PFOA在斑马鱼胚胎中诱导氧化应激的机制，我们评估了其对Keap1/Nrf2抗氧化通路的影响。分子对接研究显示，PFOA与Nrf2之间存在强结合亲和力，得分为−5.53。PFOA被发现与Nrf2中特定氨基酸残基（包括ARG-483、ARG-415和SER-508）形成氢键（图3A）。在暴露于0.1 mg/L和1 mg/L PFOA的斑马鱼胚胎中，keap1、nrf2和ho1的表达显著下调（图3B-D）。由于在较低剂量（0.001 mg/L和0.01 mg/L）下未观察到显著变化，后续实验集中在0.1 mg/L和1 mg/L PFOA，这些浓度显著影响了相关参数。在nrf2基因过表达后，0.1 mg/L和1 mg/L PFOA暴露组中nrf2和ho1的表达及SOD和GSH-PX水平显著升高（图3G、H、K、L）。此外，1 mg/L组的CAT水平也显著增加（图3J），而0.1 mg/L和1 mg/L组的MDA水平则降低（图3I）。这些结果表明，PFOA通过Keap1/Nrf2通路诱导斑马鱼胚胎中的氧化应激。![]()
图3 Nrf2介导的氧化应激由PFOA在斑马鱼胚胎中诱导Keap1/Nrf2通路介导PFOA诱导的斑马鱼胚胎心脏畸形我们研究了PFOA是否通过Keap1/Nrf2通路诱导斑马鱼胚胎的心脏凋亡。通过AO染色，我们观察到nrf2基因的过表达显著减少了胚胎心包区域的绿色荧光（图4A），表明Nrf2减轻了PFOA诱导的心脏凋亡。在暴露于0.1 mg/L和1 mg/L PFOA的胚胎中，nrf2过表达后bax和caspase-3的mRNA水平显著降低（图4B、D），而在0.1 mg/L暴露组中bcl的mRNA水平则增加（图4C）。这些结果表明，PFOA通过Keap1/Nrf2通路触发斑马鱼胚胎的心脏凋亡。此外，我们还检验了nrf2过表达是否能够缓解PFOA诱导的心脏毒性。在nrf2基因过表达后，斑马鱼胚胎的心包水肿严重程度显著降低（图5A），1 mg/L PFOA暴露组的心包面积也显著减小（图5B）。在72 hpf时，0.1 mg/L和1 mg/L PFOA暴露组的心率显著降低（图5C），而在96 hpf时，1 mg/L组的心率进一步显著降低（图5D）。此外，心脏发育相关基因vmhc、gata4、nkx2.5和sox9b的表达也显著恢复（图5E-H）。这些发现表明，nrf2的过表达可以有效减轻PFOA诱导的心脏毒性和发育缺陷。此外，nrf2的过表达还可以减少PFOA对斑马鱼发育的影响（图S2）。![]()
图4 nrf2过表达对PFOA诱导的斑马鱼胚胎凋亡的影响![]()
图5 nrf2过表达对PFOA诱导的斑马鱼胚胎心脏畸形的影响越来越多的证据表明，全氟和多氟化合物（PFAS）能够穿越各种生物屏障，引发心脏发育毒性。其中，全氟辛酸（PFOA）是使用最频繁且环境分布最广的全氟和多氟化合物之一，因其广泛分布而引起了人们的极大关注。PFOA的特性，如环境持久性、长距离迁移性和生物累积性，导致其具有广泛的环境影响，并对包括心脏在内的多个器官产生多种生物毒性作用。研究已将PFOA诱导的心脏发育缺陷与多种途径联系起来，包括过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）信号通路、Wnt5a/Frizzled2信号通路以及miRNA相互作用。本研究表明，接触PFOA会导致斑马鱼幼鱼胚胎和心脏发育异常，如图1、图2所示。值得注意的是，与对照组相比，我们观察到心包面积显著增加，且呈剂量依赖性，同时心率相应降低。此外，PFOA暴露后，对心脏前体细胞增殖和分化至关重要的关键转录因子，如gata4、vmhc、sox9b和nkx2.5的mRNA表达水平显著降低。这些变化表明斑马鱼胚胎发生了心脏毒性。此外，本研究中的吖啶橙（AO）染色结果显示，不同剂量的PFOA在暴露96小时后诱导了斑马鱼心脏细胞的凋亡。Bax和caspase-3显著上调以及Bcl-2下调进一步证实了这一凋亡反应。综上所述，这些发现表明PFOA不仅损害心脏发育，还诱导斑马鱼胚胎心肌细胞凋亡，从而阐明了其心脏毒性的潜在机制。氧化应激在许多心血管疾病的发病机理中起着至关重要的作用，心脏组织由于其本身超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）等关键酶类抗氧化剂水平较低而特别容易受到损害。Keap1/Nrf2信号通路是氧化应激反应的主要调节器，控制着这些抗氧化酶的表达。该通路的破坏与动脉粥样硬化、心肌缺血、心肌肥厚和心力衰竭等心血管疾病有关。在我们的研究中，斑马鱼胚胎暴露于PFOA显著损害了这一保护性通路。具体而言，PFOA暴露导致活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）水平升高——这是氧化应激的标志——并降低了抗氧化酶CAT、SOD和GSH-PX的活性。此外，我们还观察到Keap1/Nrf2通路中关键基因的下调，包括Keap1、Nrf2和Ho-1 mRNA，这表明PFOA破坏了氧化应激反应，从而加剧了氧化损伤并促进了心脏毒性。然而，本研究中观察到的Keap1下调与一些报道不一致，这些报道指出在氧化应激条件下Keap1表达增加，其中Keap1使Nrf2泛素化并促进其降解，从而提高了Keap1水平。同样，2,2'-偶氮二异丁基脒二盐酸盐（AAPH）诱导的氧化应激使斑马鱼Nrf2表达降低了2.03倍，而使Keap1表达增加了3.47倍。这种差异可能源于Nrf2的调节动态，在正常氧条件下，Nrf2在细胞质中与Keap1结合。在氧化应激条件下，游离的Nrf2转移到细胞核中，激活保护性基因的转录，从而可能减少细胞质中游离的Nrf2并损害细胞的抗氧化反应。为了进一步探索Nrf2在拮抗PFOA诱导的毒性中的作用，我们通过显微注射在斑马鱼胚胎中过表达了nrf2基因。这一干预措施成功恢复了抗氧化防御，表现为ROS和MDA水平降低，以及CAT、SOD和GSH-PX活性增加。此外，Nrf2过表达减轻了心脏毒性的物理表现，减少了心包水肿，并恢复了关键心脏发育基因（如gata4、vmhc、sox9b和nkx2.5）的表达。这些研究结果表明，PFOA是Keap1-Nrf2通路的直接破坏者，从而导致心脏发育异常。尽管PFOA诱导氧化应激的特性已有充分记录，但本研究揭示了其针对Keap1-Nrf2轴的特定作用，为理解PFOA诱导心脏毒性的分子机制提供了新的见解。化学物质
本研究使用了分析纯级的化学试剂。全氟辛酸（PFOA），纯度超过98.0%，购自北京百灵威科技有限公司（中国北京）。二甲基亚砜（DMSO）购自北京索莱宝科技有限公司，并作为溶剂载体使用，最终浓度为0.1%。斑马鱼购自中国斑马鱼资源中心（CZRC），并按照Huang等人概述的协议，在实验前至少两周使其适应实验室条件。斑马鱼饲养在充气的去氯自来水中，pH值为7.0–8.0，温度为26 ± 1°C，溶解氧含量至少为80%。光照条件为每天14小时的光照周期。成年斑马鱼每天喂食三次活卤虫，日常维护工作包括通过虹吸法每天清除多余的食物和粪便。为确保繁殖成功，将性成熟的雌鱼和雄鱼按2:1的比例配对。次日，收集鱼卵，进行漂白处理，并去除未受精卵。实验中仅使用达到囊胚期的胚胎。本研究中使用的浓度是基于现有文献和环境相关性选择的。根据Liu等人的研究，全氟辛酸（PFOA）对斑马鱼胚胎的96小时半数致死浓度（LC50）为2 mg/L。此外，中国京津冀经济区河流中PFOA的最高浓度据报道为4960.5 ng/L。因此，我们选择了四个暴露剂量：1/2 LC50（1 mg/L）、1/20 LC50（0.1 mg/L）、1/200 LC50（0.01 mg/L）和1/2000 LC50（0.001 mg/L）。在暴露实验中，斑马鱼胚胎在最终浓度为0.001 mg/L、0.01 mg/L、0.1 mg/L和1 mg/L的PFOA溶液中处理。为了制备暴露溶液，首先将PFOA溶解在100%二甲基亚砜（DMSO）中，储备浓度为100 mg/L和1000 mg/L，然后用胚胎培养基（5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4，pH 7.4）进一步稀释至最终工作浓度，DMSO含量为0.1%。将胚胎洗涤后随机分配到玻璃培养皿中，每个培养皿含有80个胚胎。将培养皿置于设定为28 ± 0.5°C的孵化器中，光暗周期为14小时光照/10小时黑暗。每24小时更换一次暴露溶液，并持续监测胚胎的发育情况。每天移除死亡的胚胎，直至受精后96小时（hpf）。使用Trizol试剂（中国南京卡洛登）从斑马鱼幼体（每组40条）中提取总RNA。使用NanoDrop 2000分光光度计（NanoDrop Technologies，美国特拉华州威尔明顿）测定RNA的浓度和纯度，目标OD260:OD280比值约为2.0。使用NovoScript® Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix（gDNA Purge）合成cDNA。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参基因。使用wiCFX Connect™实时系统（Bio-Rad，美国加州赫拉克勒斯）进行逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）。采用先前发表的方法（Liu et al., 2023）相对于内参基因量化基因表达。目标基因的引物序列如下：使用购自中国南京建成生物工程研究所的丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒评估抗氧化酶活性。使用BCA蛋白检测试剂盒（中国碧云天生物技术有限公司）测定斑马鱼胚胎中的蛋白浓度。根据试剂盒提供的方案量化MDA、SOD、CAT和GSH-Px的活性。在96小时受精后（hpf），使用体视显微镜观察并拍摄每个暴露浓度下的胚胎。使用ImageJ软件（版本1.49，美国国立卫生研究院）进行图像分析。每个时间点每个浓度下至少评估15个胚胎。记录的参数包括：（1）孵化率：在暴露后72小时评估，以确定成功孵化的胚胎百分比；（2）幼鱼死亡率：用于确定斑马鱼幼鱼的存活率；（3）心脏表型：评估心脏结构或功能是否存在任何可见的异常或变化；（4）心率：在96小时受精后使用体视显微镜测量，定义为每分钟的心跳次数。为了检测斑马鱼幼鱼心脏中的凋亡信号，进行了吖啶橙（AO）染色。在暴露96小时后，从每个浓度组（包括对照组）中选取20条幼鱼。将这些幼鱼麻醉后，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，每次5分钟。制备浓度为5 mg/L的吖啶橙溶液。将发育至96小时受精后（hpf）的幼鱼浸入吖啶橙溶液中，在28°C暗处染色30分钟。染色后，用PBS洗涤幼鱼3次，然后转移至培养板中进行进一步检查。使用3%甲基纤维素溶液将麻醉后的幼鱼固定在载玻片上，以便在荧光显微镜（OLYMPUS IX73，日本）下评估凋亡情况。对每组20个胚胎进行ROS染色，这些胚胎在72小时受精后（hpf）用PBS洗涤3次。每组胚胎接受20 mM的2',7'-二氢二乙酸荧光素（DCFH-DA）探针溶液处理。将胚胎在28°C暗处孵育30–40分钟。染色后，将胚胎洗涤2–3次，然后置于预先制备的甲基纤维素溶液中。使用体视显微镜在暗处观察ROS染色的胚胎。使用HindIII和XhoI位点将斑马鱼nrf2的编码序列（CDS）克隆到pcDNA3.1(+)载体中。使用带有PrimeSTAR聚合酶的引物pcDNA3.1-F（AGAACCCACTGCTTACTGGC）和pcDNA3.1-R（GGTTCTTTCCGCCTCAGAAG）从质粒中扩增带有T7启动子的nrf2序列。使用通用DNA纯化试剂盒（Takara，中国）对片段进行凝胶纯化。将1微克的纯化模板在37°C下使用E2060s试剂盒（Takara，中国）进行体外转录2小时。加入TURBO DNase（Thermo，美国）去除DNA模板，然后进行加尾（polyA）处理。随后收集mRNA并溶解于水中。使用NanoDrop 2000分光光度计（Thermo，美国）测定合成mRNA的浓度，并用无RNA酶的水稀释至适合显微注射的浓度。选择每胚200纳克的剂量，将mRNA注射到单细胞阶段的胚胎中，用于拯救实验。进行分子对接分析以评估全氟辛酸（PFOA）与Nrf2蛋白的结合情况。从PubChem数据库（Kim等人，2023）中获取PFOA的SDF格式三维分子结构。从RCSB蛋白质数据库（PDB）中获取Nrf2的X射线晶体结构。在蛋白质准备过程中，使用PyMOL去除水分子和杂原子，并将结构保存为.pdb格式。使用Schrödinger（版本13.01）和PyMOL软件进行PFOA与Nrf2之间的对接研究。在Schrödinger中使用网格框（grid box）功能定义Nrf2蛋白上的特定结合口袋，然后通过命令提示符运行对接分析，并使用PyMOL可视化相互作用。统计分析使用SPSS 22.0（IBM Corp.，Armonk，NY，美国）进行。首先验证了数据的正态性和同方差性，并根据需要应用了数据转换（如对数转换、平方根转换或倒数转换）。采用单因素方差分析（ANOVA）来比较对照组和全氟辛酸（PFOA）处理组之间的差异。ANOVA之后，使用Dunnett检验来确定处理组之间的具体差异。此外，还补充了SNK-q检验来进一步区分各组之间的差异。当P值小于0.05时，认为差异具有统计学显著性。原文地址：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0147651324011746?via%3Dihub
注：因文章篇幅有限，所有相关引用文献，以及补充素材可以点击至原文查阅。
苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过六年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。![]()
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