影响因子：14.7
进行性核上性麻痹（Progressive Supranuclear Palsy, PSP）是一种无法治愈的神经退行性疾病，其特征是在中枢神经系统（CNS）的神经元中积累4重复（0N/4R）-Tau蛋白。为了研究PSP的病理生理机制，我们构建了表达人类0N/4R-Tau蛋白的转基因斑马鱼模型。这种Tau斑马鱼模型再现了PSP的多种特征，包括：存活率降低、运动迟缓、视动反应受损、神经退行、神经炎症、突触丧失，以及Tau蛋白的过度磷酸化、错误折叠、错误定位、不溶性、截短和寡聚化。通过自动化实验，我们筛选了147种小分子化合物，寻找能够改善Tau斑马鱼神经系统缺陷的候选药物。结果发现，溴结构域抑制剂(+)JQ1能够改善运动迟缓、存活率、微胶质细胞增生和大脑中的突触消除。通过敲除一个拷贝的brd4基因（brd4+/−突变体），从而减少溴结构域蛋白Brd4的表达，也能同样缓解这些表型。此外，(+)JQ1还减少了Tau斑马鱼和大鼠原代皮层培养中微胶质细胞对突触物质的吞噬作用。我们还观察到，在人类PSP患者的大脑中，微胶质细胞也表达Brd4。我们的研究表明，Brd4在Tau蛋白病中调控微胶质细胞对突触的清除作用，并提供了一种识别PSP机制和潜在治疗靶点的非偏倚方法。
PSP是一种偶发的神经退行性疾病，表现为跌倒、运动迟缓、吞咽困难、眼球运动障碍和痴呆。其发病中位年龄为67岁，中位生存时间为8年，目前尚无有效治疗方法。从病理上看，PSP患者的脑干和基底神经节中的神经元丧失伴随着微胶质细胞的激活，并且在神经元内部形成由不溶性、过度磷酸化的微管相关蛋白Tau聚集体构成的包涵体。在PSP中，Tau蛋白的积累主要涉及包含4个微管结合域重复且缺乏N端插入的同工型（0N/4R-Tau），这与阿尔茨海默病和慢性创伤性脑病不同，后两者同时存在3R和4R-Tau同工型。支持4R-Tau在PSP中具有致病作用的遗传证据包括：MAPT基因（编码Tau蛋白）中错义突变和剪接位点突变导致的临床病理性PSP表型；MAPT基因倒位等位基因表达较少的4R-Tau，具有保护作用；少见的MAPT基因复制病例；以及MAPT基因附近非编码SNP与PSP风险的强关联性。然而，迄今为止，针对Tau蛋白的干预措施在临床试验中未能阻止PSP的进展。造成这一现象的原因尚不明确，其中一个可能性是，临床确诊的PSP患者中，疾病的进展是由4R-Tau积累下游的其他机制驱动的。因此，理解4R-Tau如何破坏CNS功能并导致神经系统缺陷是具有转化潜力的重要目标。
采用无偏探索驱动的方法（如小分子筛选）有助于阐明PSP的分子病理生理学，特别是目前尚不完全了解的4R-Tau在神经系统中的积累后果。此外，许多首创药物都是通过表型筛选发现的，这对PSP患者缺乏治疗选择的现状具有重要意义。无偏小分子筛选需要一个高通量模型，能够复制PSP病理生理的复杂性——这种复杂性包括终末分化神经元的细胞自主和非自主机制，并通过破坏神经回路功能表现出临床终点。鉴于这些因素，筛选应在体内进行，以捕捉相关的致病事件。斑马鱼（Danio rerio）在基因和神经系统方面与人类具有较高的同源性，且在脊椎动物中独具体内化合物库筛选的潜力。值得注意的是，在斑马鱼PSP模型中，筛选可能利用与疾病相关的神经表型的自动化测试作为输出，以便在不受作用机制偏见的情况下识别小分子调节剂。然而，尽管对开发表达人类Tau的转基因斑马鱼用于此目的的兴趣很大，但大多数已发表的斑马鱼品系表达的都是PSP中不存在的突变型Tau蛋白，且当前没有记录显示这些模型表现出适合无偏筛选的自动化输出的PSP样表型。因此，基于斑马鱼Tau病模型的表型驱动小分子筛选尚未被报道。
在本研究中，我们构建了一种过表达0N/4R-Tau的人类转基因斑马鱼模型，并复制了许多PSP的临床、生化和病理特征。重要的是，其中一些表型快速且稳定，足以作为筛选终点。我们筛选了147种针对表观遗传调节蛋白的抑制剂，发现溴结构域抑制剂(+)JQ1能够恢复运动功能，改善存活率，并防止微胶质细胞增生、突触丧失及微胶质细胞对突触物质的吞噬作用。我们还使用CRISPR基因编辑技术生成了编码溴结构域蛋白Brd4的缺失等位基因，发现brd4+/−突变体也能够恢复Tau斑马鱼的运动功能、减少微胶质细胞增生和突触丧失。进一步研究表明，Brd4在人的中枢神经系统微胶质细胞中表达。我们的研究揭示了Brd4在Tau蛋白病中作为微胶质细胞突触消除调节因子的作用，并为通过无偏探索驱动的方法研究PSP病理生理学和治疗提供了工具和方法。
在神经元中条件性表达人类0N/4R-Tau蛋白的转基因斑马鱼生成
为了开发一种针对小分子筛选应用优化的斑马鱼PSP（进行性核上性麻痹）模型，我们采用了Gal4-UAS遗传学方法（图1a，补充图S1）。UAS应答元件编码野生型（WT）人类0N/4R-Tau（在PSP中积累）以及nls-mCherry，以便在后续应用中通过荧光显微镜快速识别转基因斑马鱼。p2A肽确保人类0N/4R-Tau和nls-mCherry作为单独的蛋白质（定位于不同的亚细胞区室；图1b）从相同的mRNA转录本中表达，从而避免荧光融合蛋白可能改变Tau的病理生理特性的风险。通过在没有Gal4诱导表达的情况下生成Tg(UAS:Hsa.MAPT-p2A-nls-mCherry)品系，我们分离出了稳定可遗传的转基因等位基因，这些等位基因可以容易地传播。然后，我们选择了与泛神经元Gal4驱动子杂交时表现出强大反式激活作用的品系，以产生Tg(elavl3:Gal4-VP16); Tg(UAS:Hsa.MAPT-p2A-nls-mCherry)‘Tau’斑马鱼。这种选择策略产生了在整条斑马鱼裂解物中人类MAPT mRNA表达量约为内源性斑马鱼Tau同源物mapta和maptb 12倍的品系（图1c；补充图S2–S5；补充表1和2）。在细胞水平上，这可能是一个高估，因为重复的斑马鱼基因在发育过程中表现出空间限制的CNS表达，与强大的泛神经元elavl3驱动子不同。此外，还生成了Tg(elavl3:Gal4-VP16); Tg(UAS:p2A-nls-mCherry)‘Ctrl’斑马鱼，以提供与Tau斑马鱼具有相同转基因但缺乏人类0N/4R-Tau的对照（图1a；补充表3）。
与Ctrl斑马鱼或非表达同胞（两种对照品系均存活超过2年；图1d、e；补充表4）相比，Tau斑马鱼的寿命（重复组中的中位生存期为8-9天）显著缩短。此外，同时表达人类α-突触核蛋白和mCherry或mCherry和GFP的额外对照斑马鱼并未表现出存活率降低，这排除了异源蛋白过表达的非特异性伪影作为Tau斑马鱼寿命缩短的原因（图1f，补充图S6；补充表5）。三种互补的检测方法——体内吖啶橙排斥失败（图2a、d，补充表6）、组织切片中凋亡细胞的TUNEL标记（图2b、e，补充表7）、以及通过组织切片检测Caspase-3切割（图2c、f，补充表8）和Western blot（补充图S7）——均表明，与Ctrl相比，Tau斑马鱼在受精后2至7天（dpf）期间神经元死亡显著增加（另见补充图S8）。在所有三种检测中，Tau斑马鱼在3-4 dpf时检测到最大细胞死亡，与Ctrl相比，凋亡细胞数量最多高出10倍。到5 dpf时，通过Western blot检测发现，与Ctrl相比，Tau斑马鱼中多巴胺能（酪氨酸羟化酶；TH）和γ-氨基丁酸能（谷氨酸脱羧酶；GAD）神经元标志物，以及突触前（突触素；SYP）和突触后（突触后密度95 kDa；PSD95）标志物的表达均有所下降（图2g，补充表9）。免疫组织化学还显示，与Ctrl相比，Tau斑马鱼在3至6 dpf期间脑内小胶质细胞密度增加了2倍以上（图2h、i，补充表10）。
综合数据表明，转基因斑马鱼中条件性表达人类0N/4R-Tau导致存活率下降、神经退化、神经化学和突触标志物丧失以及神经炎症，这些都是进行性核上性麻痹（PSP）的关键特征。
在3 dpf（受精后3天）的Tau斑马鱼裂解物中，人类0N/4R-Tau在Western blot上的迁移位置为64 kDa（图3a），接近人类PSP大脑中高度磷酸化0N/4R-Tau的电泳迁移率报道值。对Tau斑马鱼裂解物进行去磷酸化处理，使0N/4R-Tau的表观分子量降至52 kDa，并消除了对人类磷酸化Tau特异性抗体的免疫反应，这表明人类Tau在斑马鱼中枢神经系统（CNS）中发生了高度磷酸化（图3b）。与此解释一致的是，Tau（而非Ctrl）斑马鱼裂解物中的64 kDa条带与六种不同的抗体发生免疫反应，这些抗体可检测分布在人类蛋白富含脯氨酸和C端结构域中的磷酸化Tau表位（图3c, d）。在Tau斑马鱼整个CNS的神经元胞体、近端突起和轴突中均检测到了高度磷酸化的人类4R/0N-Tau（图3e, f）。在核周细胞质中观察到了磷酸化Tau的广泛错误定位（图3e插图面板和f）；这被认为是tau病变的早期特征，也是Tau过表达模型中的常见发现，可能反映了磷酸化Tau与微管的解离。Tau斑马鱼中的许多神经元也被检测到了人类tau病变中特异性于错误折叠Tau的表位抗体（Alz50、MC1；图3e, g）所标记。尽管缺乏可用的斑马鱼Tau抗体，无法评估人类Tau种子是否能诱导斑马鱼Tau的错误折叠或聚集，但并未发现人类Tau扩散到未表达转基因的细胞中（补充图S9）。
Western blot分析比较Tau斑马鱼与人PSP中脑裂解物，使用RIPA（含1% Triton, 0.1% SDS）或DIGE（7 M尿素）提取的Tau斑马鱼与人PSP中脑裂解物的Western blot分析显示，多个Tau免疫反应性条带共迁移，进一步证明了该模型与PSP之间的相似性（图4a）。在3至6 dpf之间，RIPA提取的裂解物中总磷酸化全长人类Tau含量稳步下降；然而，在DIGE提取的裂解物中并未观察到减少，这表明斑马鱼脑中0N/4R-Tau的溶解性逐渐丧失（图4a, b）。这些发现通过连续RIPA-DIGE提取得到证实（补充图S10），并且并非由于转基因表达的下降所导致，因为在同一时间点Hsa.MAPT mRNA水平保持稳定（图4c, 补充图S11）。Western blot分析显示，随着Tau斑马鱼年龄的增长，在RIPA可溶性组分中出现了磷酸化人类Tau的截断片段（图4d）。使用特异性识别Caspase-3在D421残基处截断的人类Tau的抗体（TauC3）进行分析，在Tau斑马鱼样品中出现了较弱的条带，其大小提示0N/4R-Tau在D421处的切割（可能伴随其他N端切割事件；图4e）。Tau斑马鱼脑中散在的神经元也显示出该表位在核周细胞质中的免疫反应性（图4f）。非变性/非还原凝胶电泳表明存在高分子量物质，对应于可溶性的截断Tau寡聚体（图4g）。
图3和图4的数据共同表明Tau斑马鱼脑中的人类0N/4R-Tau失去溶解性，并发生高度磷酸化、错误定位、错误折叠、截断和寡聚化，复制了包括PSP在内的人类tau蛋白病的多项特征。然而，在Tau斑马鱼较短的寿命期间，我们并未发现类似于神经原纤维缠结的大型嗜银淀粉样聚集物的证据。这与其他快速进展的tau蛋白病模型相似，与PSP中发现的显著的前缠结病理相一致，并且可能与Caspase切割Tau的免疫反应性细胞相对较少（图4f）有关，这些细胞可能是较大聚集体的前体。
在5 dpf时，使用自动化机器视觉测量96孔板中斑马鱼的运动活性（图5a），结果显示与Ctrl斑马鱼相比，Tau斑马鱼在长时间明亮环境光照下的自发运动中表现出严重的运动减退（图5b；补充表11）。在5 dpf时，斑马鱼的运动是不连续和随机的。平均标量速度（质心位移/时间）是斑马鱼运动能力的综合测量指标，反映了单个运动的速度和持续时间以及它们执行的频率。与Ctrl斑马鱼相比，在多次重复试验中观察到Tau斑马鱼的平均速度显著下降（图5c；补充图S12；补充表12），这归因于：（i）运动之间的时间间隔大幅增加，同时运动事件的持续时间略有减少，导致Tau斑马鱼在测试期间可运动的比例降低（图5d-f）；以及（ii）Tau斑马鱼单个运动的速度略有下降（图5g, h）。这种运动减退表型在多个其他对照组中均未观察到，包括不表达Tau的同胞斑马鱼、仅表达GFP的斑马鱼、共表达mCherry和GFP的斑马鱼或共表达人类α-突触核蛋白和mCherry的斑马鱼，排除了遗传背景变异或异源蛋白过表达的非特异性伪影作为这些运动异常原因的可能性（补充图S13, S14）。接下来，以高时间和空间分辨率分析了由环境光暗突变诱发的“O型弯曲”转向运动的运动学（图5i）。Tau斑马鱼对光照转变的响应率显著低于对照组，且响应潜伏期略有延长（图5j, k）。然而，当发生响应时，Tau斑马鱼和Ctrl斑马鱼的最大躯干曲率和躯干角速度峰值没有差异（图5l, m）。综上所述，这些数据表明Tau斑马鱼表现出严重的运动减退，这并非由神经肌肉麻痹引起，而是由于运动启动事件的频率降低所致，可能与PSP患者中出现的运动不能性运动障碍有相似之处。
鉴于PSP在临床上以显著的眼球运动障碍为特征，我们接下来通过分析视动反射（OKR；图6）来评估Tau斑马鱼的眼球运动。将动画光栅图案投射到充满斑马鱼视野的屏幕上，会引发特征性的缓慢眼球运动周期，这些运动沿着刺激方向进行（以稳定视网膜上的移动图像），随后是向相反方向的快速位置重置运动（扫视）（图6a-c；补充图S15；补充视频1）。与Ctrl斑马鱼相比，Tau斑马鱼表现出眼球运动范围减小、反射增益降低、扫视频率下降，以及两眼运动之间协调破坏（图6b-h；补充图S15）。在超过50%的Tau斑马鱼中观察到OKR期间扫视完全缺失（图6g），这类似于PSP患者中发现的一种特征性临床异常（尽管PSP中垂直眼球运动异常更为突出，但本研究未进行测试）。综上所述，这些数据表明Tau斑马鱼出现了与PSP相似的OKR缺陷。
接下来，我们研究了是否可以使用自动化测量的运动减退作为无偏见和定量的筛选终点，以检测能够挽救Tau斑马鱼神经表型的干预措施。为了这些分析，我们将Tau斑马鱼与不表达Tau的同胞斑马鱼进行比较，以简化后续筛选的繁殖工作，并尽量减少可能影响定量测定性能的遗传背景变异性。这种方法是有效的，因为Ctrl斑马鱼和不表达Tau的Tau斑马鱼同胞在96孔板运动测定中表现出相同的反应（补充图S13）。通过平均对多个交替环境光照和黑暗循环的诱发反应（视觉运动反应；VMR；补充图S16；补充表13），最大限度地减少了测定运动活动的变异性。在这些测定中，VMR光相游泳速度的平均值在Tau斑马鱼及其同胞之间显示出最大且最可重复的差异。然而，使用此指标作为终点对单个斑马鱼进行分析并未提供足够的性能作为筛选测定（图7a）。相反，与我们在药物和毒物诱导的帕金森病模型中的先前发现相似，在每个治疗组中平均多条斑马鱼的反应大大提高了测定性能，但牺牲了通量（图7b）。每组12条Tau斑马鱼的最佳重复大小允许在每个96孔板中并行测试6种化合物和对照，且Z'值始终为正，表明该神经行为测定具有显著的性能水平（图7a, b）。
我们选择了一个包含147种小分子调节剂的库，这些调节剂针对表观遗传学的读取器、写入器和擦除器，在Tau斑马鱼中使用神经终点进行筛选（补充表14）。选择这个库是因为这些化合物针对的是tau病变中相对未被探索的细胞生物学方面，并且库的大小适中，便于解决实施筛选工作流程所面临的实际和后勤挑战。斑马鱼从受精后2天（dpf）至5天暴露于库中的化合物，筛选分为两个阶段进行：（i）在野生型（WT）斑马鱼中，使用生存和形态终点实验性地确定每种化合物的最大耐受浓度（MTC）（图7c；补充图S17）；（ii）然后，在12条Tau斑马鱼中以MTC测试每种化合物，并在5 dpf时将其平均VMR光相游泳速度与同一测定中的12条未处理Tau斑马鱼和12条不表达Tau的同胞斑马鱼的表型窗口进行归一化处理（图7d, d'；补充图S18）。这些对照提供了严格的内置测定质量控制（QC），而对测定内对照的响应进行归一化处理则允许不同测定之间的比较。质量控制基准和数据分析均已实现自动化，以消除偏见并加快工作流程（补充图S19, S20），并且在分析整个库之前，化合物的身份都是保密的。
图7d显示了与未处理的Tau斑马鱼（0%恢复）和不表达Tau的同胞斑马鱼（100%恢复）相比，每种库化合物的平均±标准误差（SE）%表型恢复值（补充表15中提供了数值数据、化学身份和目标）。三种化合物满足了我们事先定义的“有效化合物”标准（平均库恢复值+3个标准差；图7d中的黄色数据点；图7f；补充图S21），而其余化合物的恢复分数则分布在未处理Tau组周围。最有效的化合物是（+）JQ1，在2 µM的浴浓度下将光相游泳速度恢复了75%（图7d, f）。该化合物破坏了乙酰化赖氨酸残基与含溴区和末端区（BET）蛋白的溴区的结合，这些蛋白调节组蛋白乙酰化的转录反应。其他两种有效化合物是Trichostatin-A（抑制多种组蛋白去乙酰化酶，HDACs）和2,4-DPD（抑制低氧诱导因子-1α脯氨酰羟化酶）（图7d, f）。根据药理学靶点对库中的化合物进行聚类分析显示，BET、多HDAC或DNA甲基转移酶抑制剂总体上显著改善了Tau斑马鱼的运动功能（图7e；补充图S22，补充表16, 17）。然而，在每个靶标类别内的化合物之间存在相当大的变异性；例如，并非所有BET溴区抑制剂在该测定中均有效。这可能反映了不同化合物在药代动力学方面的差异，或它们与斑马鱼蛋白质的结合亲和力不同。
在筛选后的验证实验中，重新购买的（+）JQ1、Trichostatin-A和2,4-DPD均显示出在恢复Tau斑马鱼VMR光相运动功能方面的活性，从而确认了这三种有效化合物的身份并验证了筛选结果（补充图S23）。本研究的其余部分重点研究了最有效的化合物（+）JQ1。
（+）JQ1以浓度依赖的方式恢复了Tau斑马鱼的运动迟缓（图8a, b，补充图S24，补充表18）。在相同浓度下，暴露于非活性对映体（−）JQ1并未改善Tau斑马鱼的运动功能（补充图25a），这表明在该测定中需要特定的配体-溴区相互作用才能产生活性。（+）JQ1并未增加Ctrl斑马鱼的游泳速度（补充图S25b），排除了非特异性刺激斑马鱼运动性作为所观察到的恢复现象的解释。（+）JQ1暴露并未沉默Tau斑马鱼中的转基因表达，因为（+）JQ1暴露和未处理的Tau斑马鱼在整个中枢神经系统（CNS）中的mCherry表达量是相似的（补充图S26）。这些关键的对照实验共同表明，（+）JQ1通过调节BET溴区功能来恢复Tau斑马鱼中的神经表型。
（+）JQ1将Tau斑马鱼的中位存活率提高了15–20%，但并未改变Ctrl斑马鱼的存活率（图8c–e；补充表18–20）。（+）JQ1并未降低Tau斑马鱼中0N/4R-Tau的水平或改变Tau的磷酸化（通过电泳迁移率和针对磷酸表位特异性抗体的免疫反应性确定）（图8f），这与该化合物作用于Tau下游机制的概念相符。有趣的是，（+）JQ1并未减少吖啶橙标记的细胞数量（图8g），这表明该模型中的运动迟缓并非由脊髓细胞死亡引起。然而，（+）JQ1（而非（−）JQ1）在5 dpf时显著减少了Tau斑马鱼中枢神经系统中的小胶质细胞数量（图8h；（+）JQ1暴露的Tau斑马鱼中小胶质细胞密度的降低可能会延迟凋亡神经元的吞噬清除，这可能是图8g中AO标记细胞数量略有增加的原因）。Western blot分析显示，（+）JQ1恢复了Tau斑马鱼中突触后标志物PSD95的表达（图8i）。值得注意的是，（+）JQ1并未显著恢复Tau斑马鱼表型中的几个组成部分，包括VMR暗相中运动活动的减少和OKR的破坏（补充图S27）。这些表型可能由该化合物未针对的不同机制介导。
由于（+）JQ1可以防止Tau斑马鱼中的小胶质细胞增生并恢复PSD95的表达，我们接下来研究了（+）JQ1是否通过防止小胶质细胞消除突触来解释其恢复运动功能的作用。最近的研究表明，小胶质细胞对突触的修剪是神经退行性疾病模型中的一个重要机制，并且之前已在PSP的组织病理学研究中证明了突触丢失。通过全脑体积成像结合无偏见的自动化图像分析（图9a；补充图S28），我们发现与Ctrl相比，Tau斑马鱼在视顶盖（图9b）和背侧端脑（图9c）中的PSD-95免疫反应性突触点的密度均降低。这种突触丰度的缺陷通过（+）JQ1的暴露得到了恢复（图9b, c，补充表21）。为了测试这些发现是否可归因于小胶质细胞对突触的消除，我们对全脑斑马鱼进行了小胶质细胞和突触标记物的共标记。在斑马鱼小胶质细胞的细胞质中检测到了PSD95免疫反应性突触点，表明存在对突触材料的吞噬（图9d；补充图S29）。与对照相比，Tau斑马鱼中单个小胶质细胞内PSD95突触点的频率增加，而（+）JQ1的暴露则阻止了这种增加（图9e；补充图S30，补充表21）。这些数据共同表明，（+）JQ1抑制了小胶质细胞对突触的吞噬，这可能是其恢复Tau斑马鱼运动功能和存活的原因之一。
为了确定（+）JQ1介导的小胶质细胞突触清除抑制是否在哺乳动物模型中保守，我们采用了一种成熟的大鼠胚胎皮层原代培养系统，并进行了神经元-星形胶质细胞-小胶质细胞共培养（图9f；补充图S31）。与Tau斑马鱼类似，在大鼠培养的小胶质细胞内检测到了PSD95免疫反应性突触点，表明存在对突触材料的吞噬（补充图S32）。与仅转染膜锚定GFP（mGFP）标记物的对照组相比，共培养中神经元转染表达人源4R/0N-Tau和mGFP标记物后，小胶质细胞内PSD95突触点的数量显著增加（图9g；补充图S33）。重要的是，由神经元0N/4R-Tau表达引起的小胶质细胞内PSD95突触点数量的增加被（+）JQ1的暴露所阻止（图9g；补充图S33，补充表21）。
这些数据共同表明，在斑马鱼和大鼠模型中，神经元0N/4R-Tau的积累通过一种保守的机制促进了小胶质细胞对突触材料的吞噬，而这种机制被（+）JQ1所抑制。
接下来，我们使用反向遗传学来鉴定在斑马鱼Tau模型中介导(+)JQ1活性的分子靶标。先前的工作表明，(+)JQ1以高亲和力结合BET蛋白Brd4，而Brd4在其他情况下已被涉及炎症信号传导。斑马鱼具有与人类Brd4高度保守的单一同源物。靶向斑马鱼brd4 mRNA的剪接或翻译的反义吗啉代寡核苷酸（MO）降低了Brd4的表达，并在3-4天受精后（dpf）的Tau斑马鱼中减轻了小胶质细胞增生（Fig. 10a；补充图S34）。然而，由于细胞分裂后MO的逐渐丢失，导致在2-3 dpf时基因敲低效果恢复。为了测试在表型异常最为突出的后期时间点Brd4在Tau斑马鱼中的作用，我们使用Cas9/CRISPR技术在brd4的第4外显子中设计了一个稳定的11个碱基对的缺失，从而消除了Brd4的表达（等位基因命名为pt435；Fig. 10a, b；补充图S35）。缺乏Brd4的纯合子brd4−/−突变体表现出形态和运动缺陷，并且无法存活（补充图S36, S37）。然而，杂合子brd4+/−斑马鱼未表现出明显的异常，且[Ctrl; brd4+/−]斑马鱼的运动功能与它们的[Ctrl; brd4+/+]同胞相似（Fig. 10d），这使我们能够测试杂合子brd4突变对Tau斑马鱼神经表型的影响。[Tau; brd4+/−]斑马鱼的VMR光周期平均速度显著高于它们的[Tau; brd4+/+]同胞，表明降低Brd4表达部分挽救了Tau斑马鱼的运动减少（Fig. 10c, d；补充图S38，补充表22）。与(+)JQ1暴露类似，降低Brd4表达并未挽救Tau斑马鱼中吖啶橙标记的脊髓细胞（Fig. 10e，补充表22）或视动反应（OKR）缺陷（补充图S39）。然而，在携带brd4突变的Tau斑马鱼中，中枢神经系统小胶质细胞的丰度显著降低（Fig. 10f，补充表22）。脑中小胶质细胞的密度在brd4+/+斑马鱼中最高，在杂合子brd4+/−突变体中降低，在纯合子brd4−/−突变体中最低。这些数据表明，Brd4以表达水平依赖的方式调节tau病变中的小胶质细胞活化、增殖、迁移或存活。与解决小胶质细胞增生问题一同，携带杂合子brd4+/−突变的Tau斑马鱼还表现出在视顶盖和背侧端脑中突触丰度的恢复（Fig. 10g, h；补充图S40，补充表22）。因此，brd4基因的突变足以模拟(+)JQ1在Tau斑马鱼中介导的救援的关键特征，这与(+)JQ1通过在该模型中抑制Brd4来发挥作用是一致的。尽管(+)JQ1的其他结合活性对于解释这些发现并不是必需的，但数据并没有正式排除(+)JQ1与其他蛋白质（如Brd2或Brd3）的溴结构域之间的相互作用对表型救援的贡献。
最后，我们检查了对照组和进行性核上性麻痹（PSP）患者大脑中Brd4的表达情况。先前的工作表明，BRD4 mRNA在整个人脑中均有表达，且在神经元和神经胶质细胞中均有发现，与其他神经胶质细胞类型相比，小胶质细胞中的BRD4 mRNA更为丰富。鉴于我们发现Brd4在Tau转基因斑马鱼的小胶质细胞增生和小胶质细胞突触消除中起着重要作用，我们使用针对Brd4和Iba1（小胶质细胞标志物）的抗体对来自4名对照组和5名PSP病例的人类尸检脑组织切片进行标记，并检查了黑质和苍白球中的表达情况，这两个区域是PSP病理变化最为明显的区域。在对照组大脑中的静止（高度分支状）小胶质细胞和PSP大脑中的活化（回缩过程）小胶质细胞中，均发现了强烈的点状核Brd4免疫反应性（Fig. 10i；补充图S41）。在对照组大脑中检查的1432个小胶质细胞中，有1414个表现出这种核Brd4表达模式，而在PSP大脑中检查的1664个小胶质细胞中，有1648个表现出这种表达模式（Fig. 10j；补充图S42，补充表22）。此外，在许多Iba1−（非小胶质细胞）细胞中也观察到了核标记。尽管先前的研究表明，Brd4在调节基因表达中的关键功能可以在其表达水平不变的情况下发生，但对照组和PSP大脑之间在Brd4标记的强度和模式上并未发现明显差异。这些发现进一步支持了Brd4在小胶质细胞功能中的重要作用，并提示其在PSP等神经退行性疾病中可能扮演的角色。
构建优化用于无偏表型驱动化学生物学筛选的斑马鱼PSP模型是一个重要的进展。通过在没有Gal4表达的情况下生成UAS响应元斑马鱼，我们避免了由于人类4R-Tau表达而导致的幼鱼存活率下降的负向选择。随后，通过选择在全神经元Gal4驱动子下具有强烈转录激活的品系，获得了Hsa.MAPT转基因RNA表达量约为内源性mapta和maptb基因的12倍的斑马鱼品系（蛋白表达的定量仍需等待合适抗体的出现）。在携带与PSP风险相关的MAPT H1单倍型的个体中，总的MAPT mRNA及包含外显子10的4重复（4R）Tau的过表达水平相对适中，仅靠这些表达水平不足以导致PSP，这表明除Tau表达水平外，还有其他因素参与了病理的启动。因此，转基因过表达模型可能无法完全复制人类Tau病的上游事件。然而，这些模型提供了一个适宜的实验系统，可用于研究Tau蛋白积累下游的病理生理机制。例如，PS19小鼠模型表达P301S突变的人类1N/4R-Tau蛋白，其表达水平约为小鼠内源性Tau的5倍，并在数月内表现出与人类Tau病相似的病理和临床异常，该模型已提供了关于疾病发病机制的许多关键见解。同样，Tau斑马鱼在幼鱼阶段表现出与PSP相关的可重复性变化，这一阶段也是筛选和其他分析的最佳时间点。重要的是，Tau斑马鱼具有PSP模型的结构效度，因为其表型是由在PSP中最显著积累的相同WT人类0N/4R-Tau同工型引起的。此外，该模型还具有很强的表面效度，因为它复制了PSP的许多核心临床特征（运动迟缓、眼球运动障碍、存活率下降）、病理特征（神经退行、神经炎症、突触丧失）以及生化特征（Tau过度磷酸化、错误定位、错误折叠、截短、不溶性及寡聚化）。
我们证明了在斑马鱼PSP模型中进行表型筛选能够识别出提供Tau病理生理学见解的小分子。使用与PSP相关的神经功能缺陷作为筛选终点——这得益于模型的强大且快速的表型以及优化的实验流程——能够在体内分析小分子的作用，而不预设它们的作用机制。因此，筛选不会受到靶点参与的神经生物学机制的偏见。Tau病中微胶质细胞对突触的消除是一种细胞非自主机制，需要微胶质细胞和与突触连接的终末分化神经元的共同存在，这一机制可能通过破坏神经回路的生理功能来驱动神经表型的出现。这种复杂性难以在体外系统中复制，而我们意外发现Brd4在该机制中的调控作用，进一步凸显了体内筛选的价值。另一个潜在的偏见与小分子库的组成有关，通常这些库被设计用于靶向一系列特定的分子靶点。我们最初筛选的化合物库选择部分基于表观遗传学在Tau病中相对未被探索的角色，因为我们预计这将增加发现新调节因子的可能性，并提升研究的价值。适中的库规模还使我们能够解决建立筛选实验时涉及的多个实际问题，包括斑马鱼的繁殖、化学暴露、实验流程和数据分析。需要指出的是，由于此次化合物库的选择，我们只针对有限的分子靶点进行了研究。然而，我们的工作验证了斑马鱼模型及其筛选方法，为未来涉及更大、更具多样性的小分子库的研究项目奠定了基础。
微胶质细胞对突触的清除在Tau斑马鱼中对运动功能和存活率有显著影响，表明这一机制在调节该模型中的表型结果方面具有重要作用。最近的研究显示，小鼠阿尔茨海默病模型中的突触丧失涉及补体C1q和C3在突触处的沉积，以及通过C3R受体激活的补体依赖性微胶质细胞吞噬。此外，补体系统也参与了小鼠Tau病模型，其中使用C1q抗体或删除C3aR1受体能够挽救突触丧失，Nptx2（神经元五聚蛋白）通过结合C1q对这一过程起到负调控作用。此前并没有研究表明Brd4在病理性突触清除中有作用，目前尚不清楚Brd4如何调控这一过程。最近一项研究报道，BET抑制剂在培养的肝细胞和人源化小鼠中可以下调基础和细胞因子刺激的补体成分表达，并减少心血管疾病患者循环系统中活化的C3和C5补体水平。然而，Brd4是否在中枢神经系统中调控补体仍然未知，我们的观察结果可能也源于其他或间接机制，例如Brd4在微胶质细胞增殖、迁移、激活或促炎信号中的作用。值得注意的是，Tau斑马鱼为系统性研究这些可能性提供了一个便捷的实验系统，因其补体系统和微胶质细胞转录程序在斑马鱼和哺乳动物之间具有广泛的系统发育保守性，并且通过活体显微镜可以直接观察转基因斑马鱼中的微胶质细胞行为。由于Brd4在多种中枢神经系统细胞类型中表达，进一步的研究将有助于确定Brd4在微胶质细胞突触清除中的关键作用是依赖其在微胶质细胞中的自主功能，还是由其他细胞类型通过Brd4依赖的信号传递介导。
我们没有在免疫荧光实验中观察到人类PSP患者黑质或苍白球的Brd4表达模式或水平与对照组有明显变化，这一结果与已发表的研究一致。人类颞上回的RNA批量测序分析显示，PSP患者的BRD4 mRNA上调了约20-30%，而同一研究中的单核RNA测序则提示BRD4在胶质细胞中的上调比在神经元中更加显著，但在调整多重比较后，这些变化均未达到统计学显著性。然而，已有研究表明，Brd4在先天免疫细胞中的关键调控作用并不依赖其表达水平的变化。比如，当小鼠骨髓巨噬细胞暴露于LPS（强效炎症刺激物）时，Brd4依赖的基因表达发生了显著变化，并且Brd4在LPS刺激基因的调控元件附近广泛结合染色质，这一过程是在Brd4水平保持稳定的情况下发生的，表明Brd4的表达变化并非其引发细胞转录程序重大改变的必要条件。未来的研究中，探讨神经元中Tau的积累如何影响Brd4与染色质的结合位点，以及Brd4依赖的基因表达在神经元和胶质细胞中的变化，将具有重要的研究意义。
我们在Tau斑马鱼中观察到使用(+)JQ1后存活率和神经功能的改善，这引发了关于溴结构域抑制剂在PSP中的转化潜力的诸多问题，特别是考虑到针对BET溴结构域的化合物已经在其他疾病的临床试验中测试过（虽然伴随着一定的毒性）。我们的研究发现，(+)JQ1对微胶质细胞突触吞噬的抑制作用在Tau斑马鱼和大鼠原代培养模型中具有系统发育上的保守性，加上Brd4在PSP患者的微胶质细胞中表达，这表明Brd4可能通过药理手段调控PSP中的微胶质突触修剪。已有的研究支持溴结构域抑制剂能够减轻神经炎症。例如，(+)JQ1可以减少小鼠阿尔茨海默病模型中中枢神经系统的炎症标记物表达，但未能改善神经表型，可能是由于其半衰期短（0.9小时）且给药间隔较长（在斑马鱼中不存在这个问题，因为它们持续浸泡在大量(+)JQ1溶液中）。然而，并非所有我们在Tau斑马鱼中观察到的表型都能够通过(+)JQ1或Brd4表达减少来挽救。这可能与实验操作的时间或效力相对于模型病理进程的影响有关，也可能暗示不同的分子和细胞机制推动了表型的特定组成部分。
功能性成像研究显示，PSP患者在病理进展过程中存在微胶质细胞激活和突触丧失的证据，但这些如何促成神经功能缺陷的进展尚不清楚。值得注意的是，(+)JQ1在其他神经疾病实验模型中显示出潜在的负面影响，例如在亨廷顿病小鼠模型中加重了神经表型，并且在携带多种APP和PSEN1突变的人类神经细胞培养中导致Tau蛋白磷酸化的轻微增加。这些现象是否反映了不同模型或实验系统的差异、BET蛋白的多效性功能，或是现有工具化合物溴结构域选择性较低的问题，尚不明确。然而，在推进Brd4作为PSP中的药理靶点之前，解决这些问题至关重要。
我们的筛选还发现了其他可能促进体内4R-Tau病理的途径。组蛋白乙酰化和HIF-1α信号通路此前在其他神经退行性疾病中有所研究，但尚未在PSP中探讨。之前的研究表明，PSP患者大脑中多个基因位点存在DNA超甲基化，这与我们发现的DNA甲基转移酶抑制剂总体上改善Tau斑马鱼表型的结果一致。这些发现共同提供了初步证据，表明Tau斑马鱼可能具有预测PSP的效度，并为未来的研究指明了方向。鉴于首次筛选已取得丰硕成果，我们目前正在扩大筛选规模以探查更大规模的化合物库。我们还预期，斑马鱼PSP模型（以及我们为其自动化定量分析开发的开源软件和方法）将有助于多个后续应用，包括在体内快速优化PSP治疗，基于假设驱动分析病理生理机制，利用反向遗传学评估PSP风险等位基因，并验证小分子筛选命中靶点的遗传基础。
伦理审批
所有涉及脊椎动物的研究均已获得匹兹堡大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准，并遵循美国国家卫生研究院（NIH）的《实验室动物护理与使用指南》（针对斑马鱼研究的IACUC协议号为23012444；针对大鼠研究的IACUC协议号为24034765；匹兹堡大学PHS保证号D16-00118）。
所有涉及人体组织的研究均已获得匹兹堡大学监督涉及死亡者研究及临床培训委员会（CORID；协议号793）的批准。在尸检时，已获得近亲的许可，以收集和分析组织用于研究。
成年斑马鱼被饲养在9升的鱼缸中，鱼缸中装有持续循环的清洁系统水，水温保持在25°C，顶部安装的荧光白炽灯提供循环照明（70勒克斯），光照周期为14小时光照和10小时黑暗（早上8点开灯）。斑马鱼胚胎通过繁殖鱼缸中的成年斑马鱼交配产生，并在E3缓冲液（5 mM NaCl，0.17 mM KCl，0.33 mM CaCl2，0.33 mM MgSO4；Sigma，圣路易斯，密苏里州）中于28.5°C条件下，在10厘米的盘子中饲养，通过孵化器上安装的白色LED灯提供循环照明（200勒克斯），光照周期为14小时光照和10小时黑暗（早上8点开灯）。实验中分析的斑马鱼幼体小于受精后15天；在这一发育阶段，斑马鱼的性别尚未确定，因此研究对象包括有潜力分化为雄性或雌性斑马鱼的个体。在集群管理中，根据NIH指南，通过浸泡在浓度为300 mg/L的三卡因缓冲液中，直至所有鳃盖运动停止后30分钟，对成年斑马鱼进行安乐死。实验完成后，根据NIH指南，通过浸泡在浓度为300 mg/L的三卡因缓冲液中，直至所有反应消失，随后用5%次氯酸钠溶液对小于15天的斑马鱼幼体进行安乐死。
从质粒T2M-mCherry-2A-nls-eGFP（由达特茅斯学院的Steven Leach博士赠送）中，使用引物5′-CGGGATCCGGAGCCACGAAC-3′和5′-CCATGTTATCCTCCTCGCCCTTGCTCAC-3′扩增出p2A-nls DNA片段，经BamHI酶切后，插入到pmCherry（Clontech，加利福尼亚州帕罗奥多市）的BamHI/MscI位点中，以构建p2A-nls-mCherry。随后，从p2A-nls-mCherry中使用引物5′-GTGATATCCGGAGCCACGAACTTC-3′和5′-CCGCTCGAGCCGCTACTTGTACAGC-3′扩增出p2A-nls-mCherry片段，经EcoRV和XhoI酶切后，插入到pT2MUASMCS（由日本国立遗传学研究所的Koichi Kawakami博士赠送）中，以构建pTol2-5UAS:p2A-nls-mCherry。使用引物5′-GAAGATCTGTCGACGAATTCCC-3′和5′-CCCAAACCCTGCTTGGCCAG-3′从质粒t2（由佛罗里达大学的Matthew Farrer博士赠送）中扩增出人4R/0N-Tau的开放阅读框，经BglII酶切后，插入到pTol2-5UAS:p2A-nls-mCherry的BglII/EcoRV位点中，以构建pTol2-5UAS:Hsa.MAPT-p2A-nls-mCherry。所有DNA构建体均进行了全序列测定，并在生成转基因品系之前，通过瞬时共转染实验验证了mCherry的表达。
为了生成哺乳动物细胞培养表达质粒，将编码CAAX膜锚定信号的DNA片段插入到pIRES2-GFP（Clontech；#2069-1）的BsrGI/NotI位点中，以生成pIRES2-mGFP。使用引物5′-GGAATTCATGGCTGAGCCCCGCC-3′和5′-AAGGCCTCACAAACCCTGCTTGG-3′扩增出人0N/4R-Tau的cDNA片段，并插入到pIRES2-mGFP的EcoRI/SmaI位点中，以构建pIRES2-Tau-mGFP。所有质粒均通过限制性图谱分析和测序进行验证，并通过瞬时转染后的Western印迹和显微镜观察确认Tau和mGFP的表达。
按照我们之前的工作中所述的方法，通过向野生型AB品系斑马鱼的单细胞胚胎中显微注射pTol2-5UAS:p2A-nls-mCherry或pTol2-5UAS:Hsa.MAPT-p2A-nls-mCherry质粒以及编码Tol2转座酶的mRNA，生成了稳定的转基因斑马鱼品系。对于pTol2-5UAS:Hsa.MAPT-p2A-nls-mCherry，我们使用引物5′-AGATCTGTCGACGAATTCCC-3′和5′-AATCCTGGTGGCGTTGGCCT-3′对来自野生型杂交的F1胚胎DNA池进行PCR，鉴定出10个不同的F0嵌合体。然后，将每个F0嵌合体与Tg(eno2:Gal4FF)神经元驱动系杂交，评估F1后代的mCherry表达情况。四个杂交产生了具有明亮荧光的后代；随后，将每个杂交中的F0亲本再次与野生型斑马鱼杂交，并将后代饲养至成年。通过从成年鱼的鳍夹DNA进行PCR，鉴定出每条Tg(UAS:Hsa.MAPT-p2A-nls-mCherry)品系的F1创始人。通过F1与Tg(eno2:Gal4FF)的杂交，在F2后代中验证了mCherry的表达。然后，从单个F1创始人中衍生出品系。在没有Gal4驱动系的情况下，通过野生型杂交进行品系的衍生、扩增和维持，并使用鳍夹PCR基因分型。
在测试的几种Gal4泛神经元驱动系中，Tg(elavl3:gal4-vp16)对UAS等位基因的转激活作用最强，并用于后续实验。当与泛神经元驱动系杂交时，多个不同的4R-Tau应答子等位基因均表现出相同的表型。品系Tg(UAS:Hsa.MAPT-p2A-nls-mCherry)pt433在多个世代（目前为F9）中表现出稳定的表达和最小的变异，并用于本研究中。Tg(UAS:p2A-nls-mCherry)Pt434对照品系以类似方式生成，但可以在Gal4驱动系背景下维持，因为它们除了神经元mCherry荧光外没有其他表型。
其他对照品系Tg(UAS:egfp)和Tg(UAS:Hsa.SNCA-p2A-nls-mCherry)在我们之前的工作中已有报道。将Tg(mpeg1:egfp)斑马鱼与Tau和Ctrl品系杂交，以在整体显微镜研究中表达GFP于小胶质细胞的细胞质中。
从3-6天受精后（dpf）的斑马鱼幼鱼中提取总RNA，采用柱纯化法（RNAqueous; Thermo Fisher; #AM1912），通过凝胶电泳和分光光度法验证RNA质量后，使用oligo-dT引物进行第一链cDNA的合成（SuperScript III; Thermo Fisher; #18080051）。每个PCR反应体系包含0.5 μL cDNA（或阴性对照中的ddH2O）、1 μL基因特异性引物对（每种引物0.1 μM；序列见补充表1）、10 μL iTaq Universal SYBR Green Supermix（BioRad, Hercules, CA; #1725120）以及ddH2O，最终体积为20 μL。实时PCR在BioRad CFX Opus 96系统上进行。热启动后，样品经过40个循环的扩增（95°C，15秒；72°C，30秒），随后进行熔解曲线分析。每个反应均进行技术三重复，所有实验均涉及多个生物重复样本。使用CFX Maestro软件版本2.3进行基因表达的定量分析。
定制的吗啉代反义寡核苷酸（MO；Gene Tools, Philomath, OR）被设计用于靶向brd4 mRNA的翻译起始位点5′-CGTCCAGGCCGTCCCCCATACTAG-3′或初级brd4转录本中内含子5/外显子6边界的剪接受体5′-TCATGTCTAATGACACAGAAAGAGA-3′。MO原液在含有0.5%酚红的Danieau显微注射缓冲液（8 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.6 mM Ca(NO3)2, 5 mM HEPES, pH 7.6）中稀释至工作浓度5 ng/nL。在1-4细胞阶段，向每个胚胎的卵黄囊注射1至2 nL的MO溶液。使用相同浓度和体积的标准非靶向MO 5′-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3′（cat # PCO-StandardControl-100; Gene Tools）作为阴性对照。显微注射后的胚胎发育至2-4 dpf后，裂解于RIPA缓冲液中用于Western blot分析（见下文）或固定后进行免疫组织化学染色以量化小胶质细胞。
为了靶向斑马鱼brd4基因第5外显子3'端的BamHI限制位点，我们设计了一个定制的gRNA序列5′-GCCGGGGCAGGAGGGAUCC-3′。该gRNA由Sigma合成，并包含了与tracrRNA杂交的附加序列。在单细胞阶段，将含有gRNA、tracrRNA（Sigma，cat # TRACRRNA05N）、化脓性链球菌Cas9（New England Biolabs，cat # M0386T）和酚红的溶液以2nL的量显微注射到胚胎中。每2nL注射溶液中含有130 pg的gRNA。显微注射后的胚胎被饲养至成年。通过野生型杂交后代的基因型鉴定，我们识别出F0代嵌合体，其特征是目标BamH1位点的丢失。使用PCR引物5′-CCTATGGACATGGGAACAATCAA-3′和5′-GGAACCCTATGCAGTTATCAAACTG-3′扩增混合基因组DNA，产物为530 bp，跨越brd4的第5外显子和第6内含子。野生型（WT）PCR产物的BamHI消化会产生333 bp和197 bp的限制性片段，而影响BamHI位点的突变则会在消化后产生一个未切割的530 bp产物。将F0代嵌合体与野生型斑马鱼杂交的后代饲养至成年，并剪取鳍部DNA进行PCR和BamHI消化的基因型鉴定。这帮助我们识别出F1代创始人，随后对其DNA进行测序以表征突变。总体而言，我们确定了5个具有不同突变（包括8 bp或11 bp缺失、5 bp插入以及1/45 bp和5/5 bp的组合缺失/插入）的独特F1代。我们选择了11 bp缺失的等位基因Pt435进行进一步研究，因为它通过Western blot分析证实了Brd4表达的完全丧失。该等位基因与野生型斑马鱼进行4代杂交后，再进行自交或与Tau斑马鱼杂交，以进行后续分析。
在受精后3天（3dpf），通过mCherry表达鉴定出Tg(elavl3:gal4-vp16); Tg(UAS:Hsa.MAPT-2A-nls-mCherry)转基因‘Tau’斑马鱼。未表达mCherry的同胞斑马鱼、无关野生型（WT）斑马鱼以及Tg(elavl3:gal4-vp16); Tg(UAS:2A-nls-mCherry)转基因‘Ctrl’斑马鱼被用作对照组进行比较。受精后5天（5dpf）起，斑马鱼在标准饲养条件下进行维护，包括使用新鲜循环水和每日三次喂食。不同实验组分别饲养在单独的鱼缸中，并每天统计每个鱼缸中存活的斑马鱼数量，直至15dpf。类似的方法也被用于比较Tg(elavl3:gal4-vp16); Tg(UAS:Hsa.SNCA-2A-nls-mCherry)或Tg(elavl3:gal4-vp16); Tg(UAS:2A-nls-mCherry); Tg(UAS:egfp)转基因斑马鱼与其未表达同胞的存活情况。
在2-7dpf期间，Tau和Ctrl斑马鱼被浸泡在含有5μg/mL吖啶橙（Sigma，cat # A6014）的E3胚胎水中，避光处理30分钟。之后，用E3水洗涤三次，将斑马鱼分别嵌入1.5%的琼脂糖中，并使用Olympus CKX41倒置荧光显微镜进行观察。每个脊髓中荧光标记的细胞数量被手动计数。
2-7dpf的Tau和Ctrl斑马鱼被固定在4%多聚甲醛中，用PBS洗涤，并在30%蔗糖中进行冷冻保护。使用冷冻切片机沿矢状面收集12μm厚的切片。TUNEL标记使用TUNEL Andy Fluor 647凋亡试剂盒（ABP Biosciences，cat # A052）按照制造商的协议进行。通过免疫组织化学方法检测活化的（切割型）Caspase 3，具体方法如下所述。使用Olympus BX51显微镜通过透射光或宽场荧光显微镜对脑切片进行成像。标记的细胞数量使用ImageJ软件进行量化，并根据组织切片面积进行归一化处理，如补充图S7所示。
斑马鱼按上述方法固定并切片。切片被置于载玻片上，用磷酸盐缓冲液+0.3% Triton X-100（PBST）洗涤3次，每次5分钟，然后在封闭缓冲液（PBST中的1%牛血清白蛋白）中孵育60分钟，随后在4°C下与一抗（见下文）孵育16小时。用PBST洗涤后，切片在室温下与二抗孵育60分钟。对于显色标记，使用了生物素化的二抗（PBS中1:200稀释；货号BA9200；Vector Laboratories，伯灵盖姆，加利福尼亚州），随后与HRP-avidin-biotin复合物（Vectastain，Vector Laboratories，伯灵盖姆，加利福尼亚州）孵育，进行3,3'二氨基联苯胺底物的显色组织化学反应（Vector Laboratories），并用Mayer氏苏木精（Sigma）复染。对于免疫荧光，荧光素偶联的二抗——山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor 488、山羊抗兔IgG Alexa Fluor 488、驴抗山羊IgG Alexa Fluor 555（Invitrogen）——在含有DAPI的PBS中稀释至1:1000（DAPI在PBS中的最终浓度为200 ng/mL；货号10236276001；Roche），作为核复染标记。
免疫组织化学用的一抗及其稀释度如下。图2c：纯化的兔抗活性Caspase 3（1:200；货号559565，BD Biosciences，圣何塞，加利福尼亚州）。图2h：小鼠抗斑马鱼小胶质细胞标志物克隆7.4.C4（1:25；DSHB，爱荷华大学）。图3e-g：小鼠抗人磷酸化(S202/T205)-Tau（AT8；1:500，货号MN1020，Thermo Fisher），小鼠抗人Tau IgG1（MC1；1:100；Peter Davies博士赠予，阿尔伯特·爱因斯坦医学院），小鼠抗人Tau IgM（Alz50；1:100；Peter Davies博士赠予，阿尔伯特·爱因斯坦医学院），小鼠抗人磷酸化(T231)-Tau（AT180；1:250；货号MN1040，Thermo Fisher），小鼠抗人磷酸化(T181)-Tau（AT270；1:500；货号MN1050，Thermo Fisher），小鼠抗人磷酸化(S396/S404)-Tau IgG1（PHF1；1:1000；Peter Davies博士赠予，阿尔伯特·爱因斯坦医学院），兔抗人磷酸化(S422)-Tau（1:500；货号44-764G，Thermo Fisher）。图4f：小鼠抗人截断Tau（TauC3；1:100；货号AHB0061，Invitrogen）。
对于图9a、d以及补充图S28和S40中所示的整体封片突触和小胶质细胞标记，将4或5天龄的斑马鱼用4%多聚甲醛固定，用PBS洗涤，解剖以暴露大脑，在冰上用丙酮处理8分钟，然后在室温下用10%正常山羊血清/PBST封闭120分钟。随后，在4°C下与兔抗PSD95一抗（1:1000；Abcam；#ab18258）和用于小胶质细胞标记的鸡抗GFP（1:5000；Abcam；#ab13970）孵育24小时。用PBS洗涤三次后，样品在室温下与山羊抗兔IgG Alexa Fluor 488二抗（1:1000；Invitrogen；#A11008）或山羊抗兔Alexa Fluor 647（1:1000；Invitrogen；#A-21244）和山羊抗鸡Alexa Fluor 488（1:1000；Invitrogen；#A11039，用于小胶质细胞共标记）在1%正常山羊血清/PBST中孵育120分钟。每次用PBS洗涤5分钟后，将样品嵌入低熔点琼脂糖中，使大脑的背侧表面与35mm玻璃底培养皿（MatTek，阿什兰，马萨诸塞州）的盖玻片接触。使用Nikon Ti2E倒置显微镜和40倍长工作距离水浸物镜（CFI Apo LWD Lambda S 40XC WI NA 1.15）以及Nikon AXR共振扫描共聚焦系统（Nikon USA，梅尔维尔，纽约州）获取背侧端脑和背外侧视顶盖的三维图像堆栈。使用NIS-Elements软件版本5.30.05对图像进行分析。使用General Analysis 3模块开发了自定义算法，以在每个三维图像堆栈中量化突触点、小胶质细胞体积以及小胶质细胞内的突触点。为了消除偏差，每个实验的所有图像均使用相同的设置获取，并使用相同的参数和阈值进行量化。
本研究中使用的死后人类组织来自匹兹堡大学神经病理学系的神经退行性疾病脑库。进行性核上性麻痹（PSP）病例（3例女性，2例男性）均符合已发表的神经病理学诊断标准。对照组（1例女性，3例男性）未显示神经退行性疾病的证据。PSP病例组（77.2±10.8岁）与对照组（85.5±5.8岁）在死亡年龄上无显著差异（p=0.17，双尾t检验）。在尸检时，大脑被一分为二，左半球用福尔马林固定，随后选取代表性的脑区进行石蜡包埋并切片以供诊断评估。
对于本研究，首先将载玻片在60°C下孵育30分钟，然后在二甲苯中脱蜡3次，每次4分钟。随后，通过一系列乙醇浓度（100%、95%、70%各两次，每次2分钟）将切片脱水至水，然后用0.1%（溶于70%乙醇）的苏丹黑（Cat # 199664; Sigma）处理5分钟以抑制背景自发荧光。接着，通过在三羟甲基氨基甲烷/乙二胺四乙酸（Tris/EDTA）缓冲液（10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0.05% Tween-20, pH 9.0）中煮沸20分钟来进行抗原修复。冷却至室温后，用双蒸水（ddH2O）和PBS洗涤切片，然后在封闭溶液（Cat # MB-0710100; Rockland）中孵育60分钟。之后，将切片在4°C下与一抗（兔抗Brd4，1:200；Cat # ab128874; Abcam；山羊抗Iba1，1:500，Cat # ab5076, Abcam）孵育48小时。用PBS洗涤三次，每次5分钟后，将切片在室温下与二抗（山羊抗兔IgG Alexa Fluor 488；驴抗山羊IgG Alexa Fluor 555；1:1000; Invitrogen）孵育60分钟。最后，用PBS洗涤载玻片，在室温下用DAPI孵育5分钟，然后封片以供显微镜观察。
斑马鱼被解剖后，头部区域被裂解并用RIPA缓冲液（150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 和 0.1% 脱氧胆酸钠）或DIGE缓冲液（7 M 尿素, 2 M 硫脲, 30 mM Tris-HCl, 4% CHAPS）进行提取。在图3b中的去磷酸化实验中，样品使用高盐缓冲液提取，并用饱和硫酸铵沉淀蛋白质。沉淀物在50 mM Tris-HCl（pH8.0）、1 mM MgCl2中重新悬浮，并与小牛肠碱性磷酸酶（CIP; 目录号M0525; New England Biolabs）或λ-蛋白磷酸酶（λPP; 目录号P0753; New England Biolabs）在37°C下孵育60分钟，之后进行电泳。
每个实验组的60 μg粗蛋白提取物被加载到12% SDS-PAGE凝胶的每个孔中。电泳分离后，蛋白质被转移到硝酸纤维素膜（LI-COR）上，该膜在室温下使用Odyssey封闭缓冲液（目录号927-40000; LI-COR）封闭60分钟，随后在4°C下与一抗（见下文）孵育16小时。在PBST中每次洗涤10分钟，共洗涤3次后，印迹在LI-COR封闭缓冲液中与二抗IRDye 800CW山羊抗小鼠IgG（1:10000; 目录号926-32210, LI-COR）和IRDye 680RD山羊抗兔IgG（1:10000; 目录号926-68071, LI-COR）在室温下避光孵育60分钟。在PBST中进一步洗涤3次后，使用LI-COR Odyssey近红外扫描仪扫描印迹，并使用LI-COR Empiria软件从原始扫描数据中量化免疫反应性条带。为了在图中显示定性特征，将原始扫描数据反转以在浅色背景上产生深色条带，然后调整亮度和对比度，直到感兴趣的特征清晰可见（整个图像上的所有调整都是相同的）。在适用的情况下，全长印迹图像在原始数据中展示。
Western Blot所用的一抗及其稀释度如下。图2g：小鼠抗酪氨酸羟化酶（1:1000; 目录号MAB318, Millipore），兔抗GAD65/67（1:500; 目录号AB1511, Millipore），兔抗突触素（1:500; 目录号ab32594, Abcam），兔抗PSD95（1:500; 目录号ab18258, Abcam）。图3a-c, 4a, b, d, e, g, 和8f, i：小鼠抗Tau[210-241]（Tau5; 1:1000; 目录号AHB0042, Thermo Fisher），兔抗人Tau[243-441]（1:5000; 目录号A0024, Dako），小鼠抗人磷酸化(S202/T205)-Tau（AT8; 1:500, 目录号MN1020, Thermo Fisher），小鼠抗人磷酸化(T231)-Tau（AT180; 1:500; 目录号MN1040, Thermo Fisher），小鼠抗人磷酸化(T181)-Tau（AT270; 1:2000; 目录号MN1050, Thermo Fisher），小鼠抗人磷酸化(T212/S214)-Tau（AT100; 1:250; 目录号MN1060, Thermo Fisher），小鼠抗人磷酸化(S396/S404)-Tau IgG1（1:1000; 由阿尔伯特·爱因斯坦医学院的Peter Davies博士赠送），兔抗人磷酸化(S422)-Tau（1:1000; 目录号44-764G, Thermo Fisher）。图10b：兔抗Brd4抗体（1:500; 由NIH的Igor Dawid博士赠送）。补充图S7：兔抗Caspase 3（1:500; 目录号ab13847, Abcam）。兔抗肌动蛋白（1:2000; 目录号A2066, Sigma）用于确认印迹上蛋白质加载量的一致性。
对于图4g中所示的非变性、非还原凝胶，斑马鱼在TBS缓冲液（50 mM Tris, pH7.4, 274 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM PMSF, 1x蛋白酶抑制剂混合物; Roche, 目录号11836153001）中机械解离。含有TBS可溶性蛋白质的上清液与4x非还原样品缓冲液（ThermoFisher; 目录号84788）混合，样品在不煮沸的情况下加载到10%聚丙烯酰胺凝胶上。蛋白质电泳分离后，Western Blot的其余步骤如上所述。
斑马鱼幼鱼运动活动的测量（图5a-h, 7a, b, d, e, 8a, b, 和 10c, d）通过使用我们开源的MATLAB应用程序LSRtrack和LSRanalyze进行，具体方法如我们之前的工作以及详细发表的协议中所述。简而言之，使用带有火焰抛光孔径的大口径巴斯德吸管将5天大（dpf）的幼鱼转移到带有黑色井围和光学玻璃底部的96孔板（Corning 96孔特殊光学微孔板；目录号CLS3720；Sigma）中，然后在白色光（200勒克斯，色温3500K）下于28.5°C的记录室中适应30分钟。在连续的环境光照下记录60分钟的运动反应，然后在3个周期（每个周期10分钟黑暗+10分钟光照）内诱发视觉运动反应。通过96孔板的玻璃底部记录透光的斑马鱼，红外光源（#BL812-880，Spectrum Illumination，Montague，MI）置于上方，而带有50mm镜头和红外透过滤光片的USB 3.0相机（#FL3-U3-13Y3M-C，Point Grey Research，Richmond，BC，Canada）则置于1.2米下方。视频记录进行离线分析。
游泳过程中躯干运动学（图5i-m）的分析通过使用我们开源的MATLAB应用程序HiSpeedTracking进行，具体方法如我们之前的工作中所述。简而言之，将5dpf的斑马鱼转移到切割成0.3%琼脂糖填充板中的15mm直径的孔中，并在28.5°C的记录室中适应30分钟。通过在明亮的白色环境光（1100勒克斯，4900K）和黑暗（<1勒克斯）之间的突然转换，在40个“暗闪”刺激周期内诱发“O”形弯曲反应。如上所述，在红外光照射下从板下方捕获视频，但使用高速相机（Integrated Design Tools，Pasadena，CA；型号#NX8-S2）搭配微距镜头（Rokinon 100mm f2.8；B&H，纽约）和红外透过滤光片（R72，720nm；B&H）。在每个光暗转换时，使用USB继电器同步捕获持续1秒、帧率为1000帧/秒的视频片段。视频记录进行离线分析。
视动反射（OKR；图6）的分析通过使用我们开源的MATLAB应用程序OKRtrack和OKRanalyze进行，具体方法如我们之前的工作中所述。简而言之，将5天大（dpf）的斑马鱼幼鱼固定在透明平台上的3.5%甲基纤维素中，该平台悬挂在圆柱形背投影屏幕内。幼鱼从下方被红外光源（880nm；#BL34-880，Spectrum，Montague，MI）照亮，并使用变焦显微镜（#S8 APO，Leica Microsystems，Wetzlar，Germany）和红外敏感相机（#FL3-U3-13Y3M-C，Point Grey Research，Richmond，BC，Canada）从上方以30帧/秒的速度捕获反应。将正弦光栅图案（15°/周期，99%对比度，在圆柱体内进行正弦变换以呈现线性间隔）投影到屏幕上，以便图案填充斑马鱼的左视野，并将刺激动画化，使其看起来以15°/秒（=1周期/秒）的速度移动。在60秒内，每10秒交替一次鼻颞（NT）和颞鼻（TN）方向的刺激，以分析反射增益。然后，通过每个方向不间断的NT或TN刺激持续60秒来诱发视动眼震，以评估急跳和移动范围。视频记录进行离线分析。
在图7中使用的表观遗传学筛选库（Cayman Chemical, Ann Arbor, MI; 目录号 11076; 批号 0468238）包含了147种溶解在DMSO中的小分子调节剂，浓度为10 mM。从2 dpf（受精后2天）开始，斑马鱼在6孔板中暴露于这些化合物中，并在3dpf和4dpf时进行换水和加入新鲜化合物，最后在5dpf时进行表型读数。筛选的第一阶段涉及在E3胚胎缓冲液中以50 µM的浓度将每种化合物测试于野生型（WT）斑马鱼中（产生最大0.5%的DMSO浓度，这在斑马鱼幼鱼的耐受范围内）。任何导致明显毒性（如死亡、光镜下形态异常或明显的神经问题）的化合物将在逐渐降低的浓度下进行测试，直到确定每种化合物的最大耐受浓度（MTC）。随后，从2 dpf到5 dpf，Tau转基因斑马鱼按照上述方法在6孔板的每个孔中以每组12条鱼暴露于每种化合物的MTC。在5dpf时，洗去化合物，并将斑马鱼转移到含有新鲜E3缓冲液的96孔板中，以便如上所述进行运动活性测量。同时，在相同但无小分子暴露的条件下平行饲养的12组Tau转基因和非表达同胞斑马鱼作为运动活性测定的对照。所有实验均在不知道化合物身份的情况下完成；筛选数据分析完成后才揭示库密钥。使用自定义MATLAB脚本来自动化数据分析工作流程，以确保满足测定质量控制标准，并量化小分子在VMR（视觉运动反应）中对Tau表型的挽救作用，同时通过对单个斑马鱼对多个光周期的反应取平均值来减少变异性。(+)JQ1和(−)JQ1是从Sigma（目录号SML1524和SML1525）重新购买的，用于图8至图10所示的实验。
大鼠皮层培养的准备方法如之前报道的。简要来说，取胚胎第16-17天（E16-17）的Sprague-Dawley大鼠皮层，进行解离后，在涂有聚-L-鸟氨酸的玻璃盖玻片（Carolina, Burlington, NC; #633029）上接种于6孔板中（每孔670,000个细胞），并在以下体积比混合的培养基中培养：77.5%的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM-Glutamax; Thermo Fisher, Waltham, MA; #10566016），10%的F-12 Ham营养混合物（Sigma; #N6658），10%的牛犊血清（Cytivia; #SH30072），加入25 mM HEPES（Thermo Fisher; #15630080）和0.24%的青霉素/链霉素（Sigma-Aldrich; P0781），在37°C、5% CO2的条件下培养。在培养的第3天、第7天和第10天，将培养基体积的一半替换为上述生长培养基，并补充100 ng/mL的小鼠IL-34（Biolegend, San Diego, CA; #577602）、2 ng/mL的TGF-β（Thermo Fisher/Peprotech, #100-21）和1.5 μg/mL的羊羊毛胆固醇（Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL; #700000P），以支持小胶质细胞的存活、生长和分化。
用于编码（i）具有膜锚定GFP（mGFP）的人0N/4R-Tau或（ii）单独mGFP的质粒，使用EndoFree Plasmid Maxi Kit（Qiagen; #12362）制备，以消除可能自身激活小胶质细胞的细菌内毒素。在培养的第14天，将生长培养基更换为含有2%牛犊血清和25 mM HEPES的DMEM，并在24孔板中对细胞进行转染，使用1.5 μg质粒DNA、4 μL Lipofectamine 2000（Thermo Fisher; #11668030）和100 μL Opti-MEM（Thermo Fisher; #31985062）。细胞表达0N/4R-Tau 5天后，向培养基中加入最终浓度为1 μM的(+)JQ1（或等量的DMSO作为对照），再培养24小时，然后固定样品进行免疫组织化学分析。
样品在4%多聚甲醛中固定后，用PBS洗涤，随后在室温下用封闭溶液（Rockland, Limerick, PA; #22159）孵育2小时。之后，将样品与PSD95（1:1000稀释；Thermo Fisher; MA1-046）、离子化钙结合适配器分子1（Iba1；1:1000稀释；WAKO; #019-19741）和GFP（1:1000稀释；Abcam; #ab13970）的一抗在PBS中4°C孵育过夜。PBS洗涤3次，每次5分钟后，样品在室温下与山羊抗小鼠Alexa Fluor 647（1:1000稀释；Invitrogen; #A-21235）、山羊抗兔Alexa Fluor 555（1:1000稀释；Invitrogen; #A-21428）和山羊抗鸡Alexa Fluor 488（1:1000稀释；Invitrogen; #A-11039）的二抗孵育2小时。再经过3次PBS洗涤后，样品在DAPI（0.2 μg/mL PBS溶液；Roche; #10236276001）中孵育并准备进行显微镜观察。
使用Nikon Ti2E倒置显微镜，搭配40倍长工作距离水浸物镜（CFI Apo LWD Lambda S 40XC WI NA 1.15）和Nikon AXR共振扫描共聚焦系统（Nikon USA, Melville, NY），获取标记细胞的共聚焦图像。使用NIS-Elements软件版本5.30.05对图像进行分析。利用General Analysis 3模块开发自定义算法，以量化每个3D图像堆栈中小胶质细胞的体积和小胶质细胞内的突触点。为了消除偏见，每个实验的所有图像均使用相同的设置获取，并使用相同的参数和阈值进行量化。
所有实验均至少进行了三次独立的生物学重复（即，在不同日子上进行的实验重复中使用了不同的动物、培养物或样品）。如图例所示，许多测定还进行了技术重复。对于使用人类PSP（进行性核上性麻痹）和对照死后组织材料的实验，来自单个患者的样品被视为生物学重复。样本量是通过功效分析确定的，其中考虑了预期效应大小和变异性。如果没有这些信息，则根据实验样本的可用性以及诸如通量和并行分析样品的能力等实际因素来确定样本量。
在斑马鱼运动测定中，如果单个孔中的跟踪错误超过5%，则相关数据点将被移除，但来自存活幼鱼的所有数据均纳入分析。对于其他分析，如果技术上失败（例如，对照未产生可解释的结果或未达到质量控制指标），则排除相关实验并重新进行。如果无法收集到可解释的数据（例如，在组织学制备过程中组织受损），则排除单个样品，但所有数据均纳入分析。在可能的情况下，采用了无偏见的自动化测定；否则，观察者将对样品身份保持盲态。小分子库在筛选时对化合物身份保持盲态。
整个研究过程中使用了双尾或双侧统计检验。对于正态分布的数据，采用了参数统计检验。使用Welch校正的t检验来比较两个实验组。对于三个或更多组的比较，根据实验设计和评估的变量数量，采用单因素或双因素ANOVA，如图例中详述。使用Dunnett检验将每个组与单一对照值进行比较，使用Tukey检验将所有组相互比较，或使用Šidák检验在实验中特别设计用于比较可能排列组合中的特定组对，或用于对相同组随时间重复比较。使用单样本t检验将实验组与标准化（例如，拯救=0，或表达=1）对照进行比较。生存数据通过Mantel-Cox检验进行分析。分类数据使用Fisher精确检验进行分析。所有分析均使用Prism 10.2.2（GraphPad）软件完成。
原文地址：https://www.nature.com/articles/s41467-024-52173-0
