【文献解读】利用斑马鱼模型研究代糖对血管发育的影响及其分子机制
文摘
科学
2024-10-08 17:00
江苏
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文献：Wang X, Zhao J, Xu J, Li B, Liu X, Xie G, Duan X, Liu D. Noncaloric monosaccharides induce excessive sprouting angiogenesis in zebrafish via foxo1a-marcksl1a signal. Elife. 2024 Oct 4;13:RP95427. doi: 10.7554/eLife.95427. PMID: 39365738; PMCID: PMC11452176.影响因子：6.4
含有非热量单糖的人造甜味饮料被建议作为糖甜饮料的更健康替代品。然而，这些非热量单糖对血管功能的潜在不利影响尚未得到充分理解。我们建立了一种斑马鱼模型，该模型显示出由高葡萄糖诱导的显著过度血管生成，类似于增殖性糖尿病视网膜病（PDR）中观察到的高血管生成特征。利用这一模型，我们观察到葡萄糖和非热量单糖能够诱导过量的血管形成，尤其是间段血管（ISVs）。观察到过度分支的血管是由休眠的内皮细胞（ECs）异常激活转化为尖端细胞所形成的。对高葡萄糖暴露的胚胎中 ECs 的单细胞转录组测序分析显示，毛细血管 ECs 和增殖 ECs 的比例增加，同时一系列促血管生成基因上调。进一步的分析和实验验证了降低 foxo1a 通过上调 marcksl1a 的表达来介导非热量单糖诱导的过度血管生成。本研究提供了新的证据，显示非热量单糖对血管系统的负面影响及其潜在机制。介绍
糖尿病（Diabetes mellitus，DM）是一组以血糖水平升高为特征的慢性疾病。在糖尿病患者中，心血管并发症，尤其是高血糖对人类血管网络的直接和间接影响，仍然是主要的发病和死亡原因。高血糖的有害影响与微血管和大血管并发症密切相关，包括视网膜病、肾病、神经病、动脉粥样硬化、缺血性心脏病、中风和外周动脉疾病。内皮细胞功能障碍是一种系统性病理状态，表现为完整性破坏、黏附能力降低、增殖能力改变、迁移及管腔形成等异常。长期高血糖水平已被证明与体内外的血管功能障碍相关。流行病学证据表明，心血管疾病与糖尿病的风险与糖甜饮料（SSBs）和100%果汁的消费存在正相关，强调了糖摄入对心代谢风险因素的不良影响，无论这些糖是添加的还是天然存在的。含有人造甜味剂或低热量添加剂的人造甜味饮料（ASBs）被认为是SSBs的健康替代品。ASBs包含糖醇和多元醇，如山梨醇、木糖醇、麦芽糖醇、甘露醇、赤藓糖醇、异麦芽糖醇和乳糖醇。近年来，全球ASBs的消费逐渐增加。然而，近年来的累积研究表明，ASB消费可能与心血管事件和糖尿病风险增加相关。尽管如此，这些发现的潜在机制仍然缺乏充分的文献支持。斑马鱼因其在糖代谢、胰腺结构、葡萄糖稳态、脂肪生物学及与哺乳动物的遗传相似性方面的功能保守性，已被认可为研究代谢疾病（如高血糖和糖尿病并发症）的有价值动物模型。斑马鱼的胚胎透明性和转基因品系的结合，使得通过特定标记内皮细胞的荧光蛋白进行高分辨率成像分析血管形成成为可能。将斑马鱼浸泡在葡萄糖溶液中已被发现诱导糖尿病并发症，包括血管功能障碍。一些近期研究已经探讨了高葡萄糖对斑马鱼模型中血管功能的影响。然而，非热量单糖与血管功能障碍（如过度血管生成）之间的关系尚未阐明。在此，我们成功建立了一种短期斑马鱼模型，该模型显示出显著的过度血管生成，类似于由葡萄糖处理诱导的增殖性糖尿病视网膜病（PDR）表型。利用该模型，我们研究了非热量单糖对血管发育的影响，并探讨了分子机制。我们的结果提供了关于热量和非热量单糖对血管发育负面影响的新证据。建立短期高糖诱导过度血管生成的模型
为了建立由高葡萄糖处理诱导的短期斑马鱼过度血管生成模型，我们将 Tg(fli1aEP:EGFP-CAAX)ntu666胚胎浸泡在不同浓度和时间范围的葡萄糖溶液中，该转基因品系的内皮细胞被膜结合的 GFP 标记（图1—补充图1）。随后，我们测量了胚胎中的葡萄糖浓度。结果发现，高葡萄糖处理的胚胎中葡萄糖浓度显著高于对照组（图1—补充图3）。我们观察到，在受精后24小时（hpf）或48 hpf时，暴露于6% D-葡萄糖处理超过48小时的斑马鱼胚胎血管形成显著增加（图1，视频1和2），特别是在指定区域的间段血管（ISVs）中（图1b）。在高葡萄糖处理的胚胎中，观察到过度分支的内皮细胞从现有血管（包括 ISVs、背主动脉（DA）和背侧侧支血管（DLAV））中芽生（图1）。![]()
此外，这些异位分支的血管芽没有被血流灌注。尽管出现了异常的血管形成，但在明场显微镜下检查这些处理过的胚胎时未观察到显著的发育缺陷（图1—补充图4a–c）。此外，在相应时间范围内，处理1%、2%、3%和4% D-葡萄糖的胚胎未观察到过度血管生成的表型（图1—补充图5）。果糖是一种酮式单糖，为生物体提供能量。因此，我们的研究调查了果糖对血管功能障碍的潜在影响，并与葡萄糖进行比较。结果表明，果糖可导致斑马鱼胚胎中过度血管生成（图2—补充图1）。为了探讨葡萄糖和果糖对血管发育的影响是否通过代谢事件介导，我们使用其他动物无法消化的非热量单糖（如L-葡萄糖、D-甘露糖、D-核糖和L-阿拉伯糖）进行了相同测试。有趣的是，我们观察到所有这些非热量单糖均能诱导过度血管生成，其中从两家公司购买的L-葡萄糖的效能与D-葡萄糖相似（图2a–h）。为排除渗透压的影响，我们用等渗双糖（包括乳糖、麦芽糖和蔗糖）处理斑马鱼胚胎，未造成显著的过度血管生成表型（图1—补充图4d和h；图2—补充图2）。然而，高浓度的双糖处理也可导致斑马鱼胚胎中出现过度血管生成（图2—补充图3）。此外，我们还测试了丙酮酸的影响，但在50 nM至50 μM浓度的丙酮酸处理下并未观察到过度血管生成表型（图2—补充图4）。我们进一步通过活体成像分析高葡萄糖处理的Tg(flt1:YFP::kdrl:ras-mCherry)，检查了过度分支血管的动静脉特征，其中动脉中的YFP表达明显高于静脉（Krueger et al., 2011）。结果显示，这些过度分支的异位血管既包含动脉也包含静脉（图2i和j）。![]()
鉴于高葡萄糖冲击在48 hpf胚胎中诱导过度血管生成，假设这种冲击可能在调节静止内皮细胞（ECs）向活跃的尖细胞样细胞分化及其后续行为中起关键作用。为探究这一假设，我们通过共聚焦时间推移成像分析观察了这些ECs的行为。结果显示，在对照组Tg(fli1aEP:EGFP-CAAX)ntu666胚胎中，48 hpf至5 dpf期间生成的ISVs、DA和DLAV中的尖细胞未观察到显著激活。此外，只有少数ECs在已建立的ISVs、DA和DLAV中延伸出伪足，但很快又收回（图3a–c，视频3）。相比之下，在高葡萄糖处理的胚胎中，许多ECs启动了血管生成，延伸出动态伪足以感知周围环境，并形成过度的异位血管（图3，视频4）。瞬间观察中，我们发现一些ECs同时突出了长而复杂的芽（图3f），在某些极端情况下，几乎所有ISV中的ECs都出现了伪足的生长（图3g），这表明高葡萄糖处理诱导了内皮细胞向尖细胞样细胞的分化。此外，我们观察到这些异位血管芽的生长能够与邻近的芽和血管建立连接，从而形成复杂的血管结构（图1c、f、i、l和p）。![]()
单细胞转录组测序分析：从葡萄糖处理的胚胎中分离出的内皮细胞为了深入了解葡萄糖如何激活内皮细胞（ECs）的潜在机制，我们进行了单细胞转录组测序分析。由于斑马鱼胚胎中内皮细胞数量有限，分析这些细胞存在挑战。首先，我们从对照组和高葡萄糖处理的胚胎中分离出EGFP阳性细胞。在胚胎进行蛋白酶解离后，通过荧光激活细胞分选技术分离出EGFP阳性细胞。每个阶段大约使用300-500个斑马鱼胚胎进行内皮细胞的收集。分离出的内皮细胞使用大规模单细胞RNA测序（10X Genomics）平台进行分析，流程如图示所示（图4a）。我们应用了多项标准来选择单个细胞，包括保留在至少三个独立细胞中表达的基因（独特分子标识符或UMI大于0）、选择基因表达计数在500-3000范围内的细胞，以及设定阈值，限制来源于线粒体基因组的测序读数比例低于5%（图4—补充图1，图4—补充图2，补充文件1）。最终，选择了6006个内皮细胞进行进一步分析（补充文件2）。![]()
图4 单细胞转录组测序分析对照组和高糖处理胚胎的血管内皮细胞（ECs）通过基因表达的聚类分析，这些内皮细胞被使用UMAP分为六个簇。这些簇包括：簇0，包含动脉和毛细血管内皮细胞；簇1，包含心内膜细胞；簇2，包含静脉和淋巴内皮细胞；簇3，包含弓形内皮细胞；簇4，包含增殖的内皮细胞；簇5，包含丰富囊泡的内皮细胞（图4b）。所有簇中均表达内皮标记基因cdh5（图4c）。Notch配体dlc在动脉、毛细血管内皮细胞和弓形内皮细胞中高度表达（图4d）。dab2和prox1主要富集于静脉和淋巴内皮细胞中（图4e和f）。细胞周期调节的关键因子cdk1专门在增殖的内皮细胞中表达（图4h）。结果显示，在高葡萄糖处理的胚胎中，动脉和毛细血管内皮细胞以及增殖内皮细胞的比例增加（图4i和j），这与观察到的葡萄糖处理导致ISVs的过度芽生血管生成一致。此外，我们还检查了动脉和毛细血管内皮细胞中的尖细胞标记基因。结果表明，高葡萄糖处理后，esm1、cxcr4a和apln的表达显著上调（图3h–k），与我们观察到的高葡萄糖处理诱导内皮细胞向尖细胞样细胞分化的现象一致（图3f和g）。我们还在高D-葡萄糖和L-葡萄糖处理后进行了整个胚胎转录组测序。我们分析并比较了对照组、高D-葡萄糖处理组和高L-葡萄糖处理胚胎的差异表达基因（DEGs）。结果显示，与对照组相比，高D-葡萄糖处理和高L-葡萄糖处理的胚胎中分别有1259和1074个基因显著上调（图4—补充图3）。之后，我们分析了与代谢通路相关的基因表达，发现几种参与糖异生、糖酵解和氧化磷酸化的基因表达发生了显著变化（图4—补充图4）。Foxo1a在动脉内皮细胞和小血管内皮细胞中的表达显著下调为了确定导致葡萄糖处理后胚胎中动脉和毛细血管内皮细胞（ECs）比例增加的潜在分子，我们分析和比较了对照组和葡萄糖处理组动脉和毛细血管ECs中的差异表达基因（DEGs）。结果显示，有1201个基因显著上调，523个基因显著下调（图5a）。基因本体论（GO）分析表明，这些DEGs在多个生物过程中富集，包括肌动蛋白丝组织的调节、血管形态发生、发育、血管生成等（图5b）。![]()
图5 Foxo1a参与了高糖处理诱导的过度血管生成随后，我们在参与上述生物过程的基因中搜索可能参与诱导过度血管生成的转录因子。已有报道指出，foxo1a的功能丧失会导致过度血管生成。本研究还发现，与ECs标志基因pecam1相比，高糖处理后动脉和毛细血管ECs中的foxo1a显著下调（图5c–e）。原位杂交（ISH）实验进一步证实了在高D-葡萄糖和L-葡萄糖处理后foxo1a表达的降低（图5f）。为了验证foxo1a的下调是否导致斑马鱼胚胎中过度血管生成，我们针对foxo1a进行了功能丧失实验。向48小时受精后（hpf）的斑马鱼胚胎注射AS1842856，这是一种据报道可阻断FOXO1转录活性的细胞通透性抑制剂，并在72hpf时进行成像。结果显示，与对照组相比，AS1842856处理组胚胎中的血管生成显著过度，这与foxo1a反义寡核苷酸（MO）注射所得结果一致（图5g–i）。为了进一步验证高糖诱导的过度血管生成是由于Foxo1a缺乏所致，我们进行了拯救实验。具体而言，我们分别在全胚胎或内皮细胞（ECs）中过表达了foxo1a，分别由hsp70l和fli1EP启动子驱动。我们将过表达构建体注射到一细胞期胚胎中，随后在24小时受精后（hpf）和48hpf进行热激处理。然后，从48hpf到96hpf用高糖处理胚胎（图6a）。结果表明，无论是在全胚胎还是ECs中，foxo1a功能的获得都显著且部分缓解了高糖处理诱导的过度血管生成（图6b–j）。![]()
图6 Foxo1a功能获得可以部分挽救高糖处理引起的过度血管生成单糖通过foxo1a-marcksl1a途径诱导过度血管生成先前的一项研究报道，斑马鱼内皮细胞（ECs）中marcksl1a的过表达导致丝状伪足形成显著增加，这与我们观察到的高糖处理后的表型相似。我们对单细胞测序数据的分析显示，与ECs标志基因kdrl相比，高糖处理后动脉和毛细血管ECs中的marcksl1a显著上调（图7a和b）。实时定量聚合酶链式反应（qPCR）和原位杂交（ISH）实验进一步证实了高D-葡萄糖和高L-葡萄糖处理后marcksl1a表达水平的升高（图7c和d）。然后，我们通过构建转基因斑马鱼品系hsp70l:marcksl1a-p2A-mCherry::Tg(fli1a:EGFP-CAAX) ntu666，在斑马鱼中过表达marcksl1a，并随后观察血管发育表型。在24小时受精后（hpf）进行1小时的热激处理，并在72hpf进行共聚焦成像分析，结果显示，与对照组相比，过表达marcksl1a的胚胎中血管形成显著增加（图7e–g）。![]()
图7 Marksl1a过表达在斑马鱼胚胎中诱导了过度血管生成根据marcksl1a过表达和foxo1a功能丧失的结果，我们假设marcksl1a可能是Foxo1a的靶基因。因此，我们研究了Foxo1抑制对斑马鱼胚胎中marcksl1a表达的影响。不出所料，qPCR分析显示，用AS1842856抑制Foxo1a导致marcksl1a表达上调。相反，Foxo1a过表达导致marcksl1a下调（图8a–c），这表明Foxo1a可能在斑马鱼中负向调控marcksl1a转录。为了进一步证实这一点，我们进行了染色质免疫沉淀（ChIP）实验，以验证Foxo1和marcksl1a之间潜在的结合相互作用。由于斑马鱼和小鼠之间Foxo1的氨基酸序列和DNA结合基序高度保守（图7—附图1），我们分析了marcksl1a的3kb启动子区域，以搜索JASPAR数据库中呈现的小鼠FOXO1的结合位点（BS）序列。在marcksl1a转录起始位点（TSS）上游的-265至-275（BS1）和-153至-163（BS2）核苷酸处发现了两个候选BS（图8d），然后用于ChIP-PCR检测。结果表明，Foxo1a在斑马鱼中marcksl1a的两个预测结合位点处均富集（图8e）。荧光素酶报告基因实验也表明，Foxo1a可以在斑马鱼中负向调控marcksl1a转录（图8f和g）。![]()
图8 非热量单糖通过foxo1a-marcksl1a信号在斑马鱼胚胎中诱导过度血管生成此外，我们将marcksl1a的形态发生寡核苷酸（MO）显微注射到一细胞期的Tg(fli1a:EGFP-CAAX) ntu666胚胎中，然后用高浓度的D-葡萄糖和L-葡萄糖处理这些胚胎。结果发现，敲低Marcksl1a可以有效地缓解由高D-葡萄糖或高L-葡萄糖处理引起的过度血管生成，这与使用血管内皮生长因子受体（VEGFR）抑制剂乐伐替尼观察到的拯救效果相似（图8h–n，图7—附图2）。这些结果表明，在斑马鱼胚胎中，单糖通过Foxo1a-marcksl1a途径诱导过度血管生成。在本研究中，我们成功建立了一个新的斑马鱼模型，该模型表现出显著的过度血管生成，与先前建立的模型相比，该模型在形态上更接近于增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）所观察到的过度血管生成特征。Jung等描述了一个由高糖诱导的糖尿病视网膜病变（DR）的短期斑马鱼模型，该模型表现出血管缺陷。然而，这些缺陷仅限于紧密连接的破坏和玻璃体视网膜血管的扩张，并未观察到PDR和我们所建立的模型中出现的过度血管生成和血管阻塞。此外，尽管Jörgens等观察到起源于背侧纵行静脉（ISVs）上部的小血管结构过度分支，水平生长并部分连接到邻近的ISVs区域，但这些血管生成的芽生并未形成我们在研究中观察到的更复杂结构。不成熟血管的过度发育是糖尿病视网膜病变和肾病进展过程中的重要病理状况。高血糖被认为是导致血管损伤（包括过度血管生成）的最主要原因之一。然而，高血糖损害血管的确切机制尚不完全清楚。我们分析了从D-葡萄糖处理的胚胎中分离出的内皮细胞（ECs）的单细胞转录组测序数据，以更深入地了解这一点。结果发现，D-葡萄糖处理的胚胎内皮细胞中，尖端细胞和增殖的内皮细胞比例增加，同时伴有多种血管生成基因表达的改变。Foxo1已被证实对于维持内皮细胞（ECs）的静止状态至关重要，并参与代谢调节。此外，它在糖尿病微血管并发症中也发挥着重要作用，包括糖尿病视网膜病变（DR）。在本研究中，我们通过结合单细胞转录组测序数据分析和实验验证，确定了转录因子Foxo1a，它在高糖处理的胚胎中显著下调，是导致过度血管生成的关键因素。此外，我们的结果进一步揭示，无论胚胎是用D-葡萄糖还是L-葡萄糖处理，Foxo1a都通过下调其靶基因marcksl1a来发挥其在该过程中的调节作用。综上所述，我们的结果表明，无论是提供热量的单糖还是非热量的单糖处理，都可以通过foxo1a-marcksl1a途径促进静止的内皮细胞分化为尖端细胞，从而导致过度血管生成。先前的研究已将人工甜味剂（ASB）的摄入与心血管疾病的发生和发展联系起来。然而，这一关联背后的潜在机制尚未得到充分证实。近年来，有人提出ASB与心血管疾病之间存在正相关关系，这可能是由于几个合理的因素，包括ASB对中枢神经系统回路、肠激素分泌和肠道微生物群的潜在影响。此外，还有假设认为ASB可能刺激食欲并增加热量摄入。长期以来，关于特定糖类如何影响2型糖尿病的发展，而非单纯由过量热量引起，一直存在着广泛的争议和不同的观点。在本研究中，我们提供了新的证据，表明非热量单糖的摄入会导致显著的过度血管生成，这表明过度血管生成可能不仅仅归因于热量的特性。由于过度血管生成是糖尿病视网膜病变和肾病的主要病理特征，我们的研究结果支持了非热量单糖与2型糖尿病相关微血管并发症之间存在正相关关系的可能生物学机制，这表明非热量单糖可能不适合作为人工甜味剂（ASB）来消费。令人惊讶的是，在处理过的胚胎的血管中，包括乳糖、麦芽糖和蔗糖在内的二糖并未观察到明显的异常，这与先前的研究结果一致，该研究表明蔗糖、乳糖和麦芽糖的摄入与2型糖尿病的风险没有显著相关性。这一发现意味着单糖所诱发的影响不能归因于周围介质的渗透压。此外，尽管这些二糖有可能转化为单糖，但有限的反应速率可能使它们在短时间内保持在安全浓度范围内，从而不会对血管造成损害。综上所述，为了研究单糖对血管发育的影响，我们通过用高浓度的单糖处理胚胎建立了斑马鱼模型。基于该模型，我们观察到葡萄糖和非热量单糖能显著诱导过度血管生成，这一过程始于将静止的内皮细胞（ECs）激活为增殖的尖端细胞。随后，我们证明了单糖诱导过度血管生成的作用是通过foxo1a-marcksl1a途径介导的。这些结果为非热量单糖在人类健康中的作用及其潜在机制提供了新的见解。斑马鱼
斑马鱼的饲养和繁殖按照之前描述的方法进行。动物实验遵循当地机构法规和中国动物保护法。实验中使用了以下转基因品系：Tg(fli1aEP:EGFP-CAAX)ntu666和Tg(kdrl:ras-mCHerry)。通过自然交配获得胚胎，并在28.5°C下培养。斑马鱼胚胎的发育阶段按照之前描述的定义进行划分。为了后续的成像分析，胚胎用0.2 mM的1-苯基-2-硫脲（PTU，Sigma，P7629）处理以阻止色素沉着。D-葡萄糖（Sigma, G7021-100g）、L-葡萄糖（Sigma, G5500-1g；J&K, 981195-1g）、D-果糖（Sigma, F0127-100g）、L-鼠李糖一水合物（Aladdin, R108982）、D-山梨糖醇（Sigma, S1876-100g）、D-甘露糖醇（Sigma, M4125-100g）、D-(-)-核糖（Sigma, V900389-25g）、L-(+)-阿拉伯糖（Sigma, V900920-25g）、甘露糖（Sigma, M2069-25g）和蔗糖（Sigma, V900116-500G）溶解在E3溶液中。将24小时受精后（hpf）至48小时受精后的斑马鱼胚胎置于24孔板中（每孔10个胚胎），并在预设的浓度和时间窗口内浸泡在溶液中。然后，将其置于28°C的培养箱中培养。在胚胎发育前五天，使用立体荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察血管表型的变化。对于药物治疗，将胚胎在预设的浓度和时间窗口内与葡萄糖和乐伐替尼（Selleck, S1164-5MG）共同孵育。Foxo1抑制剂AS1842856（MCE, HY-100596）溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，并储存在–80°C，使用时用E3溶液稀释至1 μM。使用相同浓度的DMSO作为阴性对照。胚胎中的葡萄糖浓度测定按照之前描述的方法进行。选择发育至75%外包期的胚胎，并将其转移至24孔板中（每孔10个胚胎），在预设的浓度和时间窗口内浸泡在溶液中。为了测定葡萄糖浓度，将20个胚胎转移至新的1.5 mL离心管中，用1×磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗三次，并置于冰上以备后续实验。尽可能弃去PBS，使用手动匀浆器将胚胎匀浆，并以14,000×g离心10分钟。取1.5 μL上清液，使用血糖仪（Baye, 7600P）测定总游离葡萄糖水平。整体ISH和反义RNA探针的制备按照之前的协议进行。简而言之，使用野生型胚胎（AB）cDNA文库和下面列出的特异性引物克隆marcksl1a和foxo1a的cDNA片段。使用体外DIG-RNA标记转录试剂盒（Roche, 11175025910）以线性化的含有marcksl1a或foxo1a基因片段的pGEM-T easy载体为模板合成探针。使用氯化锂（Invitrogen, AM9480）纯化合成的探针，并将其稀释至1 ng/µL用于杂交。收集斑马鱼胚胎，用4%多聚甲醛在4°C下固定过夜，然后用甲醇梯度脱水，并在100%甲醇中于–20°C下保存。杂交结果使用抗DIG-AP抗体（1:2000, Roche, 11093274910）和NBT/BCIP（1:500, Roche, 11681451001）进行检测。杂交后，使用Olympus立体显微镜MVX10拍摄胚胎图像。引物序列如下：marcksl1a-probe-forward: 5’- AGG ATG GGT GCT CAG TTG AC-3’marcksl1a-probe-reverse: 5’- GCT GGC GTC TCA TTG GTT TC-3’foxo1a-probe-forward: 5’-GCA ACA CAG GAT TTC CCC AC-3’foxo1a-probe-reverse: 5’-CAC AGG TGG CAC TGG AAG G-3’Cell Ranger 3.0.2（https://github.com/10XGenomics/cellranger）被用于将原始测序数据转换为单细胞水平的基因计数矩阵。单细胞的聚类以及每个聚类中的标志基因由Seurat 3.0（Stuart等，2019年）进行分析。在筛选单细胞时，我们采用了几个标准，包括仅保留至少在三个单细胞中表达的基因（UMI大于0），选择表达基因数量在500到3000之间的单细胞，并要求线粒体基因组的测序读取比例小于5%。此外，我们还采用了sctransform方法（https://satijalab.org/seurat/install.html）来去除技术变异，并使用ClusterProfiler基于每个细胞聚类的标志基因进行GO富集分析。有关数据处理的详细信息，可以在此项目的源代码中找到（https://github.com/gangcai/ZebEndoimmune）。使用TRIzol试剂（Invitrogen，货号15596026）从斑马鱼胚胎中提取总RNA，并储存在-80°C冰箱中。然后，根据制造商的说明，使用HiScript II Q RT SuperMix for qPCR Kit（Vazyme，货号R223-01）合成cDNA。在实时PCR检测系统（StepOne Real-Time PCR Systems）上，使用Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme，货号Q712-02）进行三次重复的qPCR实验。用于实时PCR分析的引物序列如下：ef1α-Qpcr-F: 5’- CTT CAA CGC TCA GGT CAT CA -3’ef1α-Qpcr-R: 5’- CGG TCG ATC TTC TCC TTG AG -3’marcksl1a-Qpcr-F: 5’- CCG TGG CTG ATA AAG CCA AT -3’marcksl1a-Qpcr-R: 5’- CTC CCT CCT CCG TTT TTG GG -3’Tg(fli1aEP:EGFP-CAAX)ntu666品系是通过使用MultiSite Gateway技术和tol2试剂盒构建的fli1aEP:EGFP-CAAX结构而建立的。5’Entry p5Efli1ep（#31160）购自Addgene，最初来源于Nathan Lawson实验室。通过LR重组反应（如MultiSite Gateway手册所述）使用三个入门克隆和pDestTol2pA2目的载体生成表达结构。表达结构由GENEWIZ公司合成。将斑马鱼胚胎置于37°C水浴中1小时进行热激处理。将大约75pg表达质粒DNA和25pg tol2转座酶mRNA预混合后显微注射到单细胞受精卵中。在热激处理后72小时（hpf），收集注射了hsp70l:foxo1a-6×His-P2A-mCherry的胚胎。根据制造商的说明，使用ChIP试剂盒（Millipore, 3753379）进行ChIP-PCR实验。使用5μg抗6×His标签抗体（abcam, ab213204）免疫沉淀与Foxo1a蛋白结合的基因组DNA。使用抗IgG抗体作为阴性对照。使用KODfx（TOYOBO, KFX-101）在以下条件下进行半定量PCR：94°C预变性5分钟；35个循环，每个循环包括98°C变性10秒，55°C退火30秒，68°C延伸10秒；最后68°C延伸10分钟。用于预测结合位点（BS）的PCR引物如下：marcksl1a-BS1-正向：5’- CCC TTT TTC AAA AGT GAG TTT GAG -3’marcksl1a-BS1-反向：5’- GGA GCT TCA TCT GCC CCA TT -3’marcksl1a-BS2-正向：5’- CGG TTT CCA GCT TTC TTC AGA A -3’marcksl1a-BS2-反向：5’- TCT CAA ACT CAC TTT TGA AAA AGG G -3’荧光素酶报告基因检测使用了Promega公司的PGL4.10[luc2]和PGL4.74[hRluc/TK]质粒。将含有预测Foxo1a结合位点的斑马鱼marcksl1a启动子片段克隆并插入到pGL4.10基本载体中，使用Kpn I和Hind III进行酶切连接。检测Foxo1a对启动子活性的影响的实验按照先前的研究进行。简而言之，将50pg的PGL4.10载体、1pg的PGL4.74载体和50pg的foxo1a mRNA或20pg的foxo1a反义寡核苷酸（MO）共同注射到单细胞阶段的野生型胚胎中。然后，在24小时孵化后（hpf）收集胚胎，根据制造商的协议（Promega）测量其荧光素酶活性。为了对荧光蛋白标记的转基因斑马鱼胚胎中的血管进行共聚焦成像，使用含有0.16 mg/mL MS222（Sigma, A5040）/1%苯基硫脲（PTU）的卵水对胚胎进行麻醉，并将其嵌入0.5–0.8%的低熔点琼脂糖中。使用Nikon A1R HD25共聚焦显微镜进行共聚焦成像。使用Nikon-NIS-Elements软件进行图像分析。明场图像使用Olympus DP71相机在Olympus MVX10体视显微镜下拍摄。统计分析采用Student’s t检验。所有数据均以平均值±标准误（SEM）表示；p<0.05被认为具有统计学显著性。原文地址：https://elifesciences.org/articles/95427
注：因文章篇幅有限，所有相关引用文献，以及补充素材可以点击至原文查阅。
苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过六年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。![]()
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