![]()
题目
斑马鱼作为糖皮质激素受体研究的模式系统
摘要
糖皮质激素调节着多种生理过程，广泛应用于临床作为抗炎药物。它们的作用由糖皮质激素受体（Glucocorticoid Receptor，GR）介导，GR是一种配体激活的转录因子。目前，斑马鱼胚胎正逐渐被开发为GR研究的模式系统，因为它们在遗传上容易操作，且由于其透明的身体，可以轻松观察表型。此外，斑马鱼的GR基因与人类的GR基因具有相对较高的相似性。首先，斑马鱼和人类基因组中都只包含一个编码GR的基因，而在迄今为止研究的其他鱼类中发现了两个GR基因。其次，斑马鱼含有一个与人类GRβ高度相似的C末端GR剪接变体，已知该变体是经典GRα的显性负性抑制剂，可能与糖皮质激素耐药性有关。因此，斑马鱼胚胎可能是糖皮质激素受体研究的有用模式系统，但目前可用的工具数量有限。在本综述中，我们讨论了哪些工具可用，哪些工具需要开发，以便充分发挥斑马鱼作为GR研究模式系统的潜力。关键词：
1. 引言
在本综述中，我们将讨论如何利用斑马鱼（Danio rerio）作为动物模型系统，促进糖皮质激素受体（Glucocorticoid Receptor，GR）研究的发展。斑马鱼不仅在GR作用的分子机制基础研究中是一种宝贵的工具，还可以应用于糖皮质激素药物筛选等应用研究中。我们将展示斑马鱼作为GR研究模型系统的优势。然而，斑马鱼大多被用于发育生物学领域的研究，因此用于研究GR的若干特定工具仍然缺乏。我们将概述当前可用的工具以及需要开发的工具，以便充分发挥斑马鱼在GR研究中的潜力。1.1 糖皮质激素与糖皮质激素受体
糖皮质激素是类固醇激素，由肾上腺在应激反应后及按照昼夜节律分泌。在人类和鱼类中，主要的内源性糖皮质激素是皮质醇（Cortisol），而在啮齿动物中，主要的糖皮质激素是皮质酮（Corticosterone）。这些激素调节广泛的生理过程，如免疫反应、神经活动与行为、新陈代谢以及骨骼形成。它们以抗炎作用闻名，并且广泛用于临床治疗与免疫相关的疾病，如哮喘和类风湿性关节炎。糖皮质激素的合成类似物是全球处方量最多的药物之一。糖皮质激素的作用通过细胞内的糖皮质激素受体（Glucocorticoid Receptor，GR）介导。GR属于类固醇受体家族，而类固醇受体家族则隶属于核受体超家族。与所有核受体一样，GR作为配体激活的转录因子，其结构在脊椎动物物种中高度保守。GR包括一个大的N末端区域，参与转录激活，DNA结合区域较小，包含两个锌指结构，还有C末端的配体结合区域。在没有激素时，GR位于细胞质中，并与热休克蛋白和免疫亲和素形成复合物。当配体与GR结合时，受体从复合物中解离并转移到细胞核内。在细胞核中，活化的GR能够结合到靶基因启动子区域的糖皮质激素反应元件（Glucocorticoid Response Elements，GREs），并与转录辅因子相互作用，从而激活下游基因的转录，这一过程称为转录激活（Transactivation）。或者，GR也可以抑制由其他转录因子如核因子κB（NF-κB）和活化蛋白-1（AP-1）引发的基因表达，这一过程称为转录抑制（Transrepression），构成了糖皮质激素抗炎作用的基础，因为这些转录因子参与了许多促炎基因的转录。虽然转录抑制的确切机制尚未完全阐明，但GR与其他转录因子的物理相互作用以及特定转录辅因子的招募似乎在其中起到了作用。1.2 斑马鱼作为模式生物
斑马鱼相较于其他脊椎动物模式系统有许多优势。斑马鱼体型小，易于在实验室条件下饲养，并且繁殖能力强。每条雌鱼每天可以产下数百个卵，这些卵在体外受精后发育迅速，大多数器官系统在受精后5天内便已形成。由于体外发育，斑马鱼胚胎很容易通过显微注射DNA、mRNA或形态素进行短暂的遗传操作，MO是反义DNA寡核苷酸，可以通过阻断特定的翻译起始位点或剪接供体或受体位点来改变胚胎发育中的蛋白质合成。胚胎透明，这使得在亚细胞水平上进行显微成像成为可能，尤其是在与特定细胞或蛋白质的荧光标记结合使用时。此外，越来越多的转基因和突变斑马鱼品系可供使用，此外还有几种从胚胎和成体组织衍生的斑马鱼细胞系，这些工具可以作为一种互补工具，用于更精细的生化表征。斑马鱼基因组目前几乎是完整的，可在Ensembl网站的zv7版本上获取。70%的基因组已被测序，准确率超过99.999%。其余部分采用所谓的全基因组鸟枪测序方法，覆盖率为5.5倍。该序列数据库已与双倍体斑马鱼系的基因数据进行了比较。2. 斑马鱼的糖皮质激素受体
2.1 斑马鱼中的单一GR基因
大多数硬骨鱼类包含两个糖皮质激素受体（Glucocorticoid Receptor，GR）基因，这是在鱼类进化过程中350至400百万年前发生的基因组重复的结果，该重复发生在鱼类与四足动物分支分化之后。这两个受体蛋白被称为GR1和GR2。在某些鱼类物种中，如虹鳟鱼、Burton's mouthbrooder、绿斑河豚、鲤鱼和海鲈鱼，已确定存在这些异构体。在其他鱼类物种中，例如日本比目鱼和褐鳟鱼，迄今只发现了一个GR基因，但尚不清楚它们是否含有第二个GR基因，因为这些鱼类物种的研究较少。鱼类GR1和GR2基因的组织结构与人类GR基因的组织高度相似。它们由9个外显子组成，其中第一个外显子完全不编码，第九个外显子包含3'UTR。已证明GR1基因在第3和第4外显子之间发生可变剪接，导致DNA结合域中两个锌指之间插入了9个氨基酸，从而降低了受体的DNA结合亲和力（较长的GR1异构体被称为GR1a，而较短的形式为GR1b）。在蛋白质水平上，鱼类GR与人类GR表现出高度的相似性。在配体结合域中，鱼类GR的氨基酸与人类GR之间的相似性介于85%到95%之间，而在DNA结合域中，这个数字在大多数研究的鱼类GR中超过了98%。GR1和GR2似乎都能在含有糖皮质激素反应元件（Glucocorticoid Response Elements，GREs）的启动子上诱导转录，但引发转录激活的浓度差异很大。在体外报告基因实验中，GR1的皮质醇（Cortisol）半数有效浓度（EC50）比GR2高约65倍，类似的结果也在Burton's mouthbrooder和鲤鱼中得到了验证。因此，推测GR2在低水平的基础皮质醇时活跃，而GR1是‘应激受体’，在循环皮质醇浓度较高时活跃。GR1和GR2的表达在应激和免疫挑战后表现出不同的调控，这进一步暗示了它们在生理功能上的不同角色。令人惊讶的是，斑马鱼基因组中仅包含一个GR基因。几项研究都支持这一发现，并提供了三方面的证据。首先，使用其他鱼类GR作为查询，在斑马鱼基因组的最新版本中进行BLAST搜索，找到了斑马鱼的所有类固醇受体和许多其他核受体，但未发现第二个GR基因。其次，在GenBank中搜索斑马鱼GR基因衍生的转录本，揭示了14个潜在的斑马鱼GR cDNA和EST序列，但进一步分析表明，这些序列都是从已识别的单一GR基因转录的。第三，对鱼类GR基因的同源区域分析表明，斑马鱼GR基因周围的基因组区域保存良好，与河豚、绿斑河豚、青鳉和刺鱼GR2基因周围的区域高度相似。这表明GR1基因在斑马鱼进化过程中已经丧失，斑马鱼GR在系统发育树中聚集在鱼类GR2类群中。GR1基因的丧失发生在斑马鱼进化的较晚阶段，因为鲤鱼（与斑马鱼同属于鲤科）已被证明含有两个GR基因。![]()
图1. 人类和斑马鱼GR的比较
A. 人类和斑马鱼GR α-异构体的相似性。α-异构体代表经典的、规范的GR。它包含一个大的N末端区域、DNA结合域（DBD）和配体结合域（LBD）。百分比表示每个结构域中人类和斑马鱼之间相似的氨基酸比例。总体相似性水平为59.3%。
B. 人类和斑马鱼GR基因。两者的基因都包含9个外显子，其中外显子1是非编码的。一个显著的区别是编码β-异构体特异性氨基酸的序列位置。在人类基因中，这个序列位于外显子9，而在斑马鱼基因中，它位于外显子8。在斑马鱼中，使用外显子8中最靠近5′端的剪接供体位点，结果产生了较短版本的外显子8，并生成包括外显子9的开放阅读框，产生编码zGRα的mRNA（GenBank登记号：EF436284）。使用最靠近3′端的位点产生了外显子8的扩展版本，在外显子8中引入了终止密码子，生成zGRβ的mRNA（EF436285）。斑马鱼GRα和GRβ蛋白在氨基酸1到696之间是相同的，另外40个特定氨基酸构成了zGRβ的C末端。
2.2 斑马鱼的GR β-异构体
斑马鱼GR基因的另一个显著特征是其可变剪接的可能性，这产生了一个GR异构体，该异构体在N末端域、DNA结合域和大部分配体结合域与经典GR相同，但在C末端包含不同的氨基酸序列。该异构体被称为斑马鱼GRβ（zGRβ），因为它与人类GRβ（hGRβ）高度相似。人类GRβ是外显子9中可变剪接的结果。此异构体在1到727号氨基酸之间与经典GR（hGRα）相同，之后则有所不同。人类GRβ含有额外的15个C末端氨基酸，与hGRα C末端的50个额外氨基酸无同源性。人类GRβ不与糖皮质激素激动剂结合，主要定位于细胞核内。体外报告基因实验表明，hGRβ不在含有糖皮质激素反应元件（GREs）的启动子上诱导转录，而是作为hGRα转录激活特性的显性负性抑制剂。与这种显性负性活性相一致的是，患有多种免疫相关疾病的患者对糖皮质激素治疗的耐药性与hGRβ表达水平的增加有关。此外，溃疡性结肠炎、白血病和重症哮喘等疾病的发生也与此GR异构体在各种免疫细胞中的表达增加有关。然而，一些问题仍然没有得到解决。多位研究者未能在体外重复hGRβ的显性负性活性。此外，体外实验中观察到的hGRβ显性负性活性的高表达水平与其在体内的低表达水平形成鲜明对比，这使得体外结果的相关性受到质疑。最近的一项研究表明，hGRβ可能独立于hGRα调节基因转录，并且这种活性可以通过合成GRα拮抗剂RU486（已被证明能结合hGRβ）进行调节。还有人建议，hGRβ可能作为以配体依赖方式由hGRα转录抑制的基因的持续性转录抑制剂。直到最近，GR β-异构体仅在人类中发现，并已证实其在啮齿动物中缺失。因此，直到斑马鱼中GR β-异构体的发现之前，尚无动物模型可以帮助解决上述问题。斑马鱼GR β-异构体在结构、功能和表达水平上与其人类同源体相似。斑马鱼GR α-和β-异构体在氨基酸1到696之间是相同的。40个特定氨基酸形成了zGRβ的C末端，这些氨基酸与zGRα C末端的57个特定氨基酸没有同源性。人类和斑马鱼GR的序列比对显示，α-和β-异构体的分化点在人类和斑马鱼中是相同的。在报告基因实验中，zGRβ已被证明是zGRα转录激活活性的显性负性抑制剂，类似于hGRβ对hGRα诱导的转录的抑制作用。在成年斑马鱼和胚胎中，zGRβ的mRNA表达水平明显低于zGRα的mRNA水平，低了10至100倍，这与在多种人类组织和细胞中观察到的hGRβ相对于hGRα的mRNA较低表达水平类似。![]()
图2. 硬骨鱼类和四足动物GR的系统发育树
蛋白质序列通过翻译cDNA序列或预测的mRNA序列生成。只有当完整的编码序列可用时才使用这些序列（参见Schaaf等，2008）。使用ClustalW软件（版本1.83，网址：http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-e.html）进行比对，使用默认参数。斑马鱼GR聚集在硬骨鱼类GR的GR2分支内。3. 斑马鱼作为GR研究的模式系统
斑马鱼在至少两类糖皮质激素受体（Glucocorticoid Receptor，GR）研究中可能是一个宝贵的工具。首先，斑马鱼可以用于推进我们对体内GR激活效应的分子机制的了解。通过结合用于短暂或稳定的遗传操作技术与基于成像的表型读出系统，斑马鱼可以用来分析特定分子机制如何改变活体脊椎动物的表型。这些大多数基于表型的分析通常基于对斑马鱼胚胎中荧光细胞的成像，这种方法可以用于相对较多的个体。其次，斑马鱼的潜力可以用于新药和药物靶点的发现研究。由于斑马鱼体型小且适合成像研究，它可能是筛选新型糖皮质激素药物的理想工具。这些筛选实验可以作为高通量药物筛选实验（通常在细胞培养中进行）与后续哺乳动物模型（如啮齿动物）研究之间的一个额外步骤。通过这种方式，那些在体内研究中表现出无效的化合物能够在早期阶段被筛选出，从而减少需要在哺乳动物模型中测试的化合物数量。此外，通过以糖皮质激素反应性为读出系统的前向遗传筛选，可能会发现新的药物靶点，这些靶点可以被开发为提高糖皮质激素治疗效果的药物靶点。4. 斑马鱼GR研究的工具
由于目前在斑马鱼中对糖皮质激素受体（Glucocorticoid Receptor，GR）的研究较少，可用于研究斑马鱼GR功能的工具有限。表1列出了这些工具，并将在下面简要讨论。![]()
4.1 分子遗传工具
一些可能对GR研究感兴趣的突变斑马鱼品系已经可用。其中一个突变斑马鱼品系携带视网膜同源盒基因3（rx3）的突变，导致垂体中促皮质素细胞丢失，皮质醇水平显著降低。此外，还存在其他缺乏皮质醇的突变体，如纤维母细胞生长因子3（lia/fgf3）突变体和achaete scute-complex like 1a（pia/ascl1a）突变体，这些突变体缺乏整个垂体。另一种突变体为眼消失1（aal/eya1），其垂体中仅含有催乳素细胞。此外，还进行了一些相关的形态素研究。通过形态素减少cyp11a1基因表达（该酶将胆固醇转化为类固醇生物合成路径中的第一个中间产物孕烯醇酮）来瞬时敲低类固醇生物合成，导致严重的发育缺陷，但尚不清楚是哪一类类固醇导致了这种效应。在另一项研究中，使用形态素敲低GR功能，通过阻断外显子6的5'端剪接受体位点，导致缺少该外显子的GR转录本。这种剪接变化产生的mRNA编码的GR蛋白缺少配体结合域（LBD），在更详细的解释中，该蛋白与野生型斑马鱼GR在前552个氨基酸处相同，并含有另外3个氨基酸。注射这种形态素未导致任何明显的早期发育缺陷，表明GR对早期胚胎发育不是必需的。然而，这并不意味着GR功能的改变不会影响胚胎发育，因为据报道，在发育的最初几天内使用糖皮质激素治疗会导致颅面异常、体节生成变化、血液聚集以及心包和卵黄囊水肿。zGRα和zGRβ的mRNA表达水平可以通过qRT-PCR测定，表达模式已通过原位杂交进行研究。蛋白水平的检测则通过使用抗人GR抗体（p-20，由Santa Cruz公司提供）进行的Western blot实验，该抗体针对受体的C末端，因此特异性识别GR α-异构体。在我们的实验室中，我们使用这种抗体对24小时受精后的胚胎进行了免疫组化实验（见图3）。![]()
图3. 24小时受精后胚胎的整体免疫组化
使用针对人类GRα C-末端的抗体（p-20，Santa Cruz Biotechnology Inc.）。在免疫染色中未观察到空间限制，这与之前描述的in situ杂交数据一致（Schaaf等，2008）。特定GR靶基因表达的改变可以作为GR活性的读出指标。在斑马鱼胚胎中，通过qRT-PCR检测发现糖皮质激素处理后，GR的常见靶基因FK506结合蛋白5（FKBP5）、糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链蛋白（GILZ）和sox9b表达上调，基质金属蛋白酶-2、-9和-13（注：mmp2， 9， 13）的诱导也已得到证明。在我们的实验室中，我们组建了一个包含六个GR靶基因的小型基因面板，其中三个基因（FKBP5、IκBα和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK））在1日龄胚胎中地塞米松处理后表达上调，而另外三个基因（白介素-8（IL-8）、白介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子α（TNFα））表达下调，因此我们拥有体内转录激活和转录抑制的读出指标。![]()
图4. 糖皮质激素诱导的基因表达变化在斑马鱼胚胎中的分析
在受精后28小时，胚胎在100 µM地塞米松中孵育6小时。提取总RNA，并使用特定引物组进行qRT-PCR分析所示基因的表达。地塞米松处理使三种基因表达上调（A），而三种基因表达下调（B）。在图B的实验中，胚胎在地塞米松处理期间与PMA和离子霉素共同孵育，以诱导所示基因的表达。4.2 基于表型的实验
在筛选糖皮质激素作用的实验中，其免疫抑制作用可以在体内进行评估。需要注意的是，斑马鱼胚胎仅含有先天免疫系统，而适应性免疫系统在受精后四周才出现。首先，可以筛选糖皮质激素在斑马鱼炎症模型中的作用。一个转基因鱼系可以用于实验，该鱼系在髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）启动子的驱动下表达绿色荧光蛋白（GFP），在中性粒细胞中表达GFP。这些细胞在受伤后迁移到损伤部位，这一实验范式被视为急性炎症的模型。用合成糖皮质激素倍氯米松处理胚胎，在尾部截肢后显著减少了迁移到损伤部位的中性粒细胞数量（消注：炎的模型）。一个由增强子捕获产生的转基因系在部分中性粒细胞中表达黄色荧光蛋白（YFP），另一个在部分巨噬细胞中表达GFP（由溶菌酶C启动子驱动的GFP表达），这些转基因系已经用于类似的免疫细胞迁移实验。此外，还存在其他转基因系，其中免疫细胞的亚群表达GFP。最近，还生成了一个用于慢性炎症模型的转基因斑马鱼系，该模型由肝细胞生长因子激活抑制因子1（hai1）基因突变引起，导致鳍中中性粒细胞的积累。然而，尚未在这些转基因系中测试糖皮质激素对标记免疫细胞行为的影响。其次，可以监测胸腺中的T细胞存在情况。一个转基因斑马鱼系在T细胞特异性酪氨酸激酶（lck）启动子的控制下表达GFP，导致T细胞被GFP标记。用糖皮质激素受体激动剂地塞米松处理该鱼系的胚胎，导致这些胚胎胸腺中的GFP标记T细胞被消除。另一个由重组激活基因2（rag2）启动子控制的GFP表达系（标记未成熟的T和B细胞）也显示了类似的结果。第三，存在几个斑马鱼感染模型，可以监测感染的状态。感染性病原体增殖的增加可以作为GR激动剂免疫抑制活性的指标。通过感染带有荧光标记的细菌，能够实时和原位分析感染。这种方法已成功用于海洋分枝杆菌和伤寒沙门氏菌的感染研究。除了用于糖皮质激素抗炎活性的筛选实验外，斑马鱼胚胎还可用于筛选糖皮质激素治疗的其他影响，如糖皮质激素治疗常见的副作用——骨形成减少。最近，基于使用钙结合染料（如钙黄绿素或茜素红）对斑马鱼幼虫的骨骼结构进行可视化，已经开发出一个糖皮质激素诱导的骨质疏松症斑马鱼模型。作为原理验证，用临床广泛使用的糖皮质激素泼尼松龙处理5日龄斑马鱼幼虫，在此实验中显著减少了骨形成。在这些实验中使用胚胎将筛选限制在成骨细胞的活性上，因为斑马鱼中的破骨细胞在20日龄个体中才开始出现（注：最近的研究， 最早破骨细胞在6dpf就能出现， 10dpf斑马鱼已经可以进行TRAP染色）。糖皮质激素治疗的另一个常见副作用是循环皮质醇水平的下降，这一效应也可以在斑马鱼中研究。可以通过免疫测定从不同年龄的斑马鱼胚胎池中测量总皮质醇水平。在受精后97小时后，可以检测到应激反应引起的皮质醇水平增加，并在受精后6天观察到皮质醇水平的昼夜节律。这表明下丘脑-垂体-肾间腺轴（HPI）在斑马鱼幼虫中功能正常，可以预期糖皮质激素治疗会导致循环皮质醇水平的下降。5. 结论与展望
总之，斑马鱼系统可能是研究糖皮质激素受体（GR）的有价值模式系统，不仅可以用于探究糖皮质激素受体作用的分子机制，还可以应用于药物发现研究。两项特性使其成为该类研究的理想系统。首先，斑马鱼GR与人类GR具有高度相似性。两者的基因组都只包含一个保存良好的GR基因，通过可变剪接可以生成GRα和GRβ两种受体异构体。其次，斑马鱼胚胎系统具有许多实际优势，如在脊椎动物中相对容易实现稳定或瞬时的遗传操作，并结合成像技术筛选大量个体的表型。尽管目前已经有一些分子遗传工具和筛选实验可用，但仍需要开发新的工具，以充分利用这一模型的机会。例如，通过TILLING（靶向诱导基因组局部损伤）方法生成GR基因敲除的斑马鱼系将是首要任务。在小鼠中，GR基因的破坏导致出生后因呼吸衰竭而迅速死亡，但GR信号的缺失可能对鱼类并非致命。超表达GRβ异构体的转基因鱼系将是研究该异构体体内效应的有用工具，尤其是如果其表达可以被诱导（例如使用热休克蛋白70启动子）或空间上受限（例如使用Gal4/UAS系统）。可以使用细菌人工染色体（BAC）修改策略制作转基因报告鱼系，该策略可克隆大型基因组区域，并将GFP编码序列插入特定基因的翻译起始位点。将这些序列插入斑马鱼基因组后，GFP的表达将由调控原始蛋白质表达的所有启动子/增强子元件驱动。通过使用像FKBP5或IL-8这样的GR响应基因，可以生成GR活性的报告鱼系，并用于筛选实验的读出指标。通过定制的斑马鱼特异性基因芯片和基因表达序列分析（SAGE）实验，可以获得糖皮质激素诱导的基因表达变化的更全面视角。最后，研究GR α和β异构体的定位和表达水平变化将需要特异性的斑马鱼GR抗体。https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1095643308012580?via%3Dihub
