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关于作者：Leonard I. ZoL
参考链接：https://hsci.harvard.edu/people/leonard-i-zon-md
个人简历
Leonard I. Zon博士是哈佛医学院的Grousbeck儿科医学教授，是霍华德·休斯医学研究所的研究员，并担任波士顿儿童医院干细胞项目的主任。他获得了穆罕默格学院的化学和自然科学学士学位，以及杰斐逊医学院的医学博士学位。随后，他在新英格兰浸信医院完成了内科住院医生培训，并在Dana-Farber癌症研究所进行医学肿瘤学的研究培训。Zon博士是国际干细胞研究学会的会长、美国临床调查学会的会长、斑马鱼基因组机构的外部研究员负责人以及哈佛干细胞研究所执行委员会的主席。Zon博士因其在干细胞生物学和癌症遗传学新领域的开创性研究而受到国际认可。他目前的研究集中在两个关键的研究方向：识别引导干细胞转变为癌症或发展为更专业的血液或器官细胞的基因，以及开发化学或遗传抑制剂以治愈癌症和其他多种致命疾病。Zon实验室的研究目标是解剖造血系统受到攻击时如何导致严重疾病，如白血病、淋巴瘤和贫血。他们通过化学筛选、基因筛选和分析斑马鱼中新型转基因株来研究造血发育和疾病。Zon实验室的研究重点是造血和癌症的发育生物学。在过去五年中，他们收集了超过30种影响造血系统的突变体，其中一些突变体是人类疾病的优秀动物模型。例如，基于一个突变斑马鱼的隔离发现了铁转运蛋白ferroportin，随后发现其在铁超载疾病患者中发生突变。这些突变体还代表了干细胞发育中一些有趣的关键调控步骤。最近发现的一种突变体缺乏血液干细胞，突变基因被证明是一个名为CDX4的尾部相关同源蛋白。研究发现Cdx-hox通路参与早期造血干细胞的发育，CDX4的过表达导致在斑马鱼胚胎和小鼠胚胎干细胞中出现异位血液发育。我们最近为斑马鱼开发了造血细胞移植技术，使用带有绿色荧光蛋白和DSred标记的血细胞。Zon实验室的研究人员能够成像造血细胞在迁移到骨髓和胸腺的过程。该小组还开发了斑马鱼癌症模型。对细胞周期突变体的筛选发现了19种突变体。这些突变体在致癌实验中以杂合体形式出现时，癌症发生率非常高。突变基因似乎是新的癌症基因，Zon使用小分子化合物进行化学抑制基因筛选，寻找可以绕过突变细胞周期问题的化学物质。实验室还利用转基因技术在斑马鱼系统中生成了黑色素瘤模型。转基因鱼产生色素痣，并在与p53突变鱼的组合中发展为黑色素瘤。题目
重复DNA元件的转录信号阻止了造血干细胞的吞噬作用。
摘要
巨噬细胞通过评估细胞表面钙网蛋白（Calreticulin, Calr）来维持造血干细胞（HSC）的质量，Calr是由活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）诱导的“吃我”信号。利用斑马鱼遗传学，我们确定了β-2微球蛋白（Beta-2-microglobulin, B2m）作为血液干细胞上的关键“不要吃我”信号。化学筛选发现，诱导表面Calr的化合物促进了HSC的增殖，而没有触发ROS或巨噬细胞清除。全基因组CRISPR-Cas9筛选显示， Toll样受体3（Toll-like receptor 3, Tlr3）信号调控B2m表达。靶向B2m或Tlr3降低了HSC的克隆性。升高的B2m水平与重复元件（RE）转录物的高表达相关。总体而言，我们的数据表明，RE相关的双链RNA可能与TLR3相互作用，以刺激造血干细胞和前体细胞表面B2m的表达。这些发现表明，Calr和B2m的平衡调节了巨噬细胞与HSC的相互作用，并定义了造血克隆性。前言
发育、组织完整性和对免疫挑战的防御需要有效清除受损和损伤的细胞。先天免疫细胞如巨噬细胞和中性粒细胞通过区分细胞表面表达的分子来协调这些死亡细胞的清除或吞噬。因此，吞噬过程需要谨慎调控，以避免不必要地消除健康细胞。细胞表面分子如补体、调理素、暴露的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）、钙网蛋白（Calreticulin, Calr）和annexin I作为“吃我”信号启动吞噬。这些表面分子在健康活细胞的表面并不高表达，除非在特定生理事件中。相反，β-2微球蛋白（Beta-2-microglobulin, B2m）等表面分子作为“不要吃我”信号，防止健康细胞在其表面同时呈现“吃我”分子时被不必要清除。来源于胚胎发育的造血干细胞（Hematopoietic Stem Cells, HSC）维持终生的组织稳态，而巨噬细胞的吞噬作用在确保新形成的造血干细胞和前体细胞（Hematopoietic Stem and Progenitor Cells, HSPC）的质量方面发挥着关键作用。HSPC表面呈现Calr作为“吃我”信号，诱导与巨噬细胞的相互作用。在相互作用过程中，巨噬细胞可能完全吞噬HSPC（消亡）或仅取样HSPC细胞材料的一小部分而不致其死。HSPC的消亡消除选定的干细胞克隆，而HSPC的整理 (grooming)可能通过激活白介素1β（Interleukin 1β, Il-1b）依赖性信号调节HSPC增殖。整理和消亡是清除发育过程中受压HSPC的重要质量控制步骤。尽管这些过程很重要，但巨噬细胞如何区分应消亡的HSPC和应整理的HSPC的机制仍然不明。通过活体成像和体内细胞条形码技术，我们在这里展示“吃我”和“不要吃我”信号之间的平衡由活性氧种（Reactive Oxygen Species, ROS）和Toll样受体3（Toll-like receptor 3, Tlr3）激活提供。这些信号决定了通过巨噬细胞介导的质量保证机制贡献于成人血液系统的长寿HSC克隆的数量。结果
Calr表达通过与ROS相关和无关的过程诱导。
HSPC中的ROS相关压力介导了“吃我”分子Calr的表面呈现。这种压力与FoxO信号相关，FoxO信号已知介导细胞对伪ROS的解毒。与所提议的质量控制机制类似，我们观察到高ROS的HSPC被巨噬细胞清除（消亡），而低ROS的HSPC则未被消亡，而是被促使在与巨噬细胞相互作用后继续分裂。我们评估了斑马鱼HSPC中的ROS水平，确认ROS水平升高与“吃我”信号Calr的表面呈现相关。相反，当我们通过使用ROS清除剂二苯基碘（DPI）和VAS2870减少HSPC中的ROS时，观察到表面Calr水平降低和巨噬细胞与干细胞的相互作用减少。这表明ROS水平和更高表面Calr水平，并可能与巨噬细胞和HSPC的相互作用相关。然而，调节表面Calr的内在机制在无ROS的情况下仍然未知。为了系统评估HSPC中触发表面Calr呈现的途径，我们通过筛选1200种生物活性小分子的面板，针对人胚肾293（HEK293）细胞中的多种信号通路。Calr是内质网（ER）中的一种丰富伴侣蛋白。因此，为了仅评估细胞表面的Calr，我们设计了一个SPLIT-TURBO ID构建体，针对Calr与膜蛋白Cadherin 2（CDH2）的结合。我们通过使用荧光Calr抗体独立评估Calr的表面呈现。通过这两种独立的方法，我们确定了能够显著增加表面Calr呈现的化合物。同时，我们还使用CellROX（Thermo Fisher Scientific）这一普遍的ROS探针来识别以ROS相关方式诱导表面Calr的化合物。我们发现93种化合物能够以强烈的剂量依赖性反应增加表面Calr，后称为Calr诱导剂。在这93种Calr诱导剂中，54种与ROS水平的增加相关（依赖于ROS），而39种则不影响ROS水平（独立于ROS）。二甲基亚硫酰胺（DMSO）作为载体对照，DPI和H2O2分别作为内部负对照和正对照。使用化学注释工具，我们分析了依赖于ROS的化合物的已知生物功能。如预期，我们发现与细胞压力通路（如由细胞色素P450引起的氧化和DNA损伤）有强正相关，而独立于ROS的化学物质并未在特定通路中富集。为了测试这93种Calr诱导剂对巨噬细胞-HSPC相互作用结果的影响，我们使用了表达HSPC和巨噬细胞中荧光报告基因的 runx1+23:mCherry; mpeg1.1:EGFP 斑马鱼胚胎。在受精后48小时，胚胎暴露于93种Calr诱导剂。经过24小时的暴露，我们通过活细胞成像评估了巨噬细胞-HSPC的相互作用。在93种Calr诱导剂中，有22种促进了高于基线水平的巨噬细胞-HSPC相互作用。我们确认这些化合物增加了表面Calr的呈现。无论是依赖于ROS的化合物还是独立于ROS的化合物都以类似的水平增加了巨噬细胞-HSPC的相互作用比率。我们通过Annexin-V染色评估来自野生型（WT）72小时后胚胎的细胞凋亡。这22种化合物与DMSO处理的胚胎相比，没有改变凋亡水平，除了依赖于ROS的β-lapachone。因此，Calr诱导剂在凋亡和/或细胞死亡通路之外独立触发了表面Calr的表达。接下来，为了验证Calr在增加巨噬细胞-HSPC相互作用中的作用，我们在斑马鱼中生成了调节巨噬细胞-HSPC相互作用的Calr亚型Calr3b的马赛克缺失（crispants）。我们发现这22种Calr诱导剂在依赖于Calr3b的情况下促进了相互作用。这些结果共同表明，表面Calr水平决定了巨噬细胞-HSPC的相互作用。依赖于ROS和独立于ROS的通路均增加了表面Calr的呈现，表明各种压力源导致“吃我”信号的呈现。![]()
图1. 化学筛选识别依赖于ROS和独立于ROS的表面Calr诱导剂。
(A) 来自三次独立实验的代表性成像，显示ROS+Runx1+细胞更易被巨噬细胞消亡。绿色表示Mpeg；红色表示Runx1；白色表示CellRox探针。(B) 表面Calr标记的胚胎HSPC中的ROS水平。数据通过Pearson相关性分析。MFI为中位荧光强度；AU为任意单位。数据点代表100到300个3天后胚胎的汇总。(C) 使用DPI或VAS2870（Nox抑制剂）抑制ROS后HSPC上的表面Calr水平。数据通过Kruskal-Wallis检验分析，随后进行Dunn检验；*P < 0.05。数据点代表100到300个3天后胚胎的汇总。数据（A）至（C）以均值±SEM表示。实验在两次独立实验中对100到300个斑马鱼胚胎进行。(D) 化学筛选的示意图。使用两种方法确保系统特异性记录表面Calr值：(i) HEK293细胞转染SPLIT-TURBO ID，其中C末端设计为携带膜蛋白Cdh2，N末端携带Calr；(ii) anti-Calr与A647通过Zenon技术结合。随后，细胞被培养在384孔板中，并用1200种生物活性小分子的三种不同浓度（5、2.5和0.625 mM）处理。细胞还标记了普遍的ROS探针（CellROX）和用于核染色的DAPI。24小时后，使用Zeiss Cell Discoverer 7（CR7）显微镜读取板块。数据使用CellProfiler和R-Sight HTS软件分析。SD为Split-turbo ID；ab为Calr抗体。(E) 在HEK293中诱导表面Calr的化合物数量和重叠情况。每种化合物均进行重复测试，并选择两个到四个随机视野进行采集。同一孔用于SPLIT-Turbo、Ab-Calr和CellROX的采集。(F) 左侧：在体外和体内（斑马鱼胚胎）增加表面Calr的化合物数量。右侧：使用mCherry标记的mpeg-GFP；runx1-mCherry胚胎进行活细胞成像，以确定巨噬细胞与HSPC之间的相互作用比例。蓝色突出显示的是独立于ROS的化合物，黑色代表依赖于ROS的化合物。数据显示为均值±SEM。用于确定巨噬细胞-HSPC相互作用的斑马鱼活体成像实验进行两次独立实验，并对至少五个胚胎进行成像。
巨噬细胞的消亡或整理行为由HSPC的ROS水平决定。
由于抗氧化治疗会抑制暴露于依赖于ROS的化合物的人类HSPC表面Calr水平，我们推测促进消亡的化合物与因线粒体功能障碍而导致的高ROS水平相关。支持我们假设的是，促进仅消亡的ROS依赖性化合物同样损害了线粒体膜电位（图S1, J到L），而缺乏巨噬细胞-HSPC相互作用会导致线粒体ROS的积累增加（图S1, M和N），这表明巨噬细胞确保质量控制。相比之下，独立于ROS的化合物增加了HSPC增殖，这与增强的整理行为一致（图2A和图S2A）。这些结果表明，HSPC上的表面Calr呈现诱导了巨噬细胞的相互作用，同时这种相互作用的结果则由HSPC的细胞ROS水平决定。依赖于ROS的化合物刺激消亡行为和HSPC死亡，而独立于ROS的化合物则刺激整理行为和HSPC增殖。Calr诱导化合物对HSPC的增殖促进作用可能是由于内在巨噬细胞行为受损的间接结果。因此，我们测试了用ROS独立化合物处理的巨噬细胞的趋化性和吞噬活性。为了评估吞噬作用，我们用Calr诱导剂处理RAW-274巨噬细胞。暴露24小时后，我们将绿色荧光蛋白（GFP）–罗多霉素（rhodozymosan）添加到培养中，该病原颗粒可促进吞噬作用，并通过活细胞成像测量GFP+罗多霉素巨噬细胞的数量。我们没有观察到处理细胞中罗多霉素吞噬作用受损。脂多糖（LPS）作为正控制刺激巨噬细胞（图S2B）。我们使用琼脂糖趋化实验评估巨噬细胞的趋化性。RAW-274细胞用DMSO（负对照）、LPS（正对照）或独立于ROS的化合物处理。趋化因子点填充有含LPS的培养基作为巨噬细胞趋化的诱饵，而该处理未影响这一过程（图S2C）。这些结果表明，独立于ROS的Calr诱导剂未改变内在巨噬细胞功能。因此，独立于ROS的化合物驱动巨噬细胞介导的HSPC整理，而不引发巨噬细胞自主效应（图2A）。Toll样受体3（Tlr3）在促进整理背景下诱导表面Calr
为了确定ROS独立化合物如何诱导表面Calr的呈现以促进巨噬细胞的整理而非消亡，我们进行了全基因组CRISPR筛选。我们选择了ROS独立化合物DL-PPMP作为Calr诱导剂，因为它导致了高表面Calr（图S1C）、巨噬细胞与HSPC的相互作用（图1F）以及HSPC增殖（图S2A），并且增加了巨噬细胞整理比率（图2A和视频S2）。为了定义表面Calr表达所需的复杂网络，我们使用了针对18,080个基因的敲除文库的慢病毒递送，该文库包含64,751个独特的引导序列。我们用DL-PPMP或DMSO（对照）处理K562人白血病细胞，并通过流式细胞术分选Calr–细胞（图2B）。通过对Calr–细胞进行分选并富集其中的单导RNA（sgRNA），我们确定了哪些基因在“不要吃我”的背景下调控对Calr诱导剂的表面Calr呈现。我们专注于在DL-PPMP刺激的细胞中特别富集的基因（图2C和数据S2）。在目标中，我们发现与细胞质DNA/RNA感知和病毒免疫反应相关的基因富集，这些基因上调Calr的呈现。Toll样受体3（TLR3）作为双链RNA（dsRNA）传感器；DDX3X是一种RNA解旋酶；而XBP1是一种蛋白质，除了其他功能外，还调节主要组织相容性复合体类II（MHC-II）基因，并且是内质网应激的关键转录因子调节因子。在验证实验中，TLR3的缺失降低了K562细胞中的表面Calr（图S2G），表明细胞质DNA和/或RNA可能介导了表面Calr的增加。同时，我们对用促进HSPC消亡的ROS依赖性化合物bongkrekic acid处理的K562细胞进行了全基因组CRISPR-Cas9筛选。虽然我们在此筛选中得到了Calr的富集，确认了我们筛选的靶向效率，但在此数据集中未发现TLR3的富集。这些数据支持了表面Calr呈现的整理作用由TLR3介导的假设。Toll样受体3（Tlr3）信号在HSPC中对巨噬细胞介导的整理至关重要
我们旨在评估Tlr3在HSPC中控制巨噬细胞的消亡与整理的生物学相关性。我们通过两种正交方法进行测试。我们通过向单细胞斑马鱼胚胎注射Morpholino来去除tlr3（“morphants”；图S2H），或通过用dsRNA/Tlr3抑制剂CUCPT4a（iTlr3）药理学地抑制Tlr3（图S2I）。在HSPC从背主动脉的腹壁发芽或出现后的48小时内进行处理或去除。两种方法均观察到通过流式细胞术在体内呈现表面Calr的HSPC数量减少（图S2, H和I）。这些数据确认Tlr3在体内HSPC表面Calr的呈现中是必需的。接着，我们测试了Morpholino去除tlr3或iTlr3抑制是否调节了巨噬细胞与HSPC的相互作用及其结果。尽管Calr+ HSPC减少，但通过Morpholino去除tlr3或iTlr3抑制增加了消亡并减少了整理（图2D和视频S3至S5）。为了排除巨噬细胞行为的潜在细胞自主缺陷，我们进行了共生实验，其中将标准或tlr3 Morpholino注射的runx1+23mCherry;mpeg1:BFP胚胎与ampeg.1:EGFP野生型斑马鱼融合（图2E）。两种来源的巨噬细胞（野生型（绿色）和tlr3 morphants（蓝色））均显示与HSPC的接触增加，随后出现消亡行为的增强。这表明Tlr3以HSPC自主的方式作用于防止消亡行为（图2，F和G）。为了调查Tlr3是否足以促进整理，我们分选了小鼠谱系–Sca1+cKit+（LSK+）HSPC，预处理它们与polyI:C、dsRNA模拟物（Tlr3激动剂）或DMSO，然后与自体骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）共同培养。我们观察到，poly I预处理的HSPC显示出更高的整理比率（图S2, J和K），因此表明Tlr3/dsRNA信号在HSPC中促进了整理行为。Toll样受体3（Tlr3）信号引导HSPC表面B2m的呈现
为了深入了解“不要吃我”化合物DL-PPMP触发的分子机制，我们分析了以前可获得的来自DL-PPMP处理的人癌细胞系的批量RNA测序（RNA-seq）数据。我们识别出2285个在处理细胞中上调的基因，这些基因富集在与病毒免疫反应相关的通路中，如干扰素α（IFN-α）产生的调控、抗原处理和通过主要组织相容性复合体类I（MHC I）呈现内源性肽。与我们的数据一致，DL-PPMP处理的K562细胞表达了更高水平的β-2微球蛋白（Beta-2-microglobulin, B2m），这是一种在细胞表面稳定MHC-I所需的分子（图S3A）。虽然MHC-I对于抗原呈现和CD8+ T细胞激活是必需的，但它也可以提示“不要吃我”信号。例如，MHC-I-B2m的表达通过与在免疫抑制相关细胞（如耐受性树突状细胞和M2型巨噬细胞）中表达的LILRB1/LILRB2结合，保护癌细胞免受吞噬（22-24）。从进化角度看，这一机制可能是保守的，因为根据来自硬骨鱼纲的数据，LILR系统起源于4.5亿年前，白细胞免疫型受体（LITR）与人类LILR受体具有同源关系。基于我们在“不要吃我”背景下识别表面Calr诱导剂的CRISPR筛选（图2C）和结果表明Tlr3促进整理（图S2, J和K），我们假设HSPC会在响应Tlr3信号时显示更多的B2m，从而抑制巨噬细胞吞噬并防止消亡行为。为了验证这一假设，我们评估了tlr3斑马鱼morphants中HSPC表面的B2m水平。我们发现，去除斑马鱼胚胎中的tlr3导致B2m+ HSPC数量减少（图S3B）。考虑到tlr3斑马鱼morphants表现出更高的消亡事件（图2D），我们的结果表明，由于Tlr3表达降低而导致的B2m表达降低使得HSPC更容易被巨噬细胞消亡。![]()
图2. Tlr3是HSPC整理所必需的
(A) 堆叠图显示在Calr诱导剂存在下的巨噬细胞相互作用行为。整理行为用黑色条表示，消亡行为用橙色条表示。成像是在3天龄的斑马鱼胚胎中进行的。确切的样本量在图中指明，n = 6至16，来自两次独立实验。数据通过Wilcoxon配对秩和检验分析，*P = 0.0156，**P = 0.002，***P = 0.001。
(B) Gecko 2.0 CRISPR-Cas9敲除筛选的示意图。
(C) 使用MAGECK软件识别出显著富集的sgRNAs（P < 0.05），并根据其Z分数绘制为累积堆叠图。箭头指示显著富集的sgRNAs示例，其Z分数在括号中表示。筛选在K562细胞中进行，实验重复三次。
(D) 敲低Tlr3（Tlr3 MO）或iTlr3处理减少了被整理的HSPC比例，但增加了被消亡的HSPC比例，使用的是3天龄斑马鱼胚胎。巨噬细胞行为结果的比例通过计算与巨噬细胞相互作用的总HSPC（runx1+细胞）数量与消亡或整理事件的总数计算。数据点代表单个胚胎：SD MO, n = 9；tlr3 MO, n = 11；DMSO, n = 4；iTLR3, n = 5。进行了两次独立实验。使用双向ANOVA及Sidak多重比较检验分析，**P = 0.0027；***P = 0.00005。
(E) 代表性成像显示了脊椎动物的实验设计。
(F) 两种巨噬细胞与HSPCs的相互作用率均较高。*P = 0.04，**P = 0.0015。数据使用双向ANOVA检验分析。巨噬细胞-HSPC相互作用百分比通过计算与巨噬细胞相互作用的总HSPC（runx1+细胞）数量与总HSPC数量的比值计算。
(G) 条形图显示巨噬细胞行为结果的比例。巨噬细胞行为百分比结果通过计算与巨噬细胞相互作用的总数与消亡或整理事件的总数计算。*P = 0.01，**P = 0.0057。数据通过未配对的Student’s t检验分析。对于(F)和(G)，数据点代表单个胚胎，n = 10，来自三次独立实验。
表面B2m决定由Calr介导的巨噬细胞-HSPC相互作用的结果
我们用ROS独立化合物处理48小时后斑马鱼胚胎，并通过荧光激活细胞分选（FACS）评估HSPC上的表面B2m水平。我们发现，ROS独立化合物增加了B2m水平（图S3, C和D，蓝色），而“吃我”或iTlr3处理则降低了表面B2m水平，这表明B2m装饰在HSPC表面并促进在巨噬细胞-HSPC相互作用中的“不要吃我”信号。B2m对于保护HSC的克隆复杂性是必需的（图S3, C和D）。为了验证Calr和B2m提供的信号输入对于巨噬细胞-HSPC相互作用结果的重要性，我们使用CRISPR-Cas9生成了具有b2m马赛克缺失的斑马鱼crispant胚胎，并用ROS独立Calr诱导剂处理。DMSO作为注入对照sgRNA和b2m sgRNA的胚胎的载体对照。在b2m去除后，ROS独立Calr诱导剂促进了消亡而不是整理（图S3E）。这些数据支持了ROS独立Calr诱导剂通过Calr和B2m的表面呈现促进整理的假设，其中Calr促进巨噬细胞-HSPC相互作用，B2m则提供“不要吃我”信号，从而阻碍HSPC被巨噬细胞完全吞噬。Mosaic crispants受限于编辑效率。为了确认B2m在巨噬细胞介导的HSPC整理中的作用，我们生成了b2m稳定敲除的斑马鱼。我们使用CRISPR-Cas9在具有 runx1+23:mCherry;mpeg1-EGFP背景的斑马鱼中引起b2m基因第3外显子的框移突变。我们通过72小时后活细胞成像研究这些纯合突变体中巨噬细胞-HSPC相互作用的结果。B2m去除促进了HSPC的消亡并减少了HSPC的整理（图3，A至E，图S3D），进一步支持了表面B2m作为HSPC上的“不要吃我”信号的作用。这种消亡的增加与Calr+ HSPC数量的增加无关（图S3G）。此外，尽管HSPC表面的Calr水平较低，我们观察到尾部造血组织（CHT）中的Runx1+细胞数量减少（图S3H），这可能表明HSPC消亡增强。接下来，为了验证B2m作为“不要吃我”信号的作用，我们用ROS独立化合物DL-PPMP处理我们的b2m敲除胚胎。我们推测DL-PPMP会增加表面Calr（增加巨噬细胞与HSPC的相互作用），但在缺乏B2m的情况下，这些相互作用会导致消亡。我们观察到DL-PPMP刺激了野生型和b2m敲除胚胎中的相互作用。然而，b2m敲除的HSPC被消亡，而野生型HSPC则被整理（图3，F和G）。这些结果支持了表面B2m在指示巨噬细胞的整理行为中的重要性。随后，我们评估了B2m介导的“不要吃我”信号在进化中的保守性。为此，我们分选了小鼠HSPC（LSK+），这些细胞为MHC-I+或MHC-I–并与BMDM共同培养4小时（图3H）。我们选择分选MHC-I，因为其表面表达依赖于B2M的存在。我们发现小鼠MHC-I+ HSPC促进了巨噬细胞的整理（图3I）。总体而言，这些结果表明B2m装饰在HSPC表面并在巨噬细胞-HSPC相互作用中促进“不要吃我”信号。表面B2m对于保护造血干细胞（Hematopoietic Stem Cells, HSC）克隆复杂性是必需的
与哺乳动物中的B2M种系突变相似（图27），我们在成年斑马鱼中并未观察到b2m敲除后发生重大发育变化，唯一的变化是淋巴细胞数量减少（图S3I），这可能反映了CD8+细胞分化受损。HSC克隆复杂性对于维持功能和韧性的免疫系统至关重要，支持长期造血功能，并降低血液疾病的风险（图29, 30）。由于整理和消亡调节HSC克隆复杂性（图6），我们旨在确定B2m去除是否会影响HSC克隆结构。我们假设b2m突变体中的消亡增加会减少成年期HSC克隆的数量。为了测试这一点，我们使用可诱导干细胞标记的组织编辑技术（TWISTR），将CRISPR-Cas9介导的基因编辑与Zebrabow（zbow）HSC颜色标记结合（图31, 32），这允许突变体和野生型（WT）干细胞在体内竞争。Zebrabow-M; draculin胚胎允许在24小时后特定谱系标记单个HSC克隆（图3J）。b2m的马赛克缺失减少了髓系和淋巴系或前体克隆的数量（图S3J），并促进了克隆优势（图3，K至M，以及图S3K）。此外，在HSPC嵌合之前进行的巨噬细胞消融拯救了b2m crispants的克隆优势（图3，K至M），但没有拯救克隆数量（图3M）。克隆数量的减少可能反映了Il-1β驱动的增殖受损（图6），因此限制了HSC克隆的数量（图3N）。考虑到TWISTR的马赛克特性，我们假设在b2m突变状态下发现的更丰盛（或主导）克隆是未携带b2m突变的WT细胞。因此，我们对主导和非主导克隆进行了分选，并评估了它们的b2m编辑效率。确实，主导克隆在b2m上为WT，表明b2m突变克隆被消亡，导致耐消亡的WT克隆在成年骨髓中占据主导地位（图S3K）。这些结果表明B2m装饰在HSPC表面并保护它们免受巨噬细胞清除，从而影响成年期的HSPC克隆性。干扰素调节因子3（Interferon-regulatory Factor 3, Irf3）介导了特定于Toll样受体3（Toll-like Receptor 3, Tlr3）/Toll样受体4（Toll-like Receptor 4, Tlr4）的抗病毒基因程序，位于b2m表达的上游（图33–35）。因此，我们使用TWISTR系统生成TWISTR-irf3突变体，以阐明通过B2m调节HSC克隆性的分子通路。我们还生成了TWISTR-tlr3突变体，并在48小时后用iTlr3处理斑马鱼胚胎，以抑制Tlr3和双链RNA（dsRNA）下游信号。与b2m突变体类似，irf3和tlr3的马赛克去除，以及Tlr3信号的抑制，减少了髓系克隆的数量，同时增加了克隆优势（图S3，L至Q）。TWISTR-irf3突变体同样表现出WT的克隆优势，表明去除irf3的干细胞处于竞争劣势（图S3，L至N）。结合成像结果，这表明B2m突变HSC和Irf3突变HSC均被巨噬细胞清除，因为这些细胞不再呈现“不要吃我”信号。这些数据表明Tlr3激活级联的分子网络起作用，促进Irf3的激活，从而可能促进b2m的转录。![]()
图3. B2m作为“不要吃我”分子，防止不必要的HSPC消亡
(A) B2m敲除稳定突变体（B2m KO）显示B2M水平显著降低。数据通过非配对Mann-Whitney U检验分析，*P = 0.028，数据点代表约100个胚胎的汇总。
(B) 条形图显示HSPC与巨噬细胞的相互作用百分比。
(C和D) B2m KO胚胎显示显著较低的巨噬细胞-HSPC相互作用和消亡主导行为。数据通过非配对Mann-Whitney检验分析，*P = 0.012，**P = 0.0021，****P < 0.0001，数据点代表单个胚胎的图像。WT，n = 12；B2m KO，n = 14，数据来自三次独立实验。巨噬细胞-HSPC相互作用百分比通过计算与巨噬细胞相互作用的总HSPC（runx1+细胞）数量与总HSPC数量的比值计算。
(E) 代表性成像显示B2m纯合突变体中观察到的消亡行为增加。n = 4，来自两次独立实验。
(F) 条形图显示WT和B2m KO斑马鱼胚胎中的相互作用率。n = 4，数据点表示视野。
(G) 巨噬细胞行为百分比结果通过计算相互作用的巨噬细胞总数与消亡或整理事件的总数计算。在WT背景下，DL-PPMP促进了整理，而在B2m KO背景下，它促进了消亡。
(H) 小鼠HSPCs（LSK+）与巨噬细胞共培养的示意图。左下角面板是显示分选的小鼠HSPC-MHC-I+（绿色）被巨噬细胞（洋红色）整理的代表性成像。右下角面板是小鼠HSPC-MHC-I–被巨噬细胞消亡的图像。
(I) MHC-I+ HSPCs的整理率高于MHC-I–细胞。数据使用非参数单向ANOVA分析，随后进行Kruskal-Wallis检验，*P = 0.03，数据以均值±SEM表示。巨噬细胞行为结果的分数通过计算相互作用的巨噬细胞总数与消亡或整理事件的总数计算。
(J) Zebrabow-M系统的示意图。具有15至20个多色荧光盒插入的动物与draculin系交配，以实现侧板中胚层谱系的克隆标记。通过在24小时后用4-OHT处理，仅在HSC特定化之后，可以在成年骨髓中定量表达特定荧光色调的个体干细胞谱系。
(K) 注射b2m morpholino的Zebrabow-M; draculin
动物家族，在有或没有氯喹脂质体的情况下，HSC克隆数量减少。
(L和M) 成年骨髓中的克隆优势。氯喹脂质体在48小时后注射。数据点代表成年肾骨髓。对照，n = 22；b2m sgRNA，n = 21；氯喹，n = 3。实验至少进行了两次。
对于(A)至(D)、(F)、(G)和(I)至(K)至(M)，数据以均值±SEM表示。实验是在斑马鱼模型中进行的。
(N) 关于“不要吃我”信号的克隆多样性示意图。
细胞质双链RNA（dsRNA）促进B2m表达并保护免受消亡
B2m的增加表达是针对病毒感染的经典反应，也是对I型干扰素（Interferon, IFN）的细胞反应。为了研究造血干细胞（Hematopoietic Stem Cells, HSPC）群体的内在异质性，我们使用干扰素刺激基因15（Interferon-stimulated Gene 15, Isg15）作为Toll样受体3（Toll-like Receptor 3, Tlr3）介导的Irf3反应的报告基因。流式细胞术显示27%的Runx1+ HSPCs对Isg15呈阳性（图4A和图S4A），并与B2m的表面呈现呈正相关（图4B）。Isg15+ HSPCs被巨噬细胞消亡的可能性较低（图4C和视频S6）。Isg15活性和B2m在特定HSPCs中的富集暗示了这些细胞中的病毒模拟反应。为了验证这一点，我们向72小时后胚胎注射了Tlr3激动剂 poly I:C，并测量Isg15+ HSPCs的比例。我们发现poly I增加了Isg15+ HSPCs的比例（图S4B）。总体而言，这些数据表明，内源性病毒模拟反应可以触发I型IFN途径，导致HSPC表面B2m水平升高，从而保护HSPCs免受消亡。内源性逆转录病毒（Endogenous Retrovirus, Erv）在调节HSPC形成和再生中发挥作用。因此，我们假设REs可能是介导b2m表达的内源性Tlr3配体。Runx1+ Isg15+细胞的定量聚合酶链反应（qPCR）分析显示内源性逆转录病毒和B2m表达持续增加（图4D）。这些数据表明，具有较高RE转录水平的HSPCs也具有更高的B2m水平。为了深入了解在巨噬细胞相互作用的HSPCs中的RE状态，我们重新分析了已发表的从巨噬细胞去除和对照胚胎中分选的runx1+23:mCherry的单细胞RNA-seq数据，并修改了映射以包括单细胞水平上的RE表达，包括长末端重复序列（Long Terminal Repeats, LTRs）。细胞周期基因表达富集的细胞群（聚类2）相较于富集非周期性细胞的细胞群，RE表达较高（图4E和图4F，图S4C）。这表明，准备增殖的HSPCs具有更高的RE表达。此外，来自用DL-PPMP处理的胚胎的Runx1+细胞的批量RNA-seq显示了RE的上调，包括LTRs的转录（图S4D）。为了评估在携带高或低Erv转录水平的HSPCs中的B2m表达，我们将一种zfERV（LTR5）报告线与runx1+23:mCherry斑马鱼交配。LTR5+ HSPCs通过流式细胞术显示出更高的B2m水平（图S4E）。接下来，我们寻求确定RE水平是否依赖于巨噬细胞-HSPC相互作用。为了测试这一点，我们量化了在48小时后来自WT或巨噬细胞去除胚胎的Runx1+细胞中的细胞质dsRNA水平。巨噬细胞去除并未改变Runx1+细胞中的dsRNA含量（图S4F），这表明HSPCs中RE的内源性含量与巨噬细胞相互作用无关。总体而言，这些数据表明，升高的细胞质RE，包括LTRs，与更高的B2m水平相关，暗示病毒模拟程序可能保护HSPCs免受巨噬细胞消亡。为了确定在HSC中诱导RE表达是否可以调节巨噬细胞行为，我们用G9a/DNMT抑制剂CM272处理48小时后的斑马鱼胚胎。我们推测抑制DNA甲基化将增强包括Erv在内的RE表达。确实，在处理了CM272的胚胎中，HSPCs在24小时后显示出内源性逆转录病毒和病毒样反应基因的表达增加（图S4G）。此外，CM272增加了Isg15+和B2m+ HSPCs的比例，并增加了HSPCs上的Calr水平（图S4，H至K）。这表明CM272可能促进巨噬细胞对HSPC的整理。我们用CM272处理72小时后的胚胎，这增加了HSPC增殖和Isg15+ HSPCs的数量，并在活细胞成像实验中减少了HSPC的消亡（图4，G至I，以及视频S7和S8）。由于CM272可能通过多种基因表达变化调节消亡和整理，因此我们在runx1+23增强子下游克隆了斑马鱼的LTR4，以促进在HSPCs中的RE过表达。我们发现，来自过表达LTR4（LTR4-OE）胚胎的HSPCs相比于过表达runx1+23增强子GFP的胚胎显示出更高的增殖（图S4L）。考虑到巨噬细胞整理和更长的相互作用与更高的HSPC增殖相关，LTR4-OE中观察到的增殖增加可能反映了更高的整理行为。因此，增加全局RE表达（通过CM272）或特定RE（LTR4）的过表达可以保护HSPCs免受巨噬细胞的消亡。我们研究了RE介导的保护在减少消亡事件对HSPC克隆性的潜在影响。我们选择使用CM272处理作为增加HSPC上“不要吃我”信号的工具，因为它使我们能够关注HSPC发芽后的事件（发生在24至48小时后）。我们推测，逆转录元素的去抑制将增加HSPC的增殖。确实，CHT成像证实HSPC的增殖率更高，如5-乙炔-2′-脱氧尿苷（EdU）掺入所示（图4H）。然而，Zebrabow分析显示克隆性几乎没有变化（图4，J和K），这表明CM272促进了已建立克隆的扩增。当我们用CM272处理TWISTR-b2m突变体时，并未观察到克隆优势的恢复，确认了dsRNA感知发生在B2m呈现的上游（图4，J和K）。这些数据表明，RE与B2m+ HSPCs呈正相关，提升内源性逆转录病毒水平可能提供保护，防止HSPCs消亡。通过内源性逆转录病毒诱导的B2m在进化中是保守的
B2m的氨基酸序列高度保守。因此，我们研究了ERV驱动的B2M表达在哺乳动物中的保守性。与我们在斑马鱼中的观察一致，我们发现人类的ISG15+ HSPCs具有更高的B2M表达，并与REs的表达呈正相关。为了验证B2M水平与RE表达之间的因果关系，我们在CD34细胞中过表达了人类Erv或GFP（作为对照）。过表达ERV而非对照GFP导致HSPC表面B2M的增加。相反，过表达ERV后ROS水平并未升高。CM272和poly I:C处理的人类CD34细胞中观察到了表面B2m的增加，这一效应可通过阻断Toll样受体3（Toll-like Receptor 3, TLR3）信号通路来消除。我们从人类细胞和斑马鱼的数据表明，通过dsRNA/TLR3信号调节B2M在进化中是保守的。为了理解“不要吃我”信号在哺乳动物系统中的功能相关性，我们用DL-PPMP处理骨髓发育不良综合征1（Myelodysplastic Syndrome 1, Mds1）GFP+/Flt3Cre（MFG）干细胞报告小鼠，因为它促进B2M的呈现，而不影响其他“不要吃我”分子如CD47。我们选择该报告模型是因为Mds1是一个在具有自我更新能力的长期HSC中高度富集的基因。我们发现，DL-PPMP处理增加了HSPC的增殖，并提高了主要组织相容性复合体类I（MHC-I）的水平，这表明HSPCs得以免受巨噬细胞的消亡，并因整理而增殖。通过REs诱导的B2m表达改变HSPC命运
内源性逆转录病毒（Endogenous Retrovirus, ERV）蛋白和遗传物质已经被证明能够调节先天免疫反应。ERV衍生的增强子和启动子似乎在病原体感染时被激活，这表明在响应病原体时可能存在协同激活或一种“训练免疫”功能，连接先天免疫反应与ERV。鉴于RE和B2M的进化保守性，我们接着研究了这一发现与病原体感染的相关性，这是一个进化上保守的过程。我们评估了Toll样受体3（Toll-like Receptor 3, Tlr3）信号在介导“紧急粒细胞生成”中的作用。这是一种独特的保护性程序，旨在响应致命感染，通过放大前体细胞来加速新产生中性粒细胞的生成。因此，为了确定poly I:C是否可以诱导紧急粒细胞生成，我们用poly I处理斑马鱼胚胎，并评估中性粒细胞的数量作为髓系紧急反应的替代指标。我们发现，在poly I刺激下，中性粒细胞的数量增加。类似地，人源化的NOG小鼠在感染后表现出更高的粒细胞生成和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子水平。尽管需要进一步的研究来加强这一现象的相关性，但我们的结果表明，病毒刺激可能通过促进粒细胞分化，增强对机会性病原体的抵抗能力。除了病原体相关的方面，我们还发现急性髓性白血病（Acute Myeloid Leukemia, AML）恶性HSPCs中的B2M表达较高，以及人类AML爆炸细胞中的转座因子（Transposable Elements, TE）表达较高。这表明AML细胞可能劫持“不要吃我”信号，以避免巨噬细胞的清除。我们的数据表明，RE-Tlr3的病毒模拟信号通过介导HSPCs的表面B2m水平，促进巨噬细胞介导的整理，并以一种进化保守的方式保护HSPCs免受巨噬细胞消亡，从而影响HSC命运决定和克隆增殖（图4Q）。![]()
图4. REs作为ERV引发的病毒样反应，在HSPCs中促进B2m表达
(A) 流式细胞术显示约20%的 runx1+23:mCherry HSPCs表达Isg15（分选策略见图S4A）。数据点代表约200个胚胎的汇总，实验重复三次，数据以均值±SEM表示。数据通过Mann-Whitney检验分析，P=0.003。(B) B2m与Isg15水平之间的正相关。数据通过Pearson相关性分析，数据点代表约200个胚胎的汇总。(C) 左：Isg15+ HSPC相互作用的代表性图像，HSPCs用红色显示，巨噬细胞用蓝色显示，Isg15用绿色显示。右：Isg15+ HSPCs显示较低的消亡比例。(D) 分选的Isg15+ HSPCs显示更高的B2m和RE表达。数据点代表约200个胚胎，实验重复两次，y轴表示相对基因表达。(E) 在标准Morpholino（灰色，对照sdM）和irf8去除胚胎（黄色，irf8sdKD）中分选的runx1+23HSPCs的统一流形和投影（UMAP）[原始数据来自Watrus等]。(F) 富集于对照HSPCs的聚类2（C2）显示更高的RE表达。总共分析了808个细胞。(G) 用CM272（5 µM）处理2天龄胚胎后，3天龄CHT中Isg15+ HSPCs数量增加。数据通过活细胞成像定量，使用Mann-Whitney检验分析，*P=0.02，数据点代表一个胚胎，实验重复两次。(H) CM272处理的runx1+23胚胎的EdU染色显示3天龄HSPCs的增殖显著增加。数据通过Student’s t检验分析，数据正态性通过Shapiro-Wilk检验评估，**P=0.0061，数据以均值±SEM表示，对照n=5；CM272 n=7。(I) CM272处理的胚胎显示较低的消亡比例。数据点代表一个胚胎，百分比通过定量Edu+ Runx1+细胞与总Runx1+细胞数量之比计算。该图表示两次独立实验，对照n=6；CM272 n=10。(J) 对照（DMSO）、CM272和CM272 b2m敲除斑马鱼的基尼系数。数据通过Kruskal-Wallis检验分析，随后进行Dunn多重比较检验，**P=0.0043，数据点代表一条成年鱼。DMSO n=6；CM272 n=5；b2m sgRNA n=5，该图显示两次独立实验。(K) 经过CM272处理的b2m TWISTR Zebrabow-M; draculin显示成年骨髓中HSC克隆数量减少。数据通过Kruskal-Wallis检验分析，随后进行Dunn多重比较检验，*P=0.023，数据点代表一条成年鱼。DMSO n=6；CM272 n=5；b2m sgRNA n=5，该图显示两次独立实验。(L) ISG15表达与人类HSCs中的可转座元件（Transposable Elements, TE）表达正相关。先前发布的人类骨髓CD34+干细胞和前体的单细胞RNA-seq数据集[原始数据来自Nam等（90），n=4个样本]与TE参考对齐，使用CellRanger v3.2。TE表达通过总RNA计数进行标准化。对个别HSC的TE表达与ISG15基因表达之间进行Pearson相关性分析，数据点表示每个细胞。(M) 来自同一数据集的人类骨髓HSCs根据其ISG15表达分组，upper quartile被视为高表达的阈值，lower quartile则视为低表达。个别细胞的B2M标准化表达显示，ISG15高表达的细胞具有更高的B2M表达。仅包含至少一个ISG15转录本的细胞进行分析。高表达n=203细胞；低表达n=608细胞，来自n=4个样本。使用线性混合模型分析P=0.02，以样本作为随机效应变量。箱线图表示中位数，下四分位数和上四分位数，须对应于1.5倍四分位范围。(N) 人类Erv的过表达上调了人类CD34+细胞中的B2M水平。数据以均值±SEM表示，数据点描绘了一名CD34供体，数据来自两个独立供体。(O) 用DL-PPMP处理的MFG+小鼠的EdU染色显示，在处理后24小时内HSPCs增殖增加。百分比由活细胞总数决定，数据点代表一只小鼠。(P) DL-PPMP处理刺激小鼠HSPCs中的B2M表达。流式细胞术在来自胫骨和股骨的细胞上进行（分选见图S4Q）。数据通过Student’s t检验分析，*P=0.02，数据以均值±SEM表示，n=3只小鼠每组。(Q) 结果表明更高表面B2m的建议分子通路示意图。讨论
我们的数据支持这样一个模型：巨噬细胞通过“吃我”和“不要吃我”信号之间的平衡来筛选新形成的造血干细胞（Hematopoietic Stem Cells, HSPCs）的质量。这个过程由表面钙网蛋白（Calreticulin, Calr）提供的“吃我”信号和β-2微球蛋白（Beta-2-microglobulin, B2m）提供的“不要吃我”信号调控，前者由活性氧种（Reactive Oxygen Species, ROS）驱动，后者由dsRNA-Toll样受体3（Toll-like Receptor 3, Tlr3）信号驱动。在我们提出的模型中，表面Calr主导巨噬细胞与HSPC的相互作用，而B2m则决定巨噬细胞的整理或消亡行为。B2m是一个进化上保守的分子，对I型IFN有积极反应。IFN家族已被报道能够打破干细胞的静息状态，促进不对称分裂，并刺激胚胎HSC的成熟。I型IFN通过JAK-STAT通路调节，这一过程通过STAT1磷酸化介导，导致HSC增殖和活化。我们的研究扩展了I型IFN的意义，显示Tlr3/dsRNA级联反应触发Irf3反应，刺激HSPCs上B2m的表达。B2m作为“不要吃我”信号，从而抑制HSPCs的巨噬细胞消亡。我们认为B2m的影响超出了造血系统，可能影响肿瘤相关巨噬细胞和高MHC-I肿瘤中的抗-CD47治疗效果。在缺乏CD47同源物的物种（如斑马鱼）中，我们的研究建议B2m作为干细胞上介导“不要吃我”信号的原始信号。我们揭示了RNA REs在调节干细胞克隆性中的作用，通过触发Tlr3，模拟病毒反应，从而导致B2m的表达。其他TLR反应可能介导Calr的外化。例如，黄病毒（flaviviruses，单链RNA，TLR7/8）可以促进Calr的外化，而Calr又被自然杀伤细胞（Natural Killer, NK）识别。B2m可以抑制巨噬细胞介导的吞噬，同时可能减弱NK细胞的活性。ERV的激活可能加速HSPCs向免疫细胞的分化，从而帮助抵御感染，进而提供一种进化选择，以维持具有内源性ERV激活的HSPCs。我们使用去甲基化剂CM272的实验表明，RE的去抑制触发B2m表达，这与克隆持续性相关。骨髓发育不良症和白血病的患者常常使用去甲基化剂进行成功治疗，可能是由于RE的激活和正常或突变克隆的存活与“不要吃我”信号的适当分化相关。在发育背景下，RE已被证明在内皮-造血（Endothelial-to-Hematopoietic, ETH）转化期间增加RERNA的表达，在此过程中介导HSPC的形成。Isg15+ HSPCs可能以类似于ETH过程的方式对RE作出反应。在这一情况下，来自ETH的RE携带HSPCs会响应IFN程序，从而促进B2m的表达并争夺骨髓的定殖。这种保护机制也可能在成年期应对环境压力时发挥作用，例如在感染或克隆干细胞疾病（如白血病）期间。支持这一假设的是，可转座元件的表达被用来准确预测AML的预后。B2m可能赋予骨髓发育不良或白血病克隆的保护，导致疾病的发生。因此，操纵“不要吃我”和“吃我”信号的水平可能对通过利用巨噬细胞选择性清除突变干细胞克隆的免疫治疗具有重要的治疗意义。原文：https://www.science.org/doi/10.1126/science.adn1629
