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题目
akr1a1a斑马鱼突变体中丙烯醛解毒能力的降低导致胰岛素受体信号传导受损和微血管改变
摘要
丙烯醛（Acrolein, ACR）是一种源自能量消耗的有毒代谢物，其增加与糖尿病及其并发症相关。然而，大多数分子机制仍然未知，且目前尚无适用于体内研究的内源性ACR升高的动物模型。多种酶系统负责丙烯醛的解毒作用，例如醛脱氢酶（Aldehyde Dehydrogenase, ALDH）、醛酮还原酶（Aldo-Keto Reductase, AKR）和谷胱甘肽S-转移酶（Glutathione S-Transferase, GST）。为了评估ACR在葡萄糖稳态和糖尿病中的作用，利用CRISPR/Cas9技术生成了akr1a1a−/−斑马鱼突变体。在akr1a1a−/−幼鱼和成年鱼的肝脏中证实了内源性丙烯醛的积累。此外，在Tg(fli1)斑马鱼中进行了一系列实验，涉及器官改变、葡萄糖稳态、转录组学和代谢组学。akr1a1a−/−幼鱼表现出葡萄糖稳态受损和血管生成的视网膜玻璃体血管，这些变化是由于丙烯醛解毒能力降低和内源性ACR浓度升高所致。丙烯醛对玻璃体血管的影响可以通过丙烯醛清除剂L-肌肽（l-carnosine）治疗来逆转。在成年akr1a1a−/−突变体中，观察到葡萄糖耐量受损，并伴随视网膜血管生成和肾小球基底膜增厚，这与糖尿病视网膜病变和肾病的早期病理表现一致。因此，数据强烈提示丙烯醛解毒受损和ACR浓度升高是糖尿病及其并发症的生物标志物和诱发因素。1 引言
糖尿病是一种全球性的疾病，其特征是长时间内血糖水平升高。截至目前，已有超过4.63亿人被诊断为糖尿病，预计到2045年这一数字将上升至7亿人。如果不及时进行适当治疗，糖尿病会导致眼睛和肾脏的严重微血管并发症，即糖尿病视网膜病变和肾病，成为工作年龄段人群视力丧失和肾功能衰竭的主要原因。因此，糖尿病的早期诊断和干预对于改善长期预后至关重要，且迫切需要。越来越多的证据表明，活性羰基化合物（Reactive Carbonyl Species, RCS）与糖尿病和胰岛素抵抗呈正相关。其中，甲基乙二醛（Methylglyoxal, MG）研究较为深入，被认为是主要的有毒因素。除了MG，丙烯醛（Acrolein, ACR）在过去几十年中也因其高反应性引起了极大的关注。ACR源于体内由髓过氧化物酶介导的苏氨酸降解、胺氧化酶介导的亚精胺和精胺降解以及多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated Fatty Acids, PUFAs）的脂质过氧化作用，被认为是一种有毒的中间体，在阿尔茨海默病、神经病理性疼痛、脊髓损伤、心血管疾病和糖尿病中发挥一定作用。初步研究已确定，丙烯醛-赖氨酸加合物（FDP-lysine）在1型和2型糖尿病患者中升高。丙烯醛相关代谢物，如N-乙酰-S-（3-羟丙基）-L-半胱氨酸（3-HPMA）和N-乙酰-S-（羧乙基）-L-半胱氨酸（CEMA），与糖尿病以及胰岛素抵抗呈剂量依赖性正相关。此外，FDP-lysine水平与糖尿病肾病和视网膜病变有很强的联系。尽管研究揭示了ACR与糖尿病并发症之间的明显联系，但ACR是否促成了糖尿病的发生以及器官损伤仍然未知。因此，建立一个内源性ACR升高的合适动物模型对于进一步的体内研究是必要的。通常，ACR的稳态浓度保持在一定范围内。然而，如果ACR的生成或其解毒过程中相应酶（如醛酮还原酶（Aldo-Keto Reductase, AKR）、醛脱氢酶（Aldehyde Dehydrogenase, ALDH）和谷胱甘肽S-转移酶（Glutathione S-Transferase, GST））发生变化，可能会导致ACR的积累，进而对蛋白质、核酸和脂质造成损害。最早发现的AKR，醛还原酶Akr1a1，是一种细胞质中的NADPH依赖性单体氧化还原酶，在斑马鱼中有两个同源物，分别为Akr1a1a和Akr1a1b。Akr1a1具有广泛的底物谱，并且更偏好带有羧基的带负电荷底物。除了解毒常见的RCS（如3-脱氧葡萄糖醛（3DG）、乙醛和MG），Akr1a1还对ACR具有高度亲和力。Kurahashi等人报告说，解毒有毒醛类（如ACR）是Akr1a1的主要功能，Akr1a1的过表达可以减轻Tg MEF（转基因小鼠胚胎成纤维细胞）对ACR的敏感性。在先前的研究中，Akr1a1b被确定为通过调节S-硝基化来调节葡萄糖异生的调节因子。然而，Akr1a1a是否与Akr1a1b功能相近或完全独立，以及Akr1a1a的永久缺失是否会导致内源性ACR的积累并最终导致糖尿病及相关并发症，仍需进一步阐明。因此，本研究旨在建立一个内源性ACR水平升高的动物模型，并阐明ACR对葡萄糖代谢和斑马鱼器官改变的后续影响。我们的数据表明，ACR解毒受损和ACR积累是胰岛素抵抗的诱因，并导致糖尿病视网膜病变和肾病的病理进展。2 结果
2.1 斑马鱼中akr1a1a的表达及akr1a1a敲除斑马鱼的生成
在斑马鱼中，存在两个Akr1a1的同源物，包括Akr1a1a和Akr1a1b。通过比对人类、小鼠和斑马鱼中Akr1a1和Akr1a1a的氨基酸序列显示，斑马鱼的Akr1a1a分别与人类和小鼠的Akr1a1具有60%和58%的相似性。同时，在这三种不同物种中，Akr1a1a和Akr1a1具有相同的活性位点和结合位点，这表明Akr1a1a可能是研究斑马鱼中ACR解毒的潜在候选基因（图1A）。Akr1a1a mRNA的表达通过RT-qPCR在斑马鱼的幼鱼和成年器官中进行了检测。结果显示akr1a1a在胚胎和幼鱼阶段的普遍表达，并在2天孵化后（2dpf）达到最高表达水平（图1B）。此外，akr1a1a的表达主要在肝脏中观察到，其表达水平比参考器官（心脏）高出200倍以上，在大脑（8倍）、肾脏（3倍）和眼睛（3倍）中的表达则相对较少（图1C,D）。总的来说，这些数据表明Akr1a1a在斑马鱼幼鱼的早期发育阶段和成年器官中广泛分布，可能在胚胎发育和生理性肝脏功能中发挥重要作用。为了探索Akr1a1a在斑马鱼中的功能及其对ACR代谢的影响，首先使用CRISPR/Cas9技术生成了akr1a1a−/−突变体品系。简而言之，设计了靶向akr1a1a外显子2的gRNA，并在Tg(fli1: EGFP)报告品系中鉴定并利用了四个核苷酸的缺失插入突变进行后续研究（图1E）。与野生型相比，5天孵化后（5dpf）幼鱼的整体形态未显示出任何明显的突变体变化（图1F）。为了评估akr1a1a突变是否导致翻译后的Akr1a1a蛋白失去功能，进行了蛋白质印迹分析（Western Blot），结果显示突变体中Akr1a1a蛋白完全丧失（图1G）。akr1a1a−/−斑马鱼成长为成鱼的比例约为23.43%，而野生型为24.57%，杂合子为52%，这与孟德尔遗传规律一致，表明akr1a1a的永久性缺失并不影响斑马鱼的生存（图1H）。此外，使用DL-甘油醛作为底物测量了AKR活性，结果显示akr1a1a−/−幼鱼中AKR活性显著下降（图1I）。以上所有数据都证明了akr1a1a敲除突变体的成功生成。![]()
图1 不同物种之间的Akr1a1a序列比对及通过CRISPR-Cas9技术生成Akr1a1a敲除斑马鱼
A）氨基酸序列比对显示不同物种在活性位点（红色框）和结合位点（绿色框）之间具有高度相似性；第一行：斑马鱼AKR1a1a；第二 行：人类AKR1a1；第三行：小鼠AKR1a1。B）野生型斑马鱼幼鱼中akr1a1a mRNA表达在2dpf显著上调。C, D）akr1a1a mRNA主要在野生型成年斑马鱼的肝脏中表达（以心脏为参考器官）。基因表达通过RT-qPCR测定，并归一化至b2m。幼鱼阶段：n = 3批，每批包含30尾幼鱼；成年器官：n = 3，每个样本包含一个器官。E）Akr1a1a-CRISPR靶位点设计在akr1a1a基因的外显子2，选择了CRISPR/Cas9诱导的四个核苷酸缺失-插入用于进一步的akr1a1a突变体品系的生成和维护。基因型通过PCR扩增akr1a1a区域的测序色谱图分析，其中包含akr1a1a靶位点。色谱图显示了akr1a1a野生型和四个核苷酸缺失-插入的纯合测序结果。F）显微图像显示在5dpf时akr1a1a−/−幼鱼与akr1a1a+/+幼鱼的形态未见改变。黑色比例尺：300 µm。G）成年肝脏中Akr1a1a蛋白的蛋白质印迹分析显示突变体中Akr1a1a蛋白的丧失。b-actin作为装载对照。n = 3，每条泳道代表来自相应成年鱼的一个肝脏样本。H）在F2代的第一代中，不同基因型的成年鱼数量符合孟德尔遗传规律：akr1a1a+/+ = 43，akr1a1a+/- = 91，akr1a1a−/− = 41。I）**akr1a1a−/−**斑马鱼显示出酶活性降低（以DL-甘油醛为底物），在96hpf斑马鱼裂解物中通过分光光度分析测量；n = 6–11批，每批包含50尾幼鱼。统计分析采用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey多重比较检验及学生t检验，*p < 0.05。**p < 0.01。RT-qPCR，实时定量聚合酶链反应；dpf，受精后天数；b2m，β2微球蛋白。PAM，原间隔区相邻基序。2.2 akr1a1a−/− 突变体中的视网膜血管和肾小球基底膜的改变
糖尿病视网膜病变和糖尿病肾病是常见的微血管病变，而斑马鱼已被确立为研究眼部和肾脏改变的有价值的动物模型。首先使用Tg(fli1: EGFP)报告品系分析了玻璃体血管。在5天孵化后（5 dpf）收集斑马鱼幼鱼，并使用共聚焦显微镜拍摄图像。与**akr1a1a+/+**幼鱼相比，在5 dpf时，akr1a1a−/−幼鱼的玻璃体血管中识别出更多的分支和新生芽（图2A–D）。同时，与幼鱼中的情况相同，成年akr1a1a−/−斑马鱼的视网膜血管中也显示出比akr1a1a+/+成年鱼更多的分支和新生芽（图2E–G）。此外，虽然在光学显微镜下的PAS染色中未发现肾脏的明显改变（图S1A,B，支持信息），但在akr1a1a−/−成年鱼中使用电子显微镜观察到肾小球基底膜（GBM）的增厚（图2H,I）。综合来看，这些结果表明Akr1a1a的缺失导致了斑马鱼幼鱼玻璃体血管的改变，并持续到成年阶段。此外，Akr1a1a的缺失导致成年鱼GBM的增厚。因此，akr1a1a突变体显示出糖尿病视网膜病变和糖尿病肾病的早期标志。![]()
图2akr1a1a−/− Tg(fli1：EGFP)斑马鱼幼鱼和成鱼中的视网膜血管和肾脏改变
A）斑马鱼幼鱼玻璃体血管的代表性共聚焦图像。白色框：中央玻璃体/视神经动脉。白色箭头：环状内环玻璃体血管。B）**akr1a1a+/+和akr1a1a−/−**幼鱼玻璃体血管的代表性共聚焦图像显示了突变体中的血管改变。白色比例尺 = 20 µm。C,D）**akr1a1a−/−**幼鱼玻璃体血管中分支和新生芽形成增加的定量分析，每组n = 10–16。E）**akr1a1a+/+和akr1a1a−/−**成年斑马鱼视网膜血管的代表性共聚焦图像。白色比例尺 = 200 µm。F,G）**akr1a1a−/−斑马鱼成年视网膜血管中分支和新生芽形成增加的定量分析，每组n = 13–16。H,I）代表性电子显微镜图像和定量分析显示akr1a1a−/−**成年斑马鱼肾脏中增厚的肾小球基底膜（GBM）。红色箭头：GBM。白色比例尺，500 nm。统计分析采用学生t检验。*p < 0.05，**p < 0.01。2.3 akr1a1a−/− 幼鱼中的胰岛素受体信号通路下调
为了研究akr1a1a−/−突变体中改变的潜在机制，通过基因组RNA-Seq分析了akr1a1a+/+和akr1a1a−/−幼鱼在5dpf时的基因表达模式（图3A）。主成分分析（PCA）展示了每个样本的成分，显示akr1a1a+/+和akr1a1a−/−在PC1轴上完全分离（图S2A，支持信息）。质量控制显示akr1a1a突变体和野生型之间的性质相当（图S2B，支持信息）。随后，为了更好地理解Akr1a1a缺失所反映的生理信号通路变化，进行了基因集富集分析（GSEA）。在一系列改变的生物通路中，胰岛素受体及其下游信号通路，包括但不限于MAPK、蛋白磷酸化信号转导和跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路，在akr1a1a突变体中显著下调（图3B–F），这表明Akr1a1a的缺失导致斑马鱼幼鱼在5dpf时胰岛素信号传导受损。此外，还在野生型和纯合子幼鱼及肝脏中进行了代谢组学检测。在氨基酸、硫醇、腺苷和脂肪酸中，赖氨酸、腐胺和C20:3n6在突变体幼鱼中显著增加。C18:3n6和C20:3n6在突变体肝脏中显著增加，而胆固醇显著减少，这暗示了**akr1a1a−/−**幼鱼中胰岛素信号传导受损导致了蛋白质和脂肪酸合成及代谢过程的改变（图S3, S4，支持信息）。![]()
图3 akr1a1a−/− 斑马鱼幼鱼中下调的胰岛素受体信号通路及下游通路
A）幼鱼RNA-Seq的实验设计。每批次30条幼鱼，共6批次akr1a1a+/+和akr1a1a−/−斑马鱼幼鱼在5dpf时用于RNA分离。B）气泡图显示通过KEGG和GOBP分析在5dpf时akr1a1a−/−斑马鱼幼鱼中显著下调的生物通路。热图显示了C) 胰岛素受体信号通路、D) MAPK、E) 蛋白磷酸化信号转导和F) 跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路中相对mRNA表达在**akr1a1a−/−**斑马鱼幼鱼中的显著下调。较高和较低的表达分别以红色和蓝色显示。GSEA，基因集富集分析。dpf，受精后天数。KEGG，京都基因与基因组百科全书。GOBP，基因本体生物学过程。2.4 akr1a1a−/− 突变体表现出葡萄糖稳态受损和内源性ACR积累
尽管在**akr1a1a−/−**突变体中已验证了胰岛素信号传导受损，但葡萄糖稳态是否因此改变仍然未知。为了回答这个问题，分别在幼鱼和成年鱼中测量了体内葡萄糖和血糖水平。有趣的是，**akr1a1a−/−幼鱼在5dpf时的葡萄糖水平比akr1a1a+/+**幼鱼高出50%（图4A）。此外，akr1a1a−/−成年鱼在餐后高血糖（包括雄性和雌性）显示出明显的特征，而隔夜禁食后的血糖水平保持不变（图4B,C），证明Akr1a1a的永久性缺失可以在斑马鱼幼鱼和成年鱼中引发葡萄糖稳态受损。为了探究akr1a1a−/−突变体中葡萄糖稳态受损的潜在原因，通过RT-qPCR分析了前胰岛素（insa）和胰岛素受体（insra, insrb）的mRNA表达水平。由于akr1a1a主要在肝脏中表达（图1D），选择了幼鱼和肝脏作为目标器官。同时，分别测量了Akr1a1a潜在底物，包括ACR、乙二醛和甲基乙二醛。有趣的是，主要参与斑马鱼葡萄糖稳态调节的胰岛素编码基因insa在akr1a1a−/−幼鱼中未发生变化，但insra和insrb mRNA在akr1a1a−/−幼鱼中在5dpf时显著下降（图4D-F）。此外，在akr1a1a−/−成年鱼的肝脏中也发现insrb mRNA表达下降，insra mRNA表达趋势下降，这表明insra/insrb表达的减少是akr1a1a突变体中葡萄糖稳态受损和胰岛素信号传导改变的原因（图4G,H）。重要的是，在akr1a1a−/−突变体的幼鱼和肝脏中检测到蛋白质结合的ACR积累，而未发现乙二醛和甲基乙二醛的积累（图4I-L）。此外，使用ACR作为底物时观察到akr1a1a−/−幼鱼的AKR活性降低，证明Akr1a1a是斑马鱼中ACR的主要代谢酶（图4M）。进一步的研究表明，p70S6K磷酸化水平和丙酮酸的下降证实了葡萄糖稳态受损，并暗示了akr1a1a−/−肝脏中存在胰岛素抵抗（图4N,O）。然而，重要的糖酵解酶，如磷酸果糖激酶（pfk）和己糖激酶（hk1）的表达未发生变化，而丙酮酸激酶（pk）在akr1a1a−/−肝脏中增加（图S5A，支持信息）。除了表达分析外，还对磷酸果糖激酶（PFK）、丙酮酸激酶（PK）和葡萄糖激酶（GK）进行了酶活性测定。结果表明，PFK活性显著下降，而PK和HK活性未变，表明Akr1a1a敲除后糖酵解过程也部分受到影响（图4P；图S5B,C，支持信息）。最后，与先前关于Akr1a1b的研究不同，Akr1a1a的完全缺失并未上调S-硝基化蛋白（图S6，支持信息）。同时，akr1a1b−/−突变体显示insra/insrb mRNA表达、内源性ACR水平以及正常的玻璃体血管结构均未发生变化（图S7,S8，支持信息）。所有这些证据表明，斑马鱼Akr1a1a并不是调节S-硝基化的斑马鱼Akr1a1b和小鼠Akr1a1的功能同源物。此外，还测定了Glo1和ALDH酶活性，因为这两个酶系统在解毒RCS代谢物和AGEs前体方面与AKR酶系统具有相似的功能。然而，与akr1a1a+/+幼鱼相比，akr1a1a−/−幼鱼的Glo1和ALDH酶活性未发生变化，这表明Glo1和ALDH酶系统无法在斑马鱼中解毒积累的ACR（图S9A,B，支持信息）。![]()
图4 akr1a1a−/− 斑马鱼中葡萄糖和胰岛素相关基因表达的改变
A）akr1a1a−/−幼鱼在5dpf时表现出显著增加的全身葡萄糖水平。n = 8批次，每批次20尾幼鱼。B）akr1a1a−/−成年鱼在禁食状态下的血糖水平无论在雄性还是雌性中均未显示任何变化。n = 6–15。C）在餐后状态下，akr1a1a−/−成年鱼的血糖水平在雄性和雌性中均高于akr1a1a+/+成年鱼。n = 10–17。D）在5dpf时，insa基因表达水平在akr1a1a−/−幼鱼中与akr1a1a+/+幼鱼相比无变化；n = 5–6批次，每批次30尾幼鱼。E, F）insra和insrb mRNA表达在akr1a1a−/−幼鱼中在5dpf时均下调。n = 5–6批次，每批次30尾幼鱼。G, H）在akr1a1a−/−成年鱼的肝脏中，insra mRNA表达显示下降趋势，而insrb mRNA表达显著下调。n = 7–8。I）ACR在akr1a1a−/−幼鱼中显著增加。n = 6–7批次，每批次50尾幼鱼。J）ACR在akr1a1a−/−成年鱼的肝脏中显著积累，n = 5。K, L）乙二醛和MG在akr1a1a−/−幼鱼中未发生变化。n = 5–6批次，每批次50尾幼鱼。M）AKR活性（以ACR为底物）在akr1a1a−/−幼鱼中显著降低。n = 5–6批次，每批次50尾幼鱼。N）磷酸化的p70-S6K（P-p70-S6K）在**akr1a1a−/−成年鱼的肝脏中显著减少，n = 6。O）丙酮酸在akr1a1a−/−成年鱼的肝脏中显著减少，n = 5。P）PFK活性在akr1a1a−/−**成年鱼的肝脏中显著降低。统计分析使用了学生t检验。*p < 0.05。**p < 0.01。***p < 0.001。NS，表示无显著性差异。2.5 insra/insrb表达沉默引发了斑马鱼幼鱼的血管生成性玻璃体血管和葡萄糖稳态受损
为了探讨insra/insrb表达下调是否导致了葡萄糖稳态受损并引发了akr1a1a−/−斑马鱼中出现的血管生成表型，设计并使用了insra和insrb反义寡核苷酸（SB-insra-MO，SB-insrb-MO）作为工具，通过反义方法瞬时和部分沉默insra和insrb的表达。SB-insra-MO和SB-insrb-MO分别靶向insra/insrb的外显子3-内含子3和外显子7-内含子7的交界处（图S10A，支持信息）。将2纳克的寡核苷酸注射到野生型斑马鱼胚胎的一细胞阶段。通过RT-PCR验证了寡核苷酸的效率，显示在注射SB-insra-MO和SB-insrb-MO后，野生型insra/insrb表达下降，反义沉默的insra/insrb表达升高（图S10B，支持信息）。随后在insra/insrb沉默后分析了玻璃体血管。有趣的是，与akr1a1a−/−幼鱼类似，insra或insrb的沉默都可以导致野生型幼鱼玻璃体血管的改变（图5A–C）。此外，在5 dpf时，insra/insrb沉默组的全身葡萄糖水平显著增加（图5D）。此外，还测定了insra/insrb反义寡核苷酸鱼体内的AKR酶活性。结果显示，在使用常见底物DL-Glyceraldehyde时，AKR活性未显示出可检测的变化，而在使用ACR作为底物时，两个反义寡核苷酸鱼体内的AKR活性均显示出下降（图S11，支持信息）。总的来说，这些数据表明，Akr1a1a的永久性缺失导致的insra和insrb下调引起了葡萄糖稳态失衡和玻璃体血管的改变。此外，insra和insrb基因表达的部分丧失可能导致AKR酶解毒ACR能力的受损。![]()
图5 insra/insrb表达沉默引发了血管改变并导致5dpf时更高的葡萄糖水平
A）玻璃体血管的代表性共聚焦图像。白色比例尺：20 µm。B, C）对玻璃体血管的定量分析显示在insra/insrb沉默的幼鱼中在5dpf时分支和新生芽的数量显著增加。n = 12–14。D）全身葡萄糖测量显示在insra/insrb沉默的**akr1a1a+/+**幼鱼中5dpf时葡萄糖水平更高。n = 3–6批次，每批次20尾幼鱼。统计分析使用单因素方差分析（ANOVA）并结合Tukey多重比较检验。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。2.6 ACR通过降低insra/insrb mRNA表达导致玻璃体血管生成性改变和葡萄糖稳态受损
为了验证ACR是否是insra/insrb mRNA表达下降与Akr1a1a丧失之间的缺失连接，野生型幼鱼从1dpf到5dpf被孵育在外源ACR中。选择10 µM作为工作浓度，因为在处理后斑马鱼表现出稳定的存活率和正常的形态（图S12，支持信息）。随后分析了玻璃体血管的形态。有趣的是，在ACR处理后，玻璃体血管中观察到更多的分支（图6A–C）。进一步的ACR干预实验显示，与未处理的幼鱼相比，处理后的幼鱼insa mRNA的表达水平正常（图6D），全身葡萄糖显著升高（图6E），但insra/insrb mRNA表达减少（图6F,G），这与**akr1a1a−/−**幼鱼中的发现相呼应（图2B）。![]()
图6 ACR诱导的视网膜玻璃体血管改变和5dpf时insra/insrb mRNA表达的下调
A）玻璃体血管的代表性共聚焦图像。白色比例尺：20 µm。B, C）玻璃体血管的定量分析显示在孵育于10 µM ACR的akr1a1a1+/+幼鱼中分支数量显著增加。n = 13–16。白色比例尺 = 20 µm。D）在ACR处理后，akr1a1a1+/+幼鱼的insa mRNA表达未发生变化。n = 7批次，每批次30尾幼鱼。E）全身葡萄糖测量显示在5dpf时akr1a1a1+/+幼鱼中10 µM ACR处理后葡萄糖水平升高。n = 4批次，每批次20尾幼鱼。F, G）在10 µM ACR处理后，insra和insrb在**akr1a1a1+/+**幼鱼中的mRNA表达水平下降。n = 7批次，每批次30尾幼鱼。统计分析使用学生t检验。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。NS，表示无显著性差异。此外，为了理解ACR在转录组水平上如何发挥作用，我们对有无ACR处理的幼鱼进行了全基因组RNA-Seq分析。重要的是，胰岛素受体及其下游信号通路，包括MAPK、蛋白磷酸化信号转导和跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路也出现下调（图7A–E），这与akr1a1a−/−幼鱼中的早期发现相似（图3）。此外，由于AKT/PKB是关键的下游蛋白之一，并在胰岛素诱导的信号转导中被磷酸化，因此在akr1a1a+/+和akr1a1a−/−幼鱼以及ACR处理后的条件下测定了AKT/PKB的磷酸化情况。结果显示，与akr1a1a+/+对照相比，akr1a1a−/−幼鱼的AKT/PKB表达增加，但磷酸化的AKT/PKB显著减少。与akr1a1a+/+对照幼鱼相比，ACR处理的幼鱼表现出AKT/PKB总量不变但磷酸化AKT/PKB呈下降趋势（图7G,H）。![]()
图7 在ACR处理后的akr1a1a+/+斑马鱼幼鱼中下调的胰岛素受体信号通路
A）气泡图显示通过KEGG和GOBP分析，在5dpf时ACR处理后akr1a1a+/+斑马鱼幼鱼中显著下调的生物通路。热图显示了B) 胰岛素受体信号通路、C) MAPK、D) 蛋白磷酸化信号转导、E) 跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路中相对mRNA表达在ACR处理后的akr1a1a+/+斑马鱼幼鱼中显著下调。较高和较低的表达分别以红色和蓝色显示。F) 简明机制流程图展示了Akr1a1a丧失后ACR解毒受损的后果。G) 代表性的蛋白质印迹（Western Blot）显示了不同组别中总AKT和磷酸化AKT的水平。H) 定量分析了在ACR处理后的akr1a1a+/+和akr1a1a−/−斑马鱼幼鱼中AKT的磷酸化和总AKT表达。GESA，基因集富集分析。KEGG，京都基因与基因组百科全书。GOBP，基因本体生物学过程。统计分析使用单因素方差分析（ANOVA）并结合Tukey多重比较检验。*p < 0.05。NS，表示无显著性差异。以上所有数据表明，ACR直接导致了胰岛素受体信号传导受损并破坏了葡萄糖稳态。此外，在Akr1a1a丧失后积累且未解毒的内源ACR是**akr1a1a−/−**突变体中葡萄糖稳态受损和玻璃体血管改变的原因（图2, 6）。2.7 由ACR引起的玻璃体血管生成性改变可通过L-肌肽和PK11195进行拯救
ACR被报道为一种有毒的抗氧化剂，可能导致各种组织的改变，但玻璃体血管的改变是否由insra/insrb表达减少或直接由ACR引起仍然未知。因此，选择了能与ACR形成carnosine-ACR Michael加合物的RCS清除剂——L-肌肽和降糖药物PK11195进行与ACR的共同孵育实验。令人惊讶的是，L-肌肽和PK11195都能够逆转玻璃体血管的改变，这表明ACR通过改变葡萄糖稳态而非其自身的直接毒性作用导致了玻璃体血管的改变（图8）。此外，在akr1a1a−/−幼鱼中也进行了相同的拯救实验，经过L-肌肽和PK11195处理后观察到了正常化的玻璃体血管结构（图S13，支持信息）。总而言之，使用降糖药物和ACR清除剂成功逆转玻璃体表型，表明这些药物可能是治疗ACR诱导的血管改变的潜在候选药物。![]()
图8 L-肌肽和PK11195可以缓解ACR对5dpf时视网膜玻璃体血管的影响
A）玻璃体血管的代表性共聚焦图像。白色比例尺：20 µm。B）玻璃体血管的定量分析显示在孵育于10 µM ACR的akr1a1a1+/+幼鱼中分支数量显著增加，但在5dpf时通过L-肌肽（溶解在鱼卵水中）和PK11195（溶解在DMSO中）处理后得以拯救，n = 11–18。统计分析使用单因素方差分析（ANOVA）并结合Tukey多重比较检验。**p < 0.01，****p < 0.001。NS，表示无显著性差异。DMSO，二甲基亚砜。CAR，L-肌肽。PK，PK11195。3 讨论
本研究首次建立了Akr1a1a敲除斑马鱼模型，显示内源性ACR浓度增加。进一步研究证明，由于Akr1a1a缺失导致ACR解毒能力受损和内源性ACR浓度升高，这种情况引起胰岛素抵抗和葡萄糖稳态失调，进而导致幼鱼的玻璃体血管异常血管生成，并导致成年斑马鱼的血管生成和基膜厚度增加。2型糖尿病（T2DM）被认为是糖尿病的主要亚型，病例众多，特征为胰岛素抵抗。寻找导致胰岛素抵抗的初始触发因素变得愈发重要。更重要的是，深入了解胰岛素抵抗过程中的驱动因素有助于早期诊断和预防T2DM，并为潜在的治疗方法提供新见解。目前，已识别出几种风险因素，如异位脂质代谢物的积累、未折叠蛋白反应途径的激活及先天免疫途径，均被认为是胰岛素抵抗的潜在病理途径。然而，这些途径引发胰岛素抵抗的分子尚不明确。到目前为止，MG（美吉）作为有害反应代谢物，已被确定为糖基化终产物（AGEs）的主要前体，与胰岛素抵抗和微血管并发症的发展密切相关，但关于ACR是否参与胰岛素抵抗及糖尿病并发症的发生，相关研究数量有限。我们的斑马鱼研究坚定地支持内源性ACR升高导致高血糖，确定了与糖尿病相关的新代谢中间体。在斑马鱼中，我们发现由于Akr1a1a酶系统缺失而导致的过量ACR抑制了胰岛素受体a和b的表达，扰乱了胰岛素信号转导，最终导致葡萄糖稳态失调和糖尿病器官损伤。此外，本研究提供了一种高内源性ACR的新动物模型，为研究ACR在体内的生理功能提供了可能性和便利。ACR被认为是副产物，并伴随糖尿病视网膜病变和肾病的发生，这与脂质过氧化的失调有关。我们的结果也表明，在akr1a1a突变体中观察到血管生成的视网膜血管和基膜厚度增加，这与糖尿病视网膜病变和肾病早期病理变化一致。这引发了一个假设：ACR是高血糖和糖尿病并发症的标志还是成因。为了解决这个问题，我们使用了已知的降糖药PK11195和ACR清除剂L-肌肽，确定中和ACR或降低血糖是否可以阻止ACR引起的效应。有趣的是，ACR引起的玻璃体血管生成改变可以通过抗高血糖或抗ACR治疗逆转。这些数据提供了几个重要的启示。首先，这表明Akr1a1a是斑马鱼中解毒ACR的主要酶，AKR家族参与葡萄糖代谢和糖尿病。其次，表明积累的ACR作为上游代谢物，通过调节葡萄糖稳态引发有机改变。最后，除了作为糖尿病并发症的伴随物，本研究还确认了ACR，至少在斑马鱼中，作为导致胰岛素抵抗和糖尿病并发症的有效诱导因子，为糖尿病并发症治疗提供了新的治疗靶点。在临床研究中，升高的游离状态ACR或ACR加合物被确定为糖尿病及其并发症患者的明显特征。研究发现，ACR-赖氨酸加合物（FDP-赖氨酸）在1型和2型糖尿病患者的尿液中积累，且在伴随微量白蛋白尿的糖尿病患者中更加明显。此外，在终末期肾病患者中，2型糖尿病患者的FDP-赖氨酸水平明显高于非糖尿病组，这表明FDP-赖氨酸与糖尿病肾病有着紧密联系。此外，FDP-赖氨酸水平被认为可以作为糖尿病视网膜病变严重程度的生物标志物。然而，ACR在T2DM发病中的关键作用仍需进一步研究。基于我们的研究，动态监测内源性ACR浓度在临床上有望成为筛查前期糖尿病患者、早期诊断胰岛素抵抗患者及改善长期预后的策略。最后，本研究还提供了糖尿病治疗的另一种策略。一般治疗使用降糖药物和胰岛素增敏剂要求患者终身服药以实现理想的稳定的血糖控制。使用ACR清除剂（如肌肽）来治疗糖尿病及其并发症的可行性值得进一步研究。尽管本研究成功阐明了ACR升高对葡萄糖稳态的影响，但仍存在一些局限性。首先，尽管已确认ACR导致insra/insrb表达减少，但具体机制仍不明确。其次，akr1a1a−/−成年斑马鱼中由于PFK活性降低导致的糖酵解受损是否源于胰岛素抵抗，或部分由积累的内源性ACR引起，仍存在争议。最后，临床研究对确定ACR在预测胰岛素抵抗和前期糖尿病状态的敏感性和特异性至关重要。总之，本研究提供了确凿证据，证明ACR解毒能力不足及其浓度增加对通过胰岛素受体信号功能失调导致的葡萄糖稳态失调的发展具有重要贡献，为未来有关糖尿病病理生理学和治疗研究提供了新的方向。原文网址：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202101281#:~:text=Several%20enzyme%20systems%20are%20responsible%20for%20acrolein%20detoxification,%20such%20as
