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题目
链球菌（Streptococcus anginosus）促进小鼠胃部炎症、萎缩和肿瘤形成
研究亮点
S. anginosus在胃癌（GC）患者的胃黏膜中富集
S. anginosus在小鼠中诱导了胃炎-萎缩-化生-不典型增生的序列
S. anginosus促进了胃肿瘤的形成
TMPC-Annexin A2轴介导了S. anginosus的定植并激活了MAPK信号通路
摘要
链球菌（Streptococcus anginosus，S. anginosus）在胃癌（GC）患者的胃黏膜中富集。我们发现S. anginosus能够定植于小鼠胃部并诱导急性胃炎。在常规小鼠中，S. anginosus感染自发性地引发了逐步发展的慢性胃炎、壁细胞萎缩、黏液性化生和不典型增生，这些结果在无菌小鼠中得到了证实。此外，S. anginosus加速了致癌物诱导的胃部肿瘤形成以及YTN16胃癌细胞同种异体移植中的胃癌进展。研究还表明，S. anginosus破坏了胃部屏障功能，促进了细胞增殖并抑制了细胞凋亡。在机制上，我们识别出S. anginosus表面蛋白TMPC，该蛋白与胃上皮细胞的Annexin A2（ANXA2）受体相互作用。TMPC与ANXA2的相互作用介导了S. anginosus的附着和定植，并诱导了丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的激活。ANXA2的敲除消除了S. anginosus诱导MAPK的作用。因此，本研究揭示了S. anginosus通过TMPC-ANXA2-MAPK轴与胃上皮细胞直接相互作用，促进胃肿瘤发生的致病机制。关键词
胃癌；链球菌（Streptococcus anginosus）；表面蛋白；MAPK信号通路；无菌小鼠1. 引言
胃癌（Gastric Cancer, GC）是全球第五大常见癌症，也是癌症相关死亡的主要原因之一。幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, H. pylori）作为胃癌的主要风险因素，被列为I类致癌物。H. pylori感染会促进胃炎、萎缩和肠上皮化生（Intestinal Metaplasia, IM）的发生。然而，在感染H. pylori的人群中，只有1%至3%最终发展为胃癌，暗示其他因素的参与。新的证据表明，大量非H. pylori微生物群居住在胃黏膜中，它们的失调可能在胃癌发生中起到一定作用。然而，与胃癌相关的非H. pylori致病菌的识别和特性仍未被充分探索。为了探索非H. pylori胃部微生物群，我们对H. pylori阴性患者的胃部微生物进行了表征，涵盖了从浅表性胃炎、萎缩性胃炎、IM到胃癌的不同阶段，最终发现了包括链球菌（Streptococcus anginosus, S. anginosus）在内的五种在胃癌中富集的口腔病原菌。S. anginosus是一种革兰氏阳性、不形成芽孢、无动力的细菌，主要存在于口腔、鼻咽部、胃肠道和阴道，且可引发侵袭性化脓性感染如脓肿。S. anginosus对低pH条件（pH 3-5）具有很强的耐受性，这可能有助于其在胃黏膜中的存活。然而，S. anginosus在胃癌发生中的作用及其致病分子机制尚不清楚。在本研究中，S. anginosus被鉴定为一种非H. pylori病原体，其能够迅速引发急性胃炎，并在长期感染后引起常规小鼠和无菌小鼠的慢性胃炎、胃黏液性化生和不典型增生。S. anginosus还加速了胃癌的发生。机制上，我们发现S. anginosus表面蛋白TMPC能够直接与胃上皮细胞受体Annexin A2（ANXA2）相互作用，帮助其在胃黏膜中的定植，并介导了丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的激活。因此，我们的研究定义了一个非H. pylori病原体——S. anginosus，其直接促进了胃癌的发生。2. 结果
2.1 S. anginosus在感染2周后诱导小鼠急性胃炎
我们首先分析了内部16S rRNA基因测序数据集中S. anginosus在胃肿瘤形成不同阶段的丰度水平。与浅表性胃炎相比，S. anginosus在萎缩性胃炎和肠上皮化生（IM）中丰度增加，并在胃癌（GC）患者中达到了最高水平（图1A和图S1A）。在这一队列中，S. anginosus阳性的受试者患有萎缩性胃炎（AG）/IM和GC的比例显著增加（表S1）。一项在根除H. pylori后1年的随访研究也发现，S. anginosus与持续性胃部炎症相关（图S1B）。在一个独立的欧洲队列中，相较于浅表性胃炎，GC患者中S. anginosus丰度显著增加（p = 0.024）（图S1C）。此外，与相邻的正常组织相比，GC肿瘤中S. anginosus显著富集（p = 0.003）（图S1C）。这些研究表明S. anginosus在胃癌进展中的潜在作用。为探讨S. anginosus在小鼠胃部的致病作用，我们每3天灌胃一次S. anginosus，共持续2周（图1B）。这一灌胃间隔确保了S. anginosus在胃黏膜中的持续定植（图S1D）。脑心浸液（BHI）作为阴性对照，H. pylori SS1作为阳性对照。感染2周后，通过荧光原位杂交（FISH）在胃黏膜基底区观察到S. anginosus的定植（图1C）。通过PCR检测细菌DNA（图S1E）和新鲜胃组织中活菌的培养（图S1F）证实了S. anginosus的胃部定植。在S. anginosus感染的小鼠中，我们观察到了急性炎症，病理学家通过H&E染色发现黏膜下层中性粒细胞的浸润（图1D），并且根据既定的组织学评分标准，26%（23只中的6只）S. anginosus感染的小鼠表现出轻度至中度的炎症（图1E）。作为阳性对照，44.5%（18只中的8只）H. pylori感染的小鼠表现出轻度至中度炎症（图1E）。与S. anginosus诱导的急性炎症相一致，S. anginosus灌胃小鼠胃组织中的促炎性趋化因子的表达显著上调，通过小鼠炎症反应和自身免疫PCR芯片检测到这一变化（图1F）。通过qPCR验证了促炎性趋化因子Ccl20（p = 0.03）和Ccl8（p = 0.005）的上调，并且与BHI对照小鼠相比，S. anginosus感染的小鼠中这两种趋化因子的表达显著增加（图1G；表S2）。这些结果表明，S. anginosus感染的小鼠胃部急性炎症伴随着促炎性趋化因子的显著升高。![]()
图1. 链球菌（Streptococcus anginosus）定植于胃黏膜并促进急性炎症
(A) S. anginosus在浅表性胃炎（SG, N = 110）、萎缩性胃炎（AG, N = 117）、肠上皮化生（IM, N = 45）和胃癌（GC, N = 39）患者胃活检中的丰度。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。
(B) C57BL/6雄性小鼠被口服灌胃S. anginosus（n = 23）、幽门螺杆菌SS1（H. pylori, n = 18）或脑心浸液（BHI, n = 13），为期2周。
(C) 灌胃S. anginosus或BHI后2周，小鼠胃组织切片的代表性荧光原位杂交（FISH）图像（蓝色：细胞核，绿色：S. anginosus探针）；比例尺，20 μm。
(D) 感染S. anginosus、H. pylori SS1或BHI后2周的小鼠胃的代表性H&E染色图像；比例尺，100 μm。
(E) 不同组的小鼠胃炎症评分。评分0：无炎症；评分1：轻度；评分2：中度；评分3：重度；评分4：危重。
(F) 小鼠炎症反应和自身免疫PCR阵列显示，S. anginosus感染小鼠在感染后2周14个促炎基因上调。
(G) S. anginosus感染2周后，胃组织中Ccl8和Ccl20 mRNA水平上调。数据以均值±标准误（SEM）表示。每个点代表一个受试者。两尾Wilcoxon秩和检验（A）、Kruskal-Wallis检验（E）或Student’s t检验（G）用于检验组间的统计显著性差异。
另见图S1和表S1、S2和S4。
2.2 S. anginosus在感染3个月后诱导小鼠慢性胃炎
为了确定S. anginosus感染在胃部的长期影响，我们将感染模型延长至3、6、9和12个月（图2A）。S. anginosus感染对体重（图S2A）、食物摄入量（图S2B）或肝脏与体重的比率（图S2C）没有影响。肝功能标志物（丙氨酸转氨酶[ALT]和天门冬氨酸转氨酶[AST]）（图S2D）以及肾功能（肌酐<0.4 mg/dL）在S. anginosus感染的小鼠中保持正常。S. anginosus未引起结肠炎症（图S2E–S2G）。另一方面，在胃窦和胃体的基底部区域，S. anginosus持续感染扩展至胃黏膜层，通过FISH证实了这一点（图2B, S2H, S2I），并且通过新鲜胃组织的细菌培养确认了活的S. anginosus的存在（图S2J, S2K；表S3）。随着S. anginosus感染的进行，我们观察到慢性炎症的出现，从感染后3个月开始，胃黏膜下层持续有中性粒细胞浸润和淋巴细胞灶形成，这种现象持续到6、9和12个月（图2C）。与BHI对照小鼠相比，S. anginosus感染的小鼠在感染9个月时的胃炎症评分显著升高（p = 0.006），并在感染12个月时进一步加重（p < 0.0001）（图2D）。特别是，S. anginosus感染引发的炎症水平与H. pylori感染相当，尤其是在后期时间点。此外，与单独感染S. anginosus或H. pylori相比，联合感染这两种病原体在感染3个月后导致更严重的胃部炎症（图S3A–S3C）。与此一致的是，分析我们的内部数据集（图1A）显示，S. anginosus与H. pylori共同感染的受试者相比仅H. pylori感染者，其患萎缩性胃炎以及随后进展为IM和GC的相对风险更高（表S4）。这些结果表明，长期S. anginosus感染引起了与H. pylori感染相当的严重慢性胃炎，并且这两种病原体可能协同作用以促进胃部炎症。![]()
图2. 链球菌（Streptococcus anginosus）在小鼠中促进慢性胃炎
(A) C57BL/6雄性小鼠被口服灌胃S. anginosus（n = 5, 3个月；n = 7, 6个月；n = 5, 9个月；n = 17, 12个月）、幽门螺杆菌SS1（n = 10, 3个月；n = 8, 6个月；n = 8, 9个月；n = 8, 12个月）或脑心浸液（BHI）（n = 4, 3个月；n = 6, 6个月；n = 7, 9个月；n = 17, 12个月），感染时长为3、6、9和12个月。
(B) S. anginosus感染小鼠胃组织切片的代表性FISH图像（感染后3、6、9和12个月）（蓝色：细胞核，绿色：S. anginosus探针）；比例尺，20 μm。
(C) 灌胃BHI、H. pylori SS1和S. anginosus小鼠胃的代表性H&E染色图像（感染后3、6、9和12个月）；比例尺，100 μm。
(D) 对应的组织学评分显示了炎症和壁细胞萎缩情况。数据以均值±标准误（SEM）表示。每个点代表一个受试者。Kruskal-Wallis检验（D）用于确定组间的统计显著性。
另见图S2。
2.3 S. anginosus在感染9个月后诱发小鼠自发性胃萎缩、化生和不典型增生
胃肿瘤发生是沿着萎缩-化生-不典型增生的癌前病变序列进行的，胃炎是一个主要的风险因素。鉴于S. anginosus引起了慢性胃炎，我们探讨了长期感染是否会在胃黏膜中引发癌前病变。感染9个月后，S. anginosus感染导致轻度的壁细胞萎缩，12个月时进展为中度到重度萎缩（p = 0.01）（图3A）。此外，在S. anginosus感染的小鼠中，感染12个月后检测到黏液性化生（图3B）。重要的是，S. anginosus感染的小鼠在感染12个月后形成了低度不典型增生（图3C和3D）。对小鼠胃组织的FISH分析显示，S. anginosus在化生/不典型增生区域比非化生区域富集（图S3D）。作为阳性对照，H. pylori更快速地引起了胃萎缩，但在12个月时，黏液性化生的数量低于S. anginosus，且未检测到不典型增生（图3A、3B和3E）。与胃萎缩的发生一致，S. anginosus在感染9个月和12个月后显著提高了胃pH值（p < 0.05），与BHI对照组相比（图S3E和S3F）。为了确认黏液性化生，我们进行了阿利新蓝（Alcian blue）染色，这种染料常用于胃内的杯状细胞检测，以诊断肠上皮化生（IM）。如图3E所示，在S. anginosus感染的小鼠胃黏膜中发现了阿利新蓝阳性细胞，而在BHI对照组小鼠中未发现。我们还对化生标志物Griffonia simplicifolia lectin II（GSII）进行了免疫荧光染色（图3F）。与H&E染色下的化生变化一致，S. anginosus感染在感染12个月后显著增加了胃腺体中GSII阳性细胞的数量。此外，S. anginosus通过Ki-67（图3G）和增殖细胞核抗原（PCNA）染色（图3H）分别在感染6个月和12个月后诱导了胃黏膜中的细胞增殖。值得注意的是，另一种胃癌富集的口腔病原菌Parvimonas micra（图S3G）仅在感染12个月后在小鼠胃中引起了轻度到中度的炎症，未显示出胃萎缩或化生的迹象（图S3H和S3I），这表明胃肿瘤发生的诱导是S. anginosus特有的。总的来说，这些结果支持了S. anginosus感染特异性触发了胃黏膜中的一系列癌前变化，表现为逐步发展的壁细胞萎缩、黏液性化生和不典型增生，并伴随着细胞增殖的增加。![]()
图3. 链球菌（Streptococcus anginosus）在小鼠中引发胃萎缩、化生和不典型增生，并伴随胃屏障功能受损
(A 和 B) 对灌胃BHI、H. pylori SS1和S. anginosus的小鼠进行胃的组织学分析（感染后3、6、9和12个月），显示壁细胞萎缩和黏液性化生的存在。
(C) S. anginosus感染小鼠在感染12个月后胃的原位图像及对应的H&E染色图像，显示低度不典型增生；比例尺，100 μm。
(D) S. anginosus感染小鼠在感染12个月时胃部低度不典型增生（LGD）的发生率。
(E) 阿利新蓝染色（Alcian blue染色），作为黏液性化生标志物，显示在感染12个月后，S. anginosus和H. pylori感染小鼠胃体中的含有酸性黏蛋白的腺体；比例尺，100 μm。
(F) 在S. anginosus感染小鼠中，感染12个月后观察到异常的主细胞标志物（胃内在因子GIF）以及黏液颈细胞标志物（GSII）的表达增加；比例尺，50 μm。
(G 和 H) S. anginosus感染小鼠在感染6和12个月后显示胃部细胞增殖标志物Ki-67（G）和增殖细胞核抗原（PCNA）（H）表达水平升高；比例尺，100 μm。
(I) 与BHI对照组相比，S. anginosus感染小鼠在感染3、6、9和12个月后胃部紧密连接标志物Claudin18（CLDN18）、Occludin（OCLN）和紧密连接蛋白1（ZO-1）表达下调。
(J) 胃黏膜中CLDN18染色的代表性免疫荧光图像；比例尺，50 μm。数据以均值±标准误（SEM）表示。每个点代表一个受试者。Kruskal-Wallis检验（A和B）或Student’s t检验（G–I）用于检验组间的统计显著性差异。
另见图S3。
2.4 S. anginosus破坏小鼠胃部屏障功能及胃微生物组稳态
胃屏障功能的破坏是肿瘤转化的重要标志。Claudin18（CLDN18）是一种特异性表达于胃部的紧密连接蛋白。因此，我们通过Western blot检测了CLDN18及其紧密连接标志物Occludin（OCLN）和紧密连接蛋白1（ZO-1）的表达水平。正如图3I所示，与BHI对照组小鼠相比，S. anginosus感染小鼠的CLDN18（p < 0.001）、OCLN（p = 0.018）和ZO-1（p = 0.006）蛋白显著减少。免疫荧光染色显示，在S. anginosus感染3个月后，CLDN18在胃体颈部区域和胃窦基底部被破坏（图3J）。在感染9和12个月后，CLDN18的丧失在胃体或胃窦的整个腺体长度上更加明显。此外，S. anginosus感染功能上影响了胃屏障功能，通过增加MKN28和NCI-N87单层细胞中的跨上皮荧光素异硫氰酸酯（FITC）渗透性得到了证实（图S3J）。这些结果表明，S. anginosus感染导致胃屏障功能受损。为揭示S. anginosus或H. pylori感染后胃微生物组的变化，我们对急性期（2周）、慢性期（3和6个月）及癌前期（9和12个月）阶段的感染小鼠胃黏膜进行了16S rRNA测序。与急性和慢性期相比，癌前期阶段的S. anginosus感染富集了Sutterella、Parabacteroides及口腔共生菌Bacteroides、Prevotella和Aggregatibacter，同时减少了如Bifidobacterium pseudolongum和Lactobacillus等益生菌（图S3K）。研究表明，Prevotella和Aggregatibacter在胃癌患者的口腔中比健康受试者显著增多，且Aggregatibacter在胃癌的胃微生物组中也较浅表性胃炎患者显著富集。网络分析进一步强调了在癌前期阶段，B. pseudolongum与S. anginosus之间存在负相关（图S3L；表S5）。这表明S. anginosus感染可能通过增加口腔共生菌并减少胃内的益生菌，来加剧其促炎性和促肿瘤效应。与我们的发现一致的是，口腔微生物群，包括链球菌，与假胃窦化的肠上皮化生炎症微环境有关。同时，H. pylori在癌前期阶段富集了Lactobacillus、Streptococcus、Eubacterium和Prevotella，并减少了B. pseudolongum（图S3M和S3N；表S5）。2.5 S. anginosus在无菌小鼠中自发诱导黏液性化生
我们进一步探讨了S. anginosus是否能够作为单一菌株促进胃肿瘤形成。为此，我们将S. anginosus接种到无菌小鼠体内，感染9个月（图4A）。通过FISH、PCR和qPCR证实了S. anginosus在无菌小鼠胃黏膜中的成功定植，并且新鲜胃组织的细菌培养显示了活的S. anginosus的存在（图4B–4E）。对BHI对照小鼠的组织学评估未显示异常，而S. anginosus感染小鼠在感染9个月后出现了黏液性化生（8只中的3只；p = 0.035）（图4F和4G）。同样，S. anginosus促进了细胞增殖，表现为Ki-67阳性细胞的增加（p = 0.007）（图4H和4I）。S. anginosus显著下调了CLDN18和OCLN蛋白的表达，表明S. anginosus在无菌小鼠中破坏了胃部的紧密连接（图4J）。综上所述，我们在无菌小鼠中的研究结果证实了S. anginosus直接推动胃肿瘤形成的致病效应。![]()
图4. 链球菌（Streptococcus anginosus）在无菌小鼠中促进黏液性化生
(A) 无菌BALB/c小鼠每周灌胃一次S. anginosus（n = 8）或脑心浸液（BHI）（n = 10），持续9个月。
(B–E) 通过FISH（比例尺，20 μm）（B）、PCR（C）、新鲜胃黏膜组织细菌培养（D）和qPCR（E）确认了S. anginosus在无菌小鼠中的定植及细菌负荷。
(F) 来自无菌小鼠灌胃S. anginosus或BHI的胃黏膜代表性H&E染色图像；比例尺，200 μm。
(G) 显示了黏液性化生评分。
(H 和 I) S. anginosus感染的无菌小鼠中细胞增殖标志物Ki-67上调；比例尺，50 μm。
(J) 在S. anginosus感染的无菌小鼠胃中，紧密连接标志物CLDN18和OCLN表达下调。数据以均值±标准误（SEM）表示。每个点代表一个受试者。Mann-Whitney U检验（E）和Student’s t检验（G, I, J）用于检验组间的统计显著性差异。
2.6 S. anginosus在体内促进YTN16同种异体移植瘤的生长
为了研究S. anginosus是否促进胃癌（GC）的进展，我们建立了一个GC同种异体移植模型，通过皮下移植小鼠GC YTN16细胞（一种微卫星不稳定性GC模型，表S6）到C57BL/6小鼠体内，随后对移植瘤进行S. anginosus的瘤内注射（图5A）。S. anginosus显著促进了移植瘤的生长（p < 0.01）（图5B）。实验结束时，注射S. anginosus的小鼠肿瘤体积（图5C）和肿瘤重量（图5D）显著增加，相比之下，注射磷酸盐缓冲液（PBS）的对照组小鼠肿瘤体积和重量较小。与此一致的是，在YTN16同种异体移植瘤中，S. anginosus促进了细胞增殖，并抑制了细胞凋亡，表现为Ki-67阳性细胞增加（图5E）和末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）阳性细胞减少（图5F）。我们还建立了一个正位胃癌同种异体移植小鼠模型，将YTN16细胞注射到小鼠胃浆膜层中。从第二周开始，每3天灌胃一次S. anginosus，持续6周。实验结束时，与灌胃BHI对照组小鼠相比，S. anginosus感染小鼠的肿瘤重量（p = 0.03）和肿瘤与胃重量比（p = 0.003）显著增加（图5G–5I）。为了评估S. anginosus对GC细胞状态的影响，我们进一步对S. anginosus感染的正位YTN16胃癌瘤体进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）（图S4A）。恶性细胞的无监督聚类分析鉴定了7个细胞亚群，表明YTN16肿瘤中存在显著的异质性（图S4B）。与对照组相比，S. anginosus感染降低了分化的GC细胞比例，增加了激活炎症反应、上皮–间质转化（EMT）和血管生成途径的细胞群（图S4C和S4D；表S7）。接下来，我们基于scRNA-seq数据集映射了肿瘤浸润免疫细胞。S. anginosus感染的YTN16肿瘤富集了促炎性Th17细胞、免疫抑制性的肿瘤相关巨噬细胞（Angio-TAM和LA-TAM）、多形核髓样抑制细胞（PMN-MDSCs）和耗竭的CD8+ T细胞（图S4E–S4H），推测S. anginosus促进了促炎性和免疫抑制性肿瘤微环境。这些结果表明，S. anginosus与YTN16的相互作用改变了细胞状态，并重塑了GC中的肿瘤微环境，从而促进了肿瘤的发生。总体而言，这些数据表明S. anginosus在体内促进了GC同种异体移植瘤的生长。![]()
图5. 链球菌（Streptococcus anginosus）加速小鼠胃癌的发展
(A) 在YTN16胃癌同种异体移植模型中，C57BL/6小鼠每5天进行一次S. anginosus（105菌落形成单位 [CFU]，n = 10）或PBS（n = 10）的瘤内注射。
(B–D) S. anginosus或PBS注射的YTN16同种异体移植瘤的肿瘤生长曲线（B）、肿瘤图像（C）及肿瘤重量（D）。肿瘤重量以均值±标准误（SEM）表示。**p < 0.01。
(E) Ki-67染色显示，S. anginosus注射小鼠肿瘤中的细胞增殖率较PBS对照组小鼠显著增加；比例尺，50 μm。
(F) 末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色显示，S. anginosus感染小鼠肿瘤中的凋亡细胞减少；比例尺，50 μm。
(G) 在YTN16正位胃癌模型中，C57BL/6小鼠每3天灌胃一次S. anginosus（2×10^9 CFU，n = 21）或BHI（n = 19），持续6周。
(H 和 I) (H) 肿瘤的代表性图像，(I) 肿瘤重量及肿瘤/体重比，在BHI或S. anginosus感染组中进行了比较。
(J) N-甲基-N-硝基脲（MNU）诱导的胃癌模型中，C57BL/6小鼠接受5个周期的MNU（240 ppm）治疗，随后灌胃S. anginosus（每3天，n = 11）、H. pylori SS1（每3天，2周内总共5次，n = 18）或BHI（每3天，n = 13），直至36周。
(K) BHI和S. anginosus感染小鼠胃的代表性图像显示胃窦部位的腺瘤；比例尺，50 μm。S. anginosus和H. pylori感染小鼠的肿瘤发生率较高。
(L) 与BHI组相比，S. anginosus感染小鼠的肿瘤数量和肿瘤大小更大。
(M) BHI和S. anginosus感染MNU小鼠胃的代表性H&E染色图像；比例尺，100 μm。病理学诊断显示，S. anginosus单一定植的MNU小鼠中高等级不典型增生的比例更高。
(N) Ki-67染色显示，S. anginosus感染小鼠的增殖率高于BHI组；比例尺，50 μm。数据以均值±标准误（SEM）表示。每个点代表一个受试者。双向方差分析（ANOVA）（B）、卡方检验（K）、Mann-Whitney U检验（L/肿瘤数量）和Student’s t检验（D–F, I, L/肿瘤大小, N）用于检验组间的统计显著性差异。
另见图S4和表S6。
2.7 S. anginosus加速小鼠胃肿瘤的发生
为明确S. anginosus在胃肿瘤形成中的作用，我们建立了N-甲基-N-硝基脲（MNU）诱导的胃癌小鼠模型（图5J）。经过9个月的MNU处理后，在胃窦部观察到胃部病变（图5K和图S4I）。与对照组小鼠（13只中的4只）和H. pylori感染的小鼠（18只中的12只，p < 0.05）相比，S. anginosus感染的小鼠显示出显著增加的肿瘤发生率（11只中的10只，p = 0.003）（图5K和图S4J）。同样，S. anginosus感染的小鼠的肿瘤数量（p = 0.006）和肿瘤大小（p < 0.05）均显著高于仅接受MNU处理的对照小鼠（图5L）。组织学检查显示，36.4%的S. anginosus感染小鼠有高等级不典型增生（HGD），这一比例高于仅接受MNU处理的小鼠（15.4%）（图5M），且与H. pylori感染的小鼠相当（22.2%的HGD和5.6%的腺癌）（图S4K）。相应地，通过Ki-67染色分析，S. anginosus感染的小鼠相比于仅接受MNU处理的小鼠表现出更高的细胞增殖率（p < 0.05）（图5N）。这些研究结果共同推断出，S. anginosus加速了MNU诱导的小鼠胃肿瘤形成。
2.8 S. anginosus表面蛋白TMPC通过与胃上皮细胞ANXA2受体结合介导S. anginosus的定植
鉴于我们发现S. anginosus能够定植在小鼠的胃黏膜中，我们进一步研究了该细菌的粘附特性。细菌粘附和侵入实验表明，S. anginosus（感染复数 [MOI] = 50）可以粘附并侵入AGS和Ges-1细胞（图6A）。随后，我们进行了扫描电子显微镜（SEM）观察，结果显示S. anginosus（<1 μm，球菌样形态）附着在AGS和Ges-1细胞的表面，且显示出明显的病原体-宿主界面（图6B）。这表明S. anginosus可能通过与胃上皮细胞的直接相互作用发挥其致癌作用。为了揭示S. anginosus附着和侵入胃上皮细胞的潜在机制，我们试图识别能够与宿主受体结合的细菌粘附素。通过生物素下拉实验，我们探测了S. anginosus粘附素与Ges-1膜蛋白的潜在相互作用（图6C）。质谱分析鉴定出三种S. anginosus蛋白，其中仅TMPC为表面蛋白（表S8）。TMPC是一种属于ATP结合盒（ABC）样转运蛋白家族的脂蛋白，其功能是转运嘌呤核苷酸。TMPC的同源性比对表明，其与链球菌属的其他细菌具有高度同源性，许多这些细菌在胃癌活检中富集（图S5A）。S. anginosus中的tmpc基因表现为持续表达，其表达水平不受胃上皮细胞接触的影响（图S5B）。我们随后寻找了TMPC在胃上皮细胞中的结合受体。我们在大肠杆菌中表达了带谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签的TMPC重组蛋白（GST-TMPC），并通过GST下拉实验与Ges-1膜蛋白结合（图6D）。在Ges-1和AGS细胞中鉴定出了10多个候选条带（图6E和图S5C）。这些细胞系的候选蛋白重叠分析揭示了ANXA2是TMPC的共同受体（表S8）。共免疫沉淀（co-IP）实验表明，在Ges-1和AGS细胞中GST-TMPC能够下拉ANXA2，这一结果通过反向共免疫沉淀使用抗ANXA2抗体得到了验证（图6F和图6G）。此外，通过重组ANXA2和重组GST-TMPC进行的共免疫沉淀实验和微尺度热泳（MST）分析，进一步确认了TMPC和ANXA2的直接相互作用（图6H和图6I）。MST是一种分析生物分子相互作用的革新技术，它显示ANXA2与TMPC的表观解离常数（Kd）为57.4 μM（图6I）。通过小导向RNA（sgRNA）敲除Ges-1和AGS细胞中的ANXA2，验证了TMPC-ANXA2在介导S. anginosus定植于胃上皮细胞中的功能作用（图6J）。ANXA2敲除后，与阴性对照（sgNC）细胞相比，S. anginosus的附着和侵入显著受到了抑制（图6K和图S5D）。为了确定TMPC在S. anginosus诱导胃肿瘤发生中的功能重要性，我们利用插入失活技术（图6L）构建了缺失TMPC蛋白表达的S. anginosus tmpc突变株（图6M和图S5E）。与野生型S. anginosus相比，S. anginosus tmpc突变株在体外显示出显著减弱的细胞粘附和侵入能力（图6O和图S5F），且无法在体内诱导YTN16同种异体移植瘤的生长（图6P和图6Q）。综上所述，这些发现证实了S. anginosus通过其表面蛋白TMPC与胃上皮细胞上的ANXA2受体结合来介导定植，并在肿瘤发生中具有功能上的重要性。![]()
图6. 链球菌（Streptococcus anginosus）通过TMPC-Annexin A2（ANXA2）轴与胃上皮细胞相互作用
(A) 细菌粘附和侵入实验显示S. anginosus在与AGS和Ges-1细胞共培养后附着并侵入细胞（每组n = 3）。
(B) S. anginosus与AGS和Ges-1细胞共培养后的代表性扫描电子显微镜（SEM）图像。高倍放大图像显示了细菌与细胞的粘附。
(C) 通过生物素下拉实验结合银染和质谱分析，鉴定出位于S. anginosus表面的37 kDa蛋白TMPC。
(D 和 E) GST或GST-TMPC与GST磁珠一起孵育Ges-1膜蛋白以进行GST下拉实验。GST-TMPC与Ges-1细胞膜蛋白组中的对应条带经过质谱分析。
(F) 通过GST下拉实验从Ges-1和AGS细胞裂解物中下拉到ANXA2。
(G) 免疫沉淀实验进一步显示ANXA2与GST-TMPC的阳性结合。
(H) 重组ANXA2与GST-TMPC直接结合，通过GST下拉实验确定。
(I) 微尺度热泳（MST）分析显示TMPC与ANXA2的结合亲和力，解离常数（Kd）为57.4 μM。
(J 和 K) 在Ges-1或AGS细胞中敲除ANXA2显著降低了S. anginosus对上皮细胞的粘附和侵入能力（每组n = 3）。
(L) S. anginosus中tmpc的插入失活示意图。构建了质粒pUC19-TmpcTErmb并转化至S. anginosus中以进行同源重组。
(M) S. anginosus插入突变株的PCR分析。细菌染色体DNA用作PCR模板。使用Tmpc-F/R引物验证Ermb插入。
(N) S. anginosus和S. anginosus tmpc突变株TMPC蛋白水平分析。
(O) S. anginosus tmpc突变株的粘附和侵入能力较野生型显著降低（每组n = 6）。
(P) 在YTN16胃癌同种异体移植模型中，C57BL/6小鼠每周一次进行S. anginosus（105 CFU，n = 7）、S. anginosus tmpc突变株（105 CFU，n = 7）或PBS（n = 7，50 μL）的瘤内注射。
(Q) 肿瘤生长曲线（箭头表示S. anginosus注射）、肿瘤图像及注射S. anginosus、S. anginosus tmpc突变株或PBS的YTN16同种异体移植瘤的肿瘤重量。数据以均值±标准误（SEM）表示。每个点代表一个受试者。双向ANOVA（Q）和Student’s t检验（K, O, Q）用于组间统计显著性检验。****p < 0.0001。
另见图S5和表S8。
2.9 S. anginosus通过TMPC-ANXA2相互作用激活MAPK信号通路
为了研究S. anginosus诱导胃癌发生的下游信号机制，我们对感染S. anginosus的常规小鼠（12个月）和对照小鼠的胃组织进行了RNA测序。火山图显示，在S. anginosus感染的小鼠中，有1,727个基因上调，1,020个基因下调（图7A和图S6A）。通路富集分析发现了多个癌基因通路上调，包括Ras、MAPK和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-AKT通路（图7B）。富集得分显示，MAPK信号通路在S. anginosus感染中显著被激活（图7C）。通过Western blot分析，我们观察到在S. anginosus感染的小鼠中，p-ERK1/2、p-JNK和p-AKT蛋白表达显著增加，同时下游Cyclin D1表达也被诱导（图7D）。我们在MNU胃癌小鼠模型中（9个月）验证了这一发现，S. anginosus同样显著增加了p-ERK1/2（p = 0.006）、p-AKT（p = 0.006）、p-c-Jun（p = 0.002）蛋白表达，并伴随着下游Cyclin D1（p = 0.048）和c-Myc（p = 0.018）的诱导（图7E）。此外，在无菌小鼠中，感染9个月后，S. anginosus也诱导了胃部的p-ERK1/2和p-JNK表达（图S6B）。与之相一致的是，S. anginosus与Ges-1和AGS细胞共培养时，迅速增加了p-ERK1/2、p-AKT和p-JNK蛋白表达（图7F）。S. anginosus还能够粘附并侵入KRAS野生型胃癌细胞系MKN28和NCI-N87（图S6C），并激活MAPK信号通路（图S6D）。S. anginosus激活MAPK信号通路的关键依赖于TMPC-ANXA2的相互作用。在Ges-1和AGS细胞中敲除ANXA2后，S. anginosus对p-ERK1/2、p-AKT和p-JNK的诱导作用被消除（图7G）。重组TMPC蛋白也能够在AGS和NCI-N87细胞中诱导p-ERK1/2、p-AKT和p-JNK的表达（图S6E）。此外，在体内的YTN16同种异体移植瘤中，TMPC的缺失阻止了S. anginosus对p-ERK1/2和p-JNK的诱导作用（图7H）。这些结果共同表明，S. anginosus通过TMPC-ANXA2相互作用激活了MAPK信号通路，从而促进其在胃上皮中的促肿瘤作用。![]()
图7. 链球菌（Streptococcus anginosus）通过TMPC-ANXA2轴激活MAPK信号通路
(A) 火山图显示S. anginosus感染小鼠（n = 3）与BHI对照小鼠（n = 3）胃组织中差异表达基因（DEGs）的RNA测序数据（p < 0.05，倍数变化 [FC] ≥ 1.5）。结果来自三组生物重复实验。
(B) RNA测序数据集中DEGs的KEGG通路富集分析。圆圈的大小表示通路中DEGs的比例。红色：上调，蓝色：下调。
(C) 基因集富集分析（GSEA）显示Ras和MAPK信号通路的富集情况。
(D) Western blot分析显示S. anginosus感染的小鼠与BHI对照组相比，MAPK信号通路的激活，p-ERK、p-JNK、p-AKT以及下游Cyclin D1表达增加（每组n = 6）。
(E) S. anginosus在MNU诱导的胃癌发生模型中激活MAPK信号通路，感染9个月后c-Myc和c-Jun的下游表达增加（每组n = 6）。
(F) S. anginosus与Ges-1和AGS细胞共培养6小时后，激活MAPK信号通路（每组n = 3）。
(G) ANXA2敲除逆转了S. anginosus激活的MAPK信号通路（每组n = 3）。
(H) TMPC蛋白缺失抑制了S. anginosus在YTN16同种异体移植胃癌模型中诱导的MAPK信号激活（每组n = 4）。数据以均值±标准误（SEM）表示。每条Western blot图像的条带代表一个受试者。Student’s t检验用于比较组间的统计显著性（D, E, H）。
另见图S6。
3. 讨论
幽门螺杆菌（H. pylori）长期以来被认为是胃肿瘤发生的致病因素，但随着疾病进展到萎缩、化生和胃癌（GC）阶段，其在胃黏膜中的优势地位逐渐减弱。基于这一观察，我们着手探索非幽门螺杆菌微生物群在胃癌中的作用。通过对不同胃癌阶段胃黏膜样本的宏基因组分析，我们发现S. anginosus在胃癌中富集，是一种潜在的致病菌。我们在此证明了S. anginosus在胃肿瘤形成中的因果关系，并揭示了S. anginosus通过与胃上皮细胞的相互作用来驱动癌症发生的机制。S. anginosus能够在小鼠胃中定植并引发急性炎症反应，上调包括Ccl20和Ccl8在内的促炎细胞因子，随后进入伴有持续性胃炎的慢性阶段。慢性炎症是胃肿瘤发生的环境诱因。与此一致的是，我们发现长期S. anginosus感染导致了渐进性的胃病理变化，包括壁细胞萎缩、黏液性化生和不典型增生。通过组织学、阿利新蓝阳性细胞和GSII阳性黏液颈细胞的增加、胃内在因子（GIF）阳性主细胞的减少，我们确认了S. anginosus诱导的化生转化。与常规小鼠的结果一致，S. anginosus在无菌小鼠中的单一感染也引发了黏液性化生的发展，表明S. anginosus本身足以驱动胃肿瘤形成，而不依赖其与胃微生物群的相互作用。除其固有的致癌作用外，S. anginosus在癌前阶段引起了胃pH值的升高和胃微生物群的改变，富集了病原性的口腔共生菌（Prevotella和Aggregatibacter），并减少了益生菌B. pseudolongum。这种由S. anginosus感染引起的胃微生物失调可能有助于形成胃内促炎和促肿瘤的微环境。相关研究表明，人类胃癌微生物群的粪便移植到无菌小鼠中会引发一系列癌前变化。我们的研究突出了S. anginosus作为非幽门螺杆菌病原菌，在小鼠胃中驱动胃炎和癌前萎缩-化生-不典型增生序列的作用，同时伴随着胃微生物群的重编程。为进一步探讨S. anginosus的促癌潜力，我们评估了其对YTN16同种异体移植瘤和MNU诱导自发胃癌的影响。在两种小鼠实验中，S. anginosus显著促进了胃癌的发生。S. anginosus在皮下和正位癌模型中均加速了YTN16同种异体移植瘤的生长，并且在MNU模型中，S. anginosus治疗加剧了不典型增生的转化，特别是在高等级、局部浸润性不典型增生中的肿瘤发生率增加。与其促癌作用一致，S. anginosus感染驱动了胃黏膜和肿瘤中的细胞增殖。此外，我们表明，S. anginosus感染损害了胃屏障功能，随着时间的推移，紧密连接标志物CLDN18、OCLN和ZO-1的表达减少。紧密连接对于维持细胞极性至关重要，其破坏是上皮肿瘤发生的标志。CLDN18是胃中特有的紧密连接蛋白，其丧失会导致小鼠自发性肿瘤的发生。紧密连接的损害还促进细菌粘附和侵入胃黏膜上皮细胞，从而建立持久的定植并破坏胃黏膜。我们的结果表明，S. anginosus通过促进细胞增殖和破坏胃屏障完整性，加速了胃肿瘤的发生。细菌粘附常常是肿瘤发生的先决步骤。鉴于S. anginosus在胃上皮中的致癌作用，我们阐明了其与胃上皮的直接相互作用。S. anginosus能够附着并侵入胃上皮细胞。我们鉴定了S. anginosus表面的粘附素TMPC，它能够直接与胃上皮细胞受体结合。共免疫沉淀实验显示TMPC作为胃细胞表达的ANXA2的配体。重组TMPC和ANXA2的实验验证了它们的直接相互作用，解离常数（Kd）为57.4 μM。这一相互作用对S. anginosus的致癌功能至关重要，因为tmpc基因的遗传敲除消除了S. anginosus的粘附、侵入和致瘤性。与我们的观察一致，TMPC被报道为肺炎链球菌相关肺部感染和毒力所必需的蛋白，表明该蛋白在链球菌定植中的致病作用。另一方面，敲除其相应受体ANXA2显著减少了S. anginosus对人胃癌细胞的附着和侵入。研究表明，ANXA2已被鉴定为大肠杆菌和铜绿假单胞菌等其他细菌的受体。综上所述，S. anginosus主要通过TMPC-ANXA2蛋白复合物与宿主胃上皮细胞相互作用。S. anginosus与胃上皮细胞的相互作用启动了致癌信号级联反应。转录组分析和KEGG分析揭示，MAPK信号在S. anginosus感染小鼠中显著富集。MAPK信号通路已被证实通过激活ERK、JNK和p-38激酶三个亚家族在胃癌进展中发挥作用。ERK在促进细胞增殖中起关键作用，而JNK和p38与细胞凋亡和炎症密切相关。S. anginosus在体外和体内诱导了胃细胞中ERK和JNK的磷酸化，进而激活了下游的p-AKT、Cyclin D1、c-Myc和c-Jun等靶点，这些靶点在细胞存活、增殖和凋亡调控中发挥重要作用。此外，ANXA2的缺失消除了S. anginosus介导的p-ERK、p-AKT和p-JNK的激活，从而证实了TMPC-ANXA2相互作用在MAPK激活及其促肿瘤效应中的重要性。支持ANXA2作为促肿瘤因子的作用，已有研究表明ANXA2促进RalA依赖的ERK1/2信号传导，并激活JNK-p53通路。总之，我们鉴定了S. anginosus作为非幽门螺杆菌的病原菌促进胃肿瘤的发生。S. anginosus感染自发引发了胃炎及癌前萎缩-化生-不典型增生的序列，并在小鼠模型中加速了胃肿瘤的发生。我们阐明了S. anginosus的毒力表面因子TMPC通过与胃上皮细胞上的ANXA2结合，介导细菌的粘附、侵入及下游致癌MAPK信号通路的激活。我们的研究为S. anginosus作为胃癌发生阶段的致病因素提供了证据。3.1 研究的局限性
本研究存在一些局限性。首先，虽然我们阐明了S. anginosus与宿主胃癌之间的相互作用，但其与肿瘤微环境中的其他细胞（如免疫细胞和成纤维细胞）的潜在相互作用应在未来研究中进一步探讨。其次，S. anginosus是否能够与其他胃癌富集的病原体协同作用或在胃癌进展过程中被益生菌拮抗也值得进一步研究。尽管存在这些局限性，我们的研究提供了非幽门螺杆菌微生物可能促进胃癌发展的证据。原文网址：
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(24)00006-0
