【文献解读】SH2E蛋白缺失导致斑马鱼心脏缺陷
文摘
科学
2024-09-29 17:00
江苏
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文献：Liang YL, Hu YX, Li FF, You HM, Chen J, Liang C, Guo ZF, Jing Q. Adaptor protein Src-homology 2 domain containing E (SH2E) deficiency induces heart defect in zebrafish. Acta Pharmacol Sin. 2024 Sep 23. doi: 10.1038/s41401-024-01392-8. Epub ahead of print. PMID: 39313516.杂志：ACTA PHARMACOLOGICA SINICA影响因子：6.9
适配蛋白在多种信号转导途径中发挥着重要作用。含有Src同源2域的适配蛋白E（SH2E）在斑马鱼胚胎发育过程中在血管内皮细胞和心肌中高表达。本研究探讨了SH2E在心脏生成中的功能和机制。我们首先分析了SH2E的时空表达，然后利用CRISPR-Cas9系统构建了缺失SH2E的斑马鱼模型。结果显示，纯合突变体从受精后第3天起出现逐渐加重的心包水肿（PCE）、心房扩张、异常的房室循环以及房室壁增厚，直至死亡；诱导性过表达SH2E能够部分挽救PCE表型。转录组测序分析表明，MAPK/ERK和NF-κB信号通路可能与SH2E缺失引起的PCE相关。该研究强调了SH2E在心脏生成中的关键作用，可能有助于开发新型诊断技术和治疗先天性心脏病的策略。介绍
SH2（Src同源2）域作为一种蛋白模块，已被认定为多种具有独特功能的蛋白质的共同特征，包括蛋白酪氨酸激酶、转录因子和分子适配蛋白。基本上，含SH2域的蛋白通过与下游靶蛋白中的酪氨酸磷酸化序列结合，调节多种重要的细胞过程。先前的研究表明，这些蛋白参与细胞骨架重组、稳态、免疫反应和发育等过程，尤其与心血管疾病密切相关。例如，含SH2域的蛋白酪氨酸磷酸酶1（SHP-1）与颈动脉斑块脆弱性相关。在PTPN11中发生的错义获得功能突变导致一半的Noonan综合症（NS）病例，NS患者相对普遍（约每2500至1000名活产中有1例），并且常伴有显著的心脏缺陷，如肺动脉瓣狭窄、间隔缺损和肥厚型心肌病（HCM）。PTPN11中的一些其他突变，如失功能突变Y279C，除了NS表型外，还与皮肤色素异常相关，形成了另一种称为Leopard综合症（LS）的综合征。进一步研究发现，SHP-2通过ERK/SMAD信号通路防止心肌梗死后的心脏重塑，而在心肌细胞中缺失Ptpn11（Shp2）则通过ERK/MAPK和RhoA信号通路导致扩张型心肌病。在斑马鱼模型中，Shp2变异体也被发现通过激活MAPK信号通路引起心脏位移缺陷。适配蛋白是信号传递中的关键组成部分，拥有多种蛋白结合模块，充当桥梁，将不同的蛋白结合伙伴连接在一起，组装复杂的信号分子。这种复杂的分子机制对细胞内信号的有效传递至关重要。细胞通过将多种蛋白编排成相互连接的网络，来实现对不同环境条件的最佳信号响应。含有SH2域的适配蛋白种类繁多。例如，含SH2域的适配蛋白p66Shc调节心肌的线粒体功能，其缺失增加了小鼠在短期缺血和再灌注反应中的心肌损伤易感性。适配蛋白SH2域含E（SH2E）于1997年首次被发现，在小鼠的心脏、肺、脑和骨骼肌中表达。Wong等和Chen等报告SH2E在斑马鱼胚胎早期发育阶段的血管内皮细胞、侧线原基和一组神经细胞中也高度表达。这些结果表明SH2E可能参与早期胚胎的心血管系统发育，然而这一点尚未被报道。心脏生成过程及其调控心脏发育的遗传信号网络在脊椎动物中高度保守，这使得在其他物种中系统地研究心脏生成及模拟人类心脏疾病成为可能。斑马鱼是研究心脏结构和功能的理想动物模型，其胚胎在体外发育且在早期阶段透明，便于实时观察心脏发育。此外，借助荧光蛋白报告基因技术，可以模拟心脏特异性基因的内源性表达模式，从而实现对斑马鱼胚胎中细胞生成、迁移、增殖和分化的精确观察。斑马鱼胚胎在受精后24小时（hpf）形成相对完整的主要血管网络，心脏开始收缩，血液循环得以建立。在胚胎发育的第一周，斑马鱼能够通过皮肤从水中获取氧气以满足生长需求。即使在缺乏血液循环的情况下，它们仍能正常存活几天。而在其他脊椎动物模型中，早期胚胎心脏发育异常往往会导致胚胎死亡。近年来，基因编辑技术（如锌指核酸酶（ZFN）、转录激活因子样效应核酸酶（TALENs）和聚类规律间隔短回文重复（CRISPR）/Cas系统）的快速发展，使研究人员能够大规模准确构建和筛选具有基因突变或基因敲除的斑马鱼模型。这些优势和特征证明了斑马鱼是研究心脏发育和模拟人类心脏疾病的理想模型。在本研究中，我们利用CRISPR/Cas9系统构建了两条缺失SH2E的斑马鱼模型，这些胚胎表现出心包水肿（PCE）、房室结构异常以及早期死亡。MAPK/ERK和NF-κB信号通路可能与SH2E缺失导致的PCE相关。我们的研究强调了SH2E在心脏生成中的关键作用，并可能有助于开发新的诊断技术和治疗先天性心脏病（CHD）的策略。SH2E在心肌和血管中高度表达
我们首先分析了斑马鱼SH2E蛋白序列（登录号：XP_689987.3），该蛋白由438个氨基酸组成，与人类SH2E蛋白（登录号：NP_001010846.1）显示出46%的同一性（57%的相似性），与小鼠SH2E蛋白（登录号：NP_766118.3）显示出44%的同一性（56%的相似性）（图1a）。结果表明，SH2E在脊椎动物中具有进化保守性。通过实时定量PCR（rt-qPCR）检测到斑马鱼胚胎中SH2E的mRNA水平，结果显示SH2E在受精后10小时（hpf）开始表达，在第1天（dpf）迅速增加，随后逐渐减少，但保持持续表达（图1b）。接下来，我们通过原位杂交（WISH）分析SH2E的空间表达，结果显示在第1天的斑马鱼胚胎中，SH2E在背主动脉（DA）、后方主静脉（PCV）、段间血管（ISVs）、头部血管和侧线原基（LLP）中表达（图1c）。血管中的SH2E表达逐渐减少，并在第3天几乎消失。此后，SH2E在侧线中的表达增加，并在第5天的神经元突起中显著表达。有趣的是，在第5天发现了SH2E在心房中的表达。为了进一步验证，我们进行了数字化荧光原位杂交（dc-FISH）以定位SH2E的表达，结果显示SH2E与心肌标记物nkx2.5在第2天有显著的共定位（图1d）。![]()
使用CRISPR/Cas9系统生成SH2E缺失的斑马鱼为了探索SH2E的体内功能，我们利用CRISPR/Cas9系统构建了SH2E敲除斑马鱼模型。如方法部分所述，CRISPR的两个靶点位于SH2E的第一个外显子，以诱导SH2E缺失（图2a）。图2b显示，单独注射Cas9 mRNA的胚胎PCR产物能够完全切割，而与gRNA1/2共同注射的产物则未能被相应的识别酶完全切割，这初步确认了基因编辑的发生。此外，突变的基因组序列（图2b中的未切割条带）通过测序得到了确认（图2c）。结果显示，确认了两种导致SH2E蛋白翻译提前终止的框移突变（G59R fs和S82R fs）（图2d）。同时，还建立了另外两种没有框移突变的突变体（Δ12和Δ6），这些突变体导致少量氨基酸缺失，但不会提前终止翻译（图2d）。综上所述，我们获得了两条用于SH2E功能研究的框移突变体和两条可以作为对照的氨基酸缺失突变体。![]()
图2 使用CRISPR/Cas9系统实现了SH2E缺乏在共同注射了Cas9 mRNA和gRNAs的幼鱼中，未发现成年同基因型突变体，这表明SH2E在胚胎发育中的重要性。由于SH2E在血管中富集，我们观察了SH2E缺失是否影响了与Tg(kdrl:egfp)背景的SH2E+/G59R fs成年鱼的早期血管发育。结果显示，在24 hpf和30 hpf的SH2E+/G59R fs自交胚胎中，血管发育没有明显异常，背主动脉（DA）、后方主静脉（PCV）和段间血管（ISV）的形成没有延迟，表明SH2E缺失并未影响早期胚胎的动静脉分化和血管生成（图3a）。![]()
图3 双等位基因SH2E缺乏在3天后发育的斑马鱼幼鱼中诱导心包水肿（PCE）基于SH2E在心肌中的高表达，我们还关注了与Tg(cmcl2:mcherry)背景的SH2E+/G59R fs胚胎的心脏生成，这是一种标记心肌的斑马鱼转基因株系。一些胚胎在第3天（dpf）出现轻微的心包水肿（PCE），到第5天时PCE加重且更加明显（图3b）。令人惊讶的是，SH2E+/G59R fs自交胚胎中PCE的发生比例约为25%（图3c）。根据孟德尔遗传定律，我们推测这些PCE胚胎的基因型为同型SH2EG59R fs/G59R fs，这一推测通过Fnu4H I消化进行基因分型得到了证实（图3d）。进一步的原位杂交（WISH）结果显示，SH2E+/G59R fs自交幼鱼中功能性SH2E mRNA的表达在SH2E+/G59R fs（SH2E+/-）中相较于SH2E+/+降低，在SH2EG59R fs/G59R fs（SH2E−/−）中则更低（图4a）。通过实时定量PCR检测正常SH2E mRNA，发现SH2E+/G59R fs自交的PCE幼鱼，即SH2EG59R fs/G59R fs突变体中的SH2E mRNA水平显著降低（图4b）。SH2EG59R fs/G59R fs突变体在第8到10天开始出现死亡（图4c），而SH2E+/+和SH2E+/G59R fs则能够发育为成年鱼。此外，约四分之一的SH2E+/S82R fs自交幼鱼也出现了PCE（图4d），其中SH2E mRNA水平显著降低（图4e）。而SH2E+/Δ12或SH2E+/Δ6的自交幼鱼没有显示PCE，并能够发育为成年鱼（图4d）。值得注意的是，在SH2E+/S82R fs自交胚胎中也观察到了持续的PCE和早期死亡（数据未显示），这进一步确认了这些表型特异性地由SH2E基因的同型框移突变引起。![]()
图4 SH2E的移码突变是导致斑马鱼幼鱼心包水肿（PCE）所必需的为了进一步确认SH2E功能缺失对心脏特定结构的影响，我们观察了与Tg(cmlc2:mcherry)背景的SH2E缺失胚胎的心脏结构。结果显示，在同型SH2E缺失胚胎中，心房显著扩大，心脏环状结构的位置不正确，导致在第5天时心室和心房未能正确分隔（图5a）。苏木精-伊红（H&E）染色进一步验证了这些发现（图5b）。此外，在第4天的SH2EG59R fs/G59R fs胚胎中可以观察到心房和心室壁的增厚（图5b）。![]()
图5 可诱导的SH2E过表达部分挽救了由SH2E缺乏引起的围心包水肿（PCE）接下来，我们构建了一个由热休克蛋白Hsp70L驱动的可诱导SH2E过表达系统，以研究SH2E过表达是否能拯救SH2EG59R fs/G59R fs胚胎的PCE表型（图5c）。该系统在受精卵的1-4细胞阶段即时注射。第2天在37 °C的恒温箱中进行热休克30分钟。热休克后8小时，可以在躯干中观察到普遍表达的红色荧光（图5d），这表明SH2E成功过表达。在第5天，注射了过表达系统的SH2E+/G59R fs自交胚胎表现出显著低于未注射对照的PCE比例（图5e）。以上结果证明，SH2E缺失特异性地诱导了同型胚胎的心脏缺陷（包括PCE、异常的心脏环状结构和心房-心室壁增厚），而SH2E过表达部分拯救了PCE表型。MAPK/ERK和NF-κB信号通路可能参与了SH2E缺乏引起的PCE为了探究SH2E缺失所涉及的信号通路，我们进行了转录组测序，并分析了2 dpf和3 dpf SH2EG59R fs/G59R fs幼鱼与其野生型兄弟之间的差异表达基因（DEGs）。在2 dpf的SH2EG59R fs/G59R fs幼鱼中筛选出了23个上调基因和25个下调基因（图6a，b），而在3 dpf幼鱼中则筛选出了13个上调基因和19个下调基因（图6c，d）。GO注释显示，2 dpf SH2E突变体中的DEGs富集于发育过程和分子跨膜运输过程（图6e），与3 dpf幼鱼的结果一致（图6f）。在2 dpf和3 dpf幼鱼中分别有8个上调基因和6个下调基因重叠（图6g）。我们通过实时定量PCR验证了测序结果，并选择了几个先前报道与心脏生成相关的潜在下游基因进行进一步探索（图6h）。![]()
其中，tcap被报道与斑马鱼中通过形态学干扰素（MO）敲低导致的PCE相关。Nphp4的敲低也会通过影响Nodal信号导致斑马鱼幼鱼中心脏的不对称发育，从而引起PCE。我们向SH2E+/G59R fs自交的受精卵中注入了体外合成的tcap和nphp4 mRNA，以测试它们是否受SH2E缺失的影响。然而，结果显示，tcap（图7a）和nphp4（图7b）的瞬时过表达均未减少5 dpf SH2E+/G59R fs自交幼鱼的PCE比例。转录组测序结果显示，2 dpf SH2EG59R fs/G59R fs幼鱼中dusp10的下调（MAPK/ERK信号抑制因子）引人关注（图6h）。为了验证SH2E缺失是否影响了MAPK/ERK信号通路，我们对SH2E+/G59R fs自交胚胎在10 hpf时进行了PD184352（MAPK/ERK信号通路抑制剂）处理。结果显示，尽管PD184352能够导致SH2E+/+同胞出现PCE，但在5 dpf的SH2E+/G59R fs自交幼鱼中，出现PCE的比例明显呈剂量依赖性增加（图7c，d）。令人惊讶的是，BAY11-7082（NF-κB信号通路抑制剂）处理显著降低了5 dpf SH2E+/G59R fs自交幼鱼中PCE的发生比例（图7e，f）。此外，虽然AKT抑制剂VIII的处理也能诱导SH2E+/+同胞出现PCE，但5 dpf SH2E+/G59R fs自交幼鱼中PCE的增加幅度相似（约10%）（图7g，h）。这些结果表明，MAPK/ERK和NF-κB信号通路可能参与了SH2E缺失引起的PCE。![]()
图7 MAPK/ERK和NF-κB信号通路可能参与由SH2E缺乏引起的PCE心脏发育的遗传网络在脊椎动物中高度保守，这使得在其他物种中模拟人类先天性心脏病（CHD）成为可能。脊椎动物的心脏生成经历了复杂的形态发育和细胞分化，主要分为三个阶段：心脏环形、汇聚和楔形。心脏环形是指原本直且对称的心脏管转变为不对称的心脏环，异常的心脏环形可能导致畸形心脏的发育。斑马鱼的心脏环形发生在28至36小时后胚胎（hpf），并在大约48 hpf结束，形成心房和心室两个独立的腔室。尽管到那时心脏的主要结构已经建立，后续的发育和成熟仍需一些辅助结构的支持，比如心包。心包来源于心脏环形后位于心房与心室连接部位近腹侧的前心包。前心包在3 dpf时增殖并覆盖所有心肌，形成成熟的心包。心包不仅向心肌传递信号，还能产生心脏中的常驻细胞，如成纤维细胞。心脏发育中的细胞和分子事件在脊椎动物中高度保守，例如，转录因子nkx2.5在哺乳动物和斑马鱼心脏生成中都是必不可少的。心脏生成受多种信号分子和通路（如G蛋白偶联受体、蛋白激酶等）的调控，这些调节信号的准确传递依赖于适配蛋白。正如之前提到的，含SH2结构域的适配蛋白在心脏疾病中发挥着重要作用，但其机制尚未完全阐明。先前的研究显示，SH2E在小鼠心脏中表达以及在斑马鱼内皮细胞（ECs）中表达，尤其是在24 hpf时。为了解SH2E在心脏生成中的作用，我们检查了24 hpf后SH2E的表达，此时斑马鱼心脏开始发育，血液循环也已建立。与之前的报告一致，我们的研究结果显示，24 hpf的斑马鱼胚胎中，SH2E在背主动脉（DA）、后心静脉（PCV）、段间血管（ISV）、头部血管和侧线系统中高度表达（图1c）。有趣的是，血管中的SH2E表达逐渐减少，而在侧线系统中逐渐增加，尤其是在神经元窝中。这表明SH2E可能只在新生的内皮细胞中表达并发挥作用，以支持内皮细胞的成熟。令人意外的是，由于SH2E缺失，DA、PCV和ISV并没有明显的异常。这可能意味着SH2E在动静脉分化和血管生成中的功能存在冗余。尽管如此，考虑到SH2E在血管系统中的高表达，我们仍无法完全排除其对动静脉发育和ISV芽生的影响。因此，需要进行更深入和详细的研究，例如SH2E是否影响DA、PCV和ISV的结构和腔室大小等。Dc-WISH 实验显示，SH2E 与 nkx2.5（心脏祖细胞（CPCs）的标志物）共定位，这些祖细胞最终将发育为成熟的心肌。我们发现 SH2E 在 2–5 dpf 的心肌中表达（图1c，d），这是心脏腔室重塑和冠状动脉在心包下形成的时期，同时小梁细胞通过原始层迅速扩展，形成小梁层。这些结果表明，SH2E 可能在心肌重塑和冠状动脉血管生成中发挥不同作用。为了验证这一点，我们建立了两种具有 SH2E 框移突变（G59R fs 和 S82R fs）的斑马鱼系，以及两种没有框移突变的系（Δ6 和 Δ12）（图2d）。根据观察，只有 SH2E 的双等位基因缺失表现出明显的表型，表现为心房扩张、心房与心室分化受损、4 dpf 时心房和心室壁增厚（图5b），并在 3–5 dpf 期间出现显著的 PCE（图3b），最终在 10 dpf 时提前死亡（图4c）。这些表型仅在两个双等位基因 SH2E 缺失的系中观察到，说明在杂合子 SH2E 缺失和非框移突变的幼鱼中也存在一定的冗余。换句话说，正常功能的 SH2E 对维持正常心脏生成是不可或缺的。我们的诱导性救援实验进一步验证了这一假设。与对照组（UIC）相比，SH2E 的过表达有效降低了 SH2E+/G59R fs 自交胚胎中 PCE 的比例（图5e），这意味着短暂过表达 SH2E 可以部分救援 SH2EG59R fs/G59R fs 胚胎中的 PCE。然而，SH2E 的过表达并没有完全救援 PCE（图5d），因为其普遍的过表达并不具有组织特异性。因此，筛选在心脏组织中特异性过表达 SH2E 的品系可能有助于进一步救援因 SH2E 缺失引起的表型。在转录组测序中筛选出的差异表达基因（DEGs）中，tcap 和 nphp4 的下调显得尤为引人注目。如前所述，MO 抑制 tcap 和 nphp4 都会导致斑马鱼出现 PCE。为了验证 tcap 或 nphp4 是否为 SH2E 的下游基因，我们在 SH2E+/G59R fs 自交的受精卵中进行了这两个基因的瞬时过表达。然而，结果显示单独过表达 tcap 或 nphp4 并未减少 PCE 胚胎的比例，这表明单独的 tcap 或 nphp4 不足以救援由于 SH2E 缺失引起的表型（图7a，b）。tcap 和 nphp4 的下调可能是 SH2E 缺失的次要后果。如上所述，PTPN11（SHP2）的功能获得突变会导致 Noonan 综合征（NS）。进一步研究显示，NS 主要是由 RAS/MAPK 信号通路中组成部分或调节因子的功能获得（激活）突变引起的，该通路对细胞周期分化、增长和衰老至关重要。Dusp10 编码 MAPK/ERK 信号通路的抑制因子，并且在 2 dpf 的 SH2E 缺失突变体中下调（图6h）。因此，SH2E 缺失是否通过抑制 dusp10 导致心脏生成异常（如 PCE）是一个非常有趣的研究方向。令人惊讶的是，当用 PD184352（一种 MAPK/ERK 信号通路抑制剂）处理幼鱼时，更多的 SH2E+/G59R fs 自交幼鱼表现出 PCE，且这一现象呈剂量依赖性（图7c，d）。我们的结果表明，在 SH2E 缺失的情况下，MAPK/ERK 的激活在心脏生成的维持中起到了保护作用。这提示精确调控的 MAPK/ERK 信号通路对于正常的心脏生成至关重要，因为该通路的过度激活和抑制似乎都会导致病理状态。尽管存在争议，已有研究表明，NF-κB 活性对 Ang II 等激动剂诱导的心肌肥厚表型是必需的，同时也与后生期心室细胞中心房利钠肽（ANF）的增加相关，这是一种重要的胎儿基因激活和病理重塑的标志。NF-κB 还可以通过 PLCgamma1 的 SH2-SH2-SH3 结构域在大鼠 3Y1 血管成纤维细胞中被激活。在之前的体内研究中，NF-κB 的抑制并未克服因高梯度主动脉束带引起的肥厚，也没有改变应激引起的重塑进程。有趣的是，我们的结果显示，NF-κB 抑制（通过 BAY11-7082 抑制剂）对 SH2E 缺失诱导的心脏畸形有保护作用（图7e，f）。这些结果表明 SH2E 可能在 NF-κB 信号通路的上游发挥作用。这个现象引人关注，因为它有助于更好地理解 SH2E 和 NF-κB 信号在心脏发育中的功能。作为适配蛋白，SH2E 是否通过招募 NF-κB 亚单位并直接调节其磷酸化来发挥作用？还是通过结合其他分子间接促进 NF-κB 信号？这些问题将在后续研究中进一步探讨。除了 MAPK 激活外，PI3K/AKT 信号通路在 Shp2 功能丧失突变导致的 LS 中也被激活。引发 LS 的 Shp2 突变（LS-Shp2）激活的 AKT 信号与小鼠中的肥厚型心肌病（HCM）相关。Bonetti 等人报告称，尽管携带 LS-Shp2 的斑马鱼胚胎中的 pAKT 水平升高，但并未观察到 HCM。在此我们证明，虽然 AKT 抑制剂 VIII 处理能够使约 10% 的野生型同胞发生 PCE，但在 5 dpf 时，SH2E+/G59R fs 自交幼鱼中 PCE 的比例（基线约 25%）并未显著增加或减少（图7g，h）。这些结果表明，尽管 AKT 信号可能与心脏缺陷相关，但 SH2E 缺失引起的 PCE 可能与 AKT 信号无关。总之，我们利用 CRISPR-Cas9 系统建立了 SH2E 缺失的斑马鱼系，发现双等位基因 SH2E 缺失导致从 3 dpf 开始的渐进性 PCE、心房扩张、异常的心房-心室环状结构和心房-心室壁增厚。这表明 MAPK/ERK 和 NF-κB 信号通路可能参与 SH2E 缺失引起的 PCE。需要进一步深入研究，以明确 SH2E 如何在细胞水平上影响心脏的发育及心房与心室的正确定位，以及直接与 SH2E 互动的分子。通过这样的研究，我们能够全面理解 SH2E 的功能。然而，我们的研究为 SH2E 在心脏发育中的重要作用提供了可靠的体内实验证据，也可能有助于识别创新的诊断技术和治疗策略以应对先天性心脏病（CHD）。斑马鱼的饲养和品系
斑马鱼品系 Tubingen，Tg(fli1:EGFP)、Tg(kdrl:EGFP) 和 Tg(cmcl2:mcherry) 的饲养、繁殖和分期方法与之前的研究一致。鱼的饲养和实验程序遵循了上海长海医院动物实验伦理委员会（ECAE）的相关规定（批准号：2020020）。所有实验方法均符合相关的伦理和法规要求，且本研究遵循 ARRIVE 指南。在SH2E基因开放阅读框（ORF）对应于外显子1的基因组区域中选定了两个合适的靶点，并设计了相应的gRNA。这两个靶点分别命名为位点1和位点2，其中野生型位点1的DNA序列可以被Fnu4HI内切酶（R0178L, NEB, 北京，中国）彻底切割，而野生型位点2的DNA序列可以被Cfr10I内切酶（R0682S, NEB, 北京，中国）彻底切割。我们从第一代注射的胚胎（定义为F0）中随机选取了15个胚胎，提取了基因组，然后通过PCR（TransDirect® 动物组织PCR试剂盒，AD201-01，TransGen Biotech, 北京，中国）、限制性内切酶消化和Sanger测序（BioSune, 上海，中国）来鉴定敲除结果。对于F1代及后续的突变体，通过尾鳍获取基因组，并通过上述相同的步骤进行鉴定。Cas9和gRNA mRNA是通过使用T7 RNA聚合酶（10881775001, Roche, 德国）进行体外转录合成的。在单细胞阶段，将Cas9 mRNA和gRNA共同注射到受精卵中。每个受精卵注射了含有200 ng/μL Cas9 mRNA和100 ng/μL gRNA的1纳升混合溶液。我们设计了引物（Primer Premier 5）来扩增gRNA靶向区域，通过Fnu4HI或Cfr10I消化区分野生型和突变体，并通过Sanger测序筛选出创始者。用于基因分型的引物（由BioSune, 上海，中国合成）列在补充表S1中。使用T7聚合酶（与上述相同）合成了地高辛标记的探针。然后，如先前描述的那样，在幼鱼中进行了WISH实验。使用立体显微镜（Discovery.V20，Zeiss，德国奥伯科亨）拍摄了图像。SH2E探针合成的序列在补充表S1中描述。两天的野生型幼鱼迅速用4%的PFA（158127，Sigma-Aldrich，MO，美国）固定，并用于dc-FISH。Nkx2.5探针用地高辛-UTP（11209256910，Roche，德国）标记，而SH2E探针用荧光素-UTP（11427857910，Roche，德国）标记。标记、原位杂交信号放大和可视化的程序如先前所述[29]。简而言之，胚胎用2%的阻断试剂（11096176001，Roche，德国）阻断1小时，并在第二天用抗地高辛-POD fab片段（11207733910，Roche，德国，1:1000）的溶液中孵育。样本用含有Cy3（PerkinElmer，英国，1:50）的缓冲液在暗处染色40分钟。然后，用4%的PFA（同上）停止染色反应。胚胎再次用2%的阻断试剂（同上）阻断，并在抗荧光素-POD fab片段（11425527910，Roche，德国，1:1000）的溶液中孵育。胚胎用含有FITC（PerkinElmer，1:50）的缓冲液染色20分钟。最后，所有样本都用Leica SP5共聚焦显微镜（Wetzlar，德国）在适当的滤镜下观察。nkx2.5和SH2E探针合成的序列在补充表S1中描述。整个幼鱼（SH2E+/G59R fs杂交）在2 dpf或3 dpf时被收集。在麻醉（Tricaine, A5040, Sigma, MO, 美国）后，每个幼鱼的身体用刀片从躯干中间（靠近卵黄延伸的后部）切为两半。带有心脏的前半部分放入1.5 mL离心管中，加入100 μL TRIzol试剂（15596018CN, Invitrogen, CA, 美国），并储存在-80 °C。同时，带有尾巴的后半部分用于基因分型。具有相同基因型（SH2E+/+ 或 SH2EG59R fs/G59R fs）的幼鱼身体的前半部分分别作为RNA测序的一个样本。每个组至少有30个胚胎以确保RNA的产量≥1 μg。根据先前报道的协议从幼鱼中提取总RNA。RNA测序由上海的WuXiNextCODE进行。总RNA是从幼鱼前体部分提取的，如RNA测序所述。提取的总RNA用于通过使用Super Script II逆转录酶（18064071，Invitrogen，加利福尼亚州，美国）和随机引物对mRNA进行cDNA的生成。使用SYBR Green（QPK-201，Toyobo，日本大阪市）进行Rt-qPCR。相对RNA量是通过2-ΔΔCt方法计算并以内部对照β-actin进行标准化的。用于mRNA检测的引物列在补充表S1中，并由上海的Biosune有限公司提供。首先克隆了SH2E的编码序列，并将其与Hsp70L启动子连接。然后将连接的序列插入到含有mCherry编码序列的pCS2+报告载体中，以便于转基因斑马鱼的选择。将100皮克（pg）的Hsp70L-SH2E-mcherry构建体与50皮克的转座酶RNA共注射到1-4细胞阶段的SH2E+/G59R fs杂交胚胎中。未注射的胚胎作为对照组。在2天后，注射的胚胎在37°C下热激30分钟。八小时后，使用Leica SP5共聚焦显微镜（与上述相同）观察和成像热激胚胎。用于克隆SH2E CDS的引物列在补充表S1中。整个幼鱼（SH2E+/G59R fs incross）在4天后收集。在麻醉后，每个幼鱼的身体从躯干中间（靠近卵黄延伸的后部）用刀片切成两部分。带有心脏的前部分用4%的PFA固定过夜。同时，带有尾巴的后部分用于基因分型。身体的前部分被嵌入石蜡中，以4微米的厚度连续切片，并按照之前描述的方法进行H&E染色。通过注射体外合成的mRNA实现了tcap和nphp4的瞬时过表达。使用Sp6（P1081，Promega，威斯康星州，美国）按照先前描述的方法合成了加帽的mRNA。在SH2E+/G59R fs杂交胚胎的一细胞阶段，注射了2纳升的mRNA，浓度如所示。在我们应用的浓度下，未观察到异常的致死性。所使用的抑制剂均购自上海贝时科技有限公司（中国），并使用二甲基亚砜（DMSO）（D8418，Sigma-Aldrich，密苏里州，美国）溶解以制备不同浓度。为了测试预防SH2E缺乏引起的表型，野生型和SH2E+/G59R fs杂交胚胎从10小时后胚胎期（hpf）到5天后胚胎期（dpf）分别用PD184352（一种MAPK/ERK信号通路抑制剂）、BAY11-7082（一种NF-κB信号通路抑制剂）或AKT抑制剂VIII在指定浓度下进行孵化。每24小时更换一次培养基。所有治疗组的最终DMSO浓度均≤0.5%重量/体积（w/v）。药理治疗结束时，每条幼鱼均用蔡司立体显微镜（同上）进行观察和成像。所有实验均进行了三次。数据以平均值 ± 标准误（SEM）表示，并使用GraphPad Prism 7.0软件（GraphPad Software, CA, 美国）进行分析。使用Shapiro-Wilk检验评估正态性。对于符合正态分布的数据，进一步进行Levene方差齐性检验。当数据表现出方差齐性时，应用学生t检验或单因素方差分析（ANOVA）。P < 0.05被认为具有统计学意义。原文地址：https://www.nature.com/articles/s41401-024-01392-8
注：因文章篇幅有限，所有相关引用文献，以及补充素材可以点击至原文查阅。
苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过六年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。![]()
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