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题目：
Silibinin 通过靶向 FTH1 减轻了急性肾损伤中的 ferroptosis。
摘要：
急性肾损伤（AKI）主要由肾脏缺血再灌注损伤（IRI）引起，这是最常见的诱因之一。目前，预防和治疗措施仍然有限。Ferroptosis 在 IRI 诱导的 AKI 的病理生理过程中起着重要作用，并被认为是改善其预后的一项关键目标。Silibinin 是一种多酚类黄酮，具有多种药理特性，并被广泛用作治疗肝病的有效药物。最近的研究报告表明，Silibinin 可能改善肾脏疾病，但其潜在机制尚不清楚。在本研究中，我们探讨了 Silibinin 是否能够保护 IRI 诱导的 AKI 及其作用机制。我们的研究结果表明，Silibinin 预处理能够减轻 IRI-AKI 小鼠的肾功能障碍、病理损伤和炎症。此外，结果还显示，Silibinin 在体内和体外均抑制了 ferroptosis。蛋白质组微阵列被用于鉴定 Silibinin 的靶点，我们的结果显示 Silibinin 与 FTH1 结合。这种结合亲和力通过分子对接、SPRi、CETSA 和 DARTS 得到确认。此外，co-IP 实验表明 Silibinin 破坏了 NCOA4-FTH1 相互作用，抑制了 ferritinophagy。最后，Silibinin 对 ferroptosis 的抑制作用在体外通过敲低 FTH1 被逆转。总之，我们的研究表明，Silibinin 通过靶向 FTH1 来减轻 ferroptosis，从而有效缓解 AKI，提示 Silibinin 可能被开发为管理和治疗 AKI 的潜在治疗药物。关键词：急性肾损伤，Silibinin，Ferritin heavy chain 1，Ferroptosis，Ferritinophagy
1. 引言
急性肾损伤（AKI）是一种常见的临床综合征，其特征是快速的肾功能障碍，表现为血清肌酐升高和尿量减少。每年约有1330万人遭受AKI，这一状况通常与高死亡率、不良结局和显著的社会负担密切相关。肾脏缺血再灌注损伤（IRI）是 AKI 的最常见诱因，通常由手术或创伤、脓毒症、脱水和药物的肾毒性引起。肾脏 IRI 涉及多种病理机制，包括炎症、内皮功能障碍、肾小管细胞损伤和死亡。目前，我们对 IRI 的预防和治疗的理解仍然有限。因此，研究和理解导致肾脏 IRI 的调控机制势在必行。通过这样做，我们可以开发更有效的治疗策略，并最终改善 AKI 患者的预后。Ferroptosis 是一种非凋亡性细胞死亡，由铁依赖性脂质过氧化反应启动。目前的研究已经阐明了 ferroptosis 在 IRI-AKI 的病理生理机制中的显著作用，并且 ferroptosis 抑制剂已经显著预防或减轻了 IRI-AKI。多种代谢途径参与了 ferroptosis 的调控，其中 system xc−/glutathione peroxidase 4 (GPX4) 通路是经典途径，并被广泛研究。Glutathione (GSH) 是细胞代谢中对抗氧化应激的重要抗氧化剂。通过 system xc- 进口半胱氨酸对于 GSH 的合成和维持 GPX4 的功能是必要的。GPX4 是催化磷脂过氧化物（PLOOHs）还原的关键酶。它还抑制了 system xc-，一种半胱氨酸-谷氨酸反向转运蛋白。当 GPX4 活性受到抑制时，会导致 PLOOHs 的积累，最终引发一种称为 ferroptosis 的程序性细胞死亡。细胞铁代谢是 ferroptosis 的另一重要调控机制，被认为是 ferroptosis 的核心启动因子和介质。在细胞质中，自由的亚铁离子通过 Fenton 反应增加了活性氧（ROS）的产生，从而介导 ferroptosis。Ferritin heavy chain 1 (FTH1) 是一种具有铁氧化酶活性的铁储存蛋白，将亚铁形式（Fe2+）转化为铁形式（Fe3+），使铁以惰性形式储存在 ferritin 壳中。最近的研究进一步强调了 FTH1 在 ferroptosis 中的关键作用，在心肌细胞中缺乏 FTH1 促进了心脏 ferroptosis，并随后导致心肌病。因此，FTH1 的丰度是调节 ferroptosis 的重要因素。Silibinin 是一种多酚类黄酮，也是从乳蓟中提取的最主要的活性成分，已被广泛用作治疗肝病的药物。越来越多的证据表明，Silibinin 具有多种药理特性，包括抗氧化、抗凋亡、抗炎、抗癌等。此外，最近的研究报告显示，Silibinin 通过抑制 ferroptosis 改善了多种疾病。然而，很少有研究关注 Silibinin 在肾脏疾病中的作用。因此，我们探讨了 Silibinin 是否通过限制 ferroptosis 介导的肾损伤来缓解 AKI。在本研究中，我们验证了 ferroptosis 在 IRI-AKI 过程中起到的重要作用，并揭示了 Silibinin 通过靶向 FTH1 来有效保护肾脏免受缺血再灌注诱导的损伤，并减少了 ferroptosis 介导的细胞死亡。我们的数据表明，Silibinin 可以作为一种潜在的治疗药物，用于管理和治疗 AKI。3. 结果
3.1. Silibinin 保护 IRI-AKI 小鼠免受肾功能障碍和病理损伤
为了研究 Silibinin 对肾脏的药理作用，建立了由双侧肾脏缺血再灌注诱导的 AKI 模型（图1B）。如图1C-D所示，IRI-AKI 小鼠表现出显著的肾功能损伤，血清 BUN 和 Scr 水平显著升高。IRI-AKI 还引起了显著的肾脏充血区域和严重的病理变化。H&E 和 PAS 染色显示出显著的肾小管损伤，包括刷状缘减少、肾小管腔扩张、蛋白质铸型形成和坏死（图1E-F，H）。为了验证 ferroptosis 在 IRI-AKI 中的作用，我们评估了 Fer-1（一种 ferroptosis 抑制剂）的效果。显然，Fer-1 处理减轻了 IRI-AKI 小鼠的肾功能损伤和病理损伤。与 Fer-1 观察到的结果相似，Silibinin 处理显著减轻了 IRI-AKI。为了进一步确认 Silibinin 的肾脏保护作用，使用 IHC 检测了 Kim-1 和 NGAL（两种肾小管损伤标志物）的蛋白表达。结果显示 IRI-AKI 诱导的 Kim-1 和 NGAL 表达上升趋势被 Silibinin 处理显著抑制（图1G-I-J）。这些结果与 mRNA 表达一致（图1K-L）。为了进一步检查 Silibinin 在再灌注损伤发生后是否具有保护作用，小鼠在缺血30分钟后给予 Silibinin。结果显示，尽管改善效果不如预处理显著，但 Silibinin 仍然有效地改善了 Scr 和 BUN 水平（图S1A-C）。综上所述，我们的结果证实 ferroptosis 促成了 IRI-AKI；Silibinin 处理有效地保护了 IRI-AKI 小鼠免受肾功能障碍和病理损伤。![]()
图1. Silibinin 保护 IRI-AKI 小鼠免受肾功能障碍和病理损伤。
（A）Silibinin 的化学结构（来自 PubChem Compound Database）。（B）实验设计示意图。（C-D）BUN 和 Scr 水平（n = 8）。（E）代表性的肾脏横截面宏观形态图像。（F, H）肾脏切片的 H&E 和 PAS 染色，以及肾损伤评分（n = 6，比例尺 = 100 μm）。（G, I-J）IHC 切片及 NGAL 和 Kim-1 染色的定量结果（n = 6，比例尺 = 100 μm）。（K-L）NGAL 和 Kim-1 的相对 mRNA 表达（n = 6）。###P < 0.001 对照假手术组；∗P < 0.05，∗∗P < 0.01，∗∗∗P < 0.001 对照模型组。3.2. Silibinin 改善 IRI-AKI 小鼠的肾脏巨噬细胞浸润和炎症
由于肾小管间质炎症是 AKI 的常见病理特征，我们接下来研究了 Silibinin 对 IRI-AKI 小鼠肾脏炎症状态的影响。IRI-AKI 小鼠中肾脏巨噬细胞浸润显著增加，表现为 F4/80 阳性染色增加（图2A-B）。Silibinin 处理显著减轻了巨噬细胞浸润，表现为 F4/80 阳性染色减少（图2A-B）。为了检查炎症过程的变化，进行了与炎症相关的细胞因子 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的 ELISA 测定。与假手术组相比，模型组显示 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 水平显著升高，而经过 Silibinin 处理后，这些水平有所减轻（图2C-E）。一致的是，IRI-AKI 诱导的 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 上调的 mRNA 水平也被 Silibinin 处理显著恢复（图2F-H）。这些结果表明，Silibinin 处理改善了 IRI-AKI 小鼠的肾脏炎症反应。![]()
图2. Silibinin 改善 IRI-AKI 小鼠的肾脏巨噬细胞浸润和炎症。
（A-B）IHC 切片及 F4/80 染色的定量结果（n = 6，比例尺 = 100 μm）。（C-E）肾脏匀浆中 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的 ELISA 结果（n = 8）。（F-H）IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的相对 mRNA 表达（n = 6）。##P < 0.01，###P < 0.001 对照假手术组；∗P < 0.05，∗∗P < 0.01，∗∗∗P < 0.001 对照模型组。3.3. Silibinin 抑制 IRI-AKI 小鼠中的 ferroptosis
我们接下来探讨了 Silibinin 在 IRI-AKI 中的保护作用是否与 ferroptosis 有关。由于大量脂质过氧化的产生是 ferroptosis 的直接原因，我们测定了与氧化还原相关的指标 MDA、GSH 和 SOD。IRI-AKI 明显增加了 MDA 水平，并减少了 GSH 和 SOD 活性，而 Fer-1 或 Silibinin 处理抑制了氧化损伤（图3A-C）。TUNEL 实验结果显示，Fer-1 或 Silibinin 处理抑制了模型组中肾脏细胞死亡的增加（TUNEL检测不应该是凋亡？）（图3D-E）。使用 Western blot 和 qPCR 测量了 GPX4 和 HO-1 这两种关键 ferroptosis 相关蛋白的表达。结果显示，在 IRI-AKI 期间 GPX4 表达减少，而 HO-1 表达增加，Fer-1 或 Silibinin 处理有效地增强了 GPX4 表达并减少了 HO-1 表达（图3F-J）。由于铁代谢失衡被认为是 ferroptosis 的一个关键特征，我们接下来检测了肾脏中的铁含量。与假手术组相比，模型组的肾脏匀浆中亚铁水平增加，而 IRI-AKI 小鼠中增加的亚铁在 Fer-1 或 Silibinin 处理后被消除（图3K）。普鲁士蓝染色结果也显示，Fer-1 或 Silibinin 处理减轻了 IRI-AKI 中铁的积累，表现为肾脏中游离铁沉积的减少（图3L-M）。这些发现表明，Silibinin 对 ferroptosis 的抑制作用可能是其改善 IRI-AKI 的一种机制。![]()
图3. Silibinin 抑制 IRI-AKI 小鼠中的 ferroptosis。
（A-C）肾脏匀浆中的 GSH、MDA 和 SOD 水平（n = 8）。（D-E）肾脏切片的 TUNEL 实验和 TUNEL 阳性细胞比例（n = 5-6，比例尺 = 100 μm）。（F-H）GPX4 和 HO-1 的 Western blot 分析及定量结果（n = 3）。（I-J）GPX4 和 HO-1 的相对 mRNA 表达（n = 6）。（K）肾脏匀浆中的亚铁水平（n = 8）。（L-M）肾脏切片的普鲁士蓝染色及定量结果（n = 3，比例尺 = 100 μm）。#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001 对照假手术组；∗P < 0.05，∗∗P < 0.01，∗∗∗P < 0.001 对照模型组。（关于图例中颜色引用的解释，请参考本文的网络版。）3.4. Silibinin 抑制肾小管细胞中的 ferroptosis
接下来，我们在体外模型中使用 erastin 诱导肾小管上皮细胞 HK-2 和 NRK-52E 的 ferroptosis，以确认 Silibinin 是否具有抗 ferroptosis 的作用。MTT 实验显示，erastin 在 HK-2 和 NRK-52E 细胞中诱导的细胞死亡被 Silibinin 所抑制，这与 Fer-1 观察到的结果相似（图4A-B）。接着我们测定了脂质过氧化的变化。结果显示，随着 MDA 水平的增加，GSH 和 SOD 水平在 HK-2 和 NRK-52E 细胞中显著降低。然而，Fer-1 或 Silibinin 逆转了 erastin 对 MDA、GSH 和 SOD 表达的影响（图4C-H）。通过流式细胞术检测的脂质 ROS 结果也显示，Silibinin 显著减少了 erastin 诱导的脂质 ROS 积累（图4I-L）。同样地，我们确认了 erastin 诱导的亚铁过表达在两种细胞系中均被 Fer-1 或 Silibinin 所减少（图4M-N）。Western blot 和 qPCR 的结果还表明，Silibinin 处理在体外上调了 GPX4 表达并下调了 HO-1 表达（图4O-U）。此外，由于线粒体损伤是 ferroptosis 的显著特征，我们接下来使用 JC-1 荧光探针测量了线粒体膜电位，结果显示 Silibinin 处理减轻了 erastin 处理的 HK-2 和 NRK-52E 细胞中的线粒体损伤（图4V-Y）。另外，作为一种更特异性的 ferroptosis 诱导剂，RSL3 被用来确认 Silibinin 的抑制作用，结果同样显示 Silibinin 显著抑制了 RSL3 刺激的 ferroptosis（图S2）。由于与细胞系相比，原代细胞更能反映体内环境，因此使用了小鼠原代肾小管上皮细胞（PRTC 细胞），结果进一步验证了 Silibinin 的抗 ferroptosis 特性（图S3）。总之，上述结果表明 Silibinin 显著抑制了肾小管细胞中的 ferroptosis。![]()
图4. Silibinin 抑制由 erastin 诱导的肾小管细胞 ferroptosis。
（A-B）HK-2 和 NRK-52E 细胞的 MTT 实验结果。（C-H）HK-2 和 NRK-52E 细胞的 GSH、MDA 和 SOD 水平。（I-J）HK-2 细胞脂质 ROS 的流式细胞术结果。（K-L）NRK-52E 细胞脂质 ROS 的流式细胞术结果。（M-N）HK-2 和 NRK-52E 细胞的亚铁水平。（O-Q）HK-2 和 NRK-52E 细胞的 GPX4 和 HO-1 的 Western blot 分析及定量结果。（R-U）HK-2 和 NRK-52E 细胞的 GPX4 和 HO-1 的相对 mRNA 表达。（V-W）HK-2 细胞的 JC-1 实验及定量结果（比例尺 = 50 μm）。（X-Y）NRK-52 细胞的 JC-1 实验及定量结果（比例尺 = 50 μm）。∗P < 0.05，∗∗P < 0.01，∗∗∗P < 0.001，n = 3。3.5. FTH1 在 Silibinin 介导的 ferroptosis 抑制中起关键作用
为了进一步探讨 Silibinin 在调节 ferroptosis 方面的潜在机制，我们使用 HuProt 人类蛋白质组微阵列鉴定了 Silibinin 的结合蛋白。简而言之，合成了 Biotin-Silibinin，将 Biotin-Silibinin 或 Biotin 与蛋白质组微阵列孵育，然后使用 Cy5-Streptavidn (Cy5-SA) 来识别与 Biotin-Silibinin 结合的蛋白质（图5A）。如 Venn 图所示，鉴定出了 546 个 Silibinin 靶蛋白候选者（图5B）。参考上述实验结果，我们发现 FTH1 是 ferroptosis 通路中的关键蛋白（图5C）。FTH1 显示出与 Silibinin 结合的巨大潜力，其 Z-score 为 3.158，IMean ratio 为 41.482，较高的 Z-score 和 IMean ratio 表示蛋白质具有更好的 Silibinin 结合能力（图5D）。为了进一步研究 FTH1 和 Silibinin 之间的相互作用，进行了分子对接、SPRi、CETSA 和 DARTS 分析。图5E显示了 FTH1-Silibinin 相互作用的预测结合构象。分子对接结果显示，Silibinin 与 FTH1 通过 ASN50（2.67 Å）、TYR54（3.23 Å）和 GLN141（2.91 Å）结合。此外，FTH1-Silibinin 的相对能量为 −16.1694 kcal/mol，LibDock 得分为 −116.426 kcal/mol，表明 Silibinin 和 FTH1 之间的结合亲和力很高。SPRi 结果也证明了 Silibinin 可以与 FTH1 结合，其平衡解离常数（KD）值为 3.58ⅹ10−8 M，表明其具有良好的结合能力（图5F）。进一步使用 CETSA 和 DARTS 方法检测了 Silibinin 与 FTH1 的结合效率。CETSA 结果显示，Silibinin 处理显著提高了 FTH1 的热稳定性（图5G-H）。一致地，DARTS 结果也表明，Silibinin 显著促进了 FTH1 在蛋白酶诱导降解过程中的稳定性（图5I-J）。此外，随着 Silibinin 浓度的增加，FTH1 的稳定性也随之增加（图5I-J）。总的来说，这些发现表明 FTH1 是 Silibinin 的一个靶点，我们认为 FTH1 是 Silibinin 抑制 ferroptosis 的关键决定因素。![]()
图5. FTH1 在 Silibinin 介导的 ferroptosis 抑制中起关键作用，Silibinin 通过破坏 NCOA4-FTH1 相互作用来抑制 ferroptosis。
（A）Silibinin 靶蛋白鉴定的示意图。（B）Silibinin 靶蛋白和 Biotin 靶蛋白的 Venn 图。（C）蛋白质组微阵列中 FTH1 的代表性图像。（D）FTH1-Silibinin 结合的 Z-score 和 IMean 比值。（E）FTH1 和 Silibinin 的分子对接图。（F）Silibinin 与 FTH1 的 SPRi 拟合曲线。（G-H）CETSA-Western blot 分析显示 Silibinin 在不同温度梯度下对 FTH1 的保护作用（n = 3）。（I-J）DARTS-Western blot 分析显示 Silibinin 处理下 FTH1 对蛋白酶消化的抗性（n = 3）。（K-M）NCOA4 和 FTH1 的 Western blot 分析及定量结果（n = 4）。（N）FTH1 和 NCOA4 共染的代表性免疫荧光图像。（O）IRI 小鼠肾脏中 NCOA4 和 FTH1 相互作用的 Co-IP 实验。（P）Co-IP 实验的定量结果，显示 NCOA4 和 FTH1 之间的内源性相互作用（n = 3）。∗P < 0.05，∗∗P < 0.01，∗∗∗P < 0.001。3.6. Silibinin 通过破坏 NCOA4-FTH1 相互作用来抑制 ferroptosis
接下来，我们进一步探讨了 Silibinin 与 FTH1 结合调控 ferroptosis 的潜在机制。由于 FTH1 可以储存铁，并且 Silibinin 处理减少了亚铁的含量，我们推测 Silibinin 与 FTH1 的结合可能会干扰 ferritinophagy 的过程。Ferritinophagy 是一种由 NCOA4 介导的选择性自噬类型，通过降解 ferritin 来促进 ferroptosis。为了验证这一假设，我们首先通过 Western blot 分析检查了 NCOA4 和 FTH1 的表达。结果显示，在 IRI-AKI 小鼠中 FTH1 和 NCOA4 的表达显著下调，表明 ferritinophagy 的发生。然而，Silibinin 处理增强了 FTH1 和 NCOA4 的表达（图5K-M）。考虑到 FTH1 和 FTL 形成复合物以调节铁的储存和释放，我们还检测了 FTL 的表达水平。同样，我们发现 FTL 表达水平的变化与 FTH1 的变化一致（图S4A-B）。然后，我们进行了免疫荧光实验以评估 FTH1 和 NCOA4 的定位。有趣的是，尽管 IRI 减少了 FTH1 和 NCOA4 的表达，但 IRI 加强了 FTH1 和 NCOA4 的共定位荧光，而 Silibinin 则减少了 FTH1 和 NCOA4 的共定位点（图5N）。为了验证 Silibinin 与 FTH1 的结合是否影响 NCOA4 介导的 ferritinophagy，我们通过 co-IP 实验探讨了 Silibinin 是否破坏了 NCOA4-FTH1 的相互作用。如图5O-P所示，Silibinin 显著干扰了 NCOA4-FTH1 的相互作用。这些结果表明，Silibinin 通过破坏 NCOA4-FTH1 相互作用来抑制 ferroptosis。3.7. FTH1 的敲低减弱了 Silibinin 对 ferroptosis 的抑制作用
为了进一步验证 Silibinin 抑制 ferroptosis 的作用是否由 FTH1 介导，我们在 HK-2 细胞中敲低了 FTH1。通过 qPCR 确认了 siRNA 对 FTH1 的敲低效率。正如预期的那样，FTH1 siRNA 显著降低了 FTH1 的 mRNA 表达（图6A-B）。然后，将转染的细胞用 erastin 和 Silibinin 处理。MTT 实验显示，FTH1 的下调减弱了 Silibinin 在 erastin 处理的 HK-2 细胞中的保护作用（图6C）。如图6D-F所示，FTH1 的敲低部分逆转了 Silibinin 处理引起的 GSH 增加和 SOD 及 MDA 水平的降低。同样，FTH1 的敲低逆转了 Silibinin 处理引起的脂质 ROS 水平（图6G-H）和亚铁水平（图6I）的降低。此外，在 Silibinin 处理引起的 HK-2 细胞中，GPX4 的表达降低在 FTH1 被敲低后被消除（图6J-L）。通过 JC-1 实验显示，Silibinin 在 erastin 处理的细胞中减轻的线粒体损伤也被 FTH1 的敲低所抑制（图6M-N）。这些结果表明 FTH1 在 Silibinin 抑制肾脏 ferroptosis 中起着关键作用。此外，当 FTH1 部分被敲低时，Silibinin 对 ferroptosis 的抑制作用也部分减弱。这表明 FTH1 是 Silibinin 在肾脏中抑制 ferroptosis 的重要靶点。![]()
图6. FTH1 的敲低减弱了 Silibinin 对 ferroptosis 的抑制作用。
（A-B）转染 siRNA 后 24 小时和 48 小时 FTH1 的相对 mRNA 表达。（C）转染 FTH1 siRNA 后 HK-2 细胞的 MTT 实验结果。（D-F）HK-2 细胞的 GSH、MDA 和 SOD 水平。（G-H）HK-2 细胞脂质 ROS 的流式细胞术结果。（I）HK-2 细胞的亚铁水平。（J-K）HK-2 细胞 GPX4 的 Western blot 分析及定量结果。（L）GPX4 的相对 mRNA 表达。（M-N）HK-2 细胞的 JC-1 实验及定量结果（比例尺 = 50 μm）。∗P < 0.05，∗∗P < 0.01，∗∗∗P < 0.001，n = 3。4. 讨论
本研究表明，ferroptosis 是 IRI-AKI 的一个显著病理特征，并在其中起着关键作用。我们的数据还显示，Silibinin 对 IRI-AKI 中的肾功能障碍和病理损伤具有保护作用。此外，我们还鉴定了 Silibinin 发挥其保护作用的机制，该机制涉及靶向 FTH1 并破坏 FTH1-NCOA4 介导的 ferritinophagy 过程。这一破坏导致了 ferroptosis 的抑制和 IRI-AKI 的改善。总的来说，这些发现表明 Silibinin 通过靶向 FTH1 并减少 ferroptosis 介导的细胞死亡来减轻肾脏损伤。本研究拓展了 Silibinin 作为治疗 AKI 的潜在药物的可能性。AKI 是一种异质性综合征，伴随着高发病率和高死亡率，并对患者的长期预后产生不利影响。AKI 的诊断依赖于血清肌酐的增加和/或尿量的减少。然而，血清肌酐和尿量在检测早期肾损伤方面都是不完善的标志物。由于缺乏有效的 AKI 治疗方法，及时诊断和预防 AKI 仍然具有挑战性。Silibinin 是一种具有多种生物和药理活性的天然多酚。Silibinin 在改善肝脏疾病和许多其他疾病方面的疗效引起了人们对 Silibinin 对肾脏疾病作用的关注。之前的研究表明，Silibinin 通过抑制 ROS 介导的 MAPK 信号通路和缓解顺铂诱导的 AKI 中的线粒体功能障碍来减轻肾损伤。最近的研究报告指出，将 Silibinin 与 valsartan 或 lisinopril 结合使用可以增强对肾纤维化的抗纤维化作用。这些发现表明 Silibinin 在改善肾脏疾病方面具有很大的潜力。然而，Silibinin 对肾脏疾病的作用需要进一步研究。在我们的研究中，我们探讨了 Silibinin 在 IRI-AKI 模型中的治疗效果，并揭示了其潜在的作用机制。我们的结果显示，与模型组相比，Silibinin 处理降低了 Scr 和 BUN 的水平，并通过 H&E 和 PAS 染色检测显示改善了病理损伤。NGAL 和 Kim-1 的表达在 Silibinin 处理后也显著减少。此外，先前的研究强调了抑制炎症在缓解肾损伤中的重要性。我们发现，Silibinin 处理抑制了炎症浸润，表现为 F4/80 阳性染色的减少以及炎症相关细胞因子 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 水平的降低。这些结果表明 Silibinin 可以改善肾功能障碍，减轻病理损伤，并缓解炎症，这一切都强烈表明 Silibinin 是一种潜在的治疗药物。Ferroptosis 作为一种新的程序性细胞死亡形式，近年来得到了广泛研究，并被认为在缺血再灌注损伤（注：铁死亡的原因， 哪来的铁）的发病机制中起着重要作用。使用 ferroptosis 抑制剂或靶向 ferroptosis 相关基因可以有效改善各种器官的缺血再灌注损伤，这表明靶向 ferroptosis 可能成为缺血再灌注损伤的一个有前途的治疗策略。为了进一步研究 Silibinin 的肾脏保护机制，我们探讨了 ferroptosis 的作用。与先前的研究一致，我们的结果表明，通过 Fer-1 抑制 ferroptosis 减轻了 IRI-AKI 的肾损伤。铁过载和过度的脂质过氧化已被证明是诱发 ferroptosis 的关键因素。缺血再灌注期间产生的大量 ROS 导致脂质过氧化并促进线粒体损伤，最终导致细胞死亡。同时，缺血再灌注损伤通常伴随着铁稳态失衡，过量的游离铁通过 Fenton 反应加速 ROS 的产生和脂质过氧化，从而加剧 ferroptosis。我们还验证了 Silibinin 对铁代谢和脂质过氧化的影响。在本研究中，我们发现 Silibinin 处理不仅减少了亚铁和 MDA 水平，还增强了 GSH 和 SOD 活性。此外，流式细胞术的结果显示 Silibinin 处理抑制了脂质 ROS 的产生，而 JC-1 实验显示 Silibinin 处理减轻了线粒体损伤。总的来说，我们的结果支持 Silibinin 通过抑制 ferroptosis 来减轻肾损伤的观点。为了进一步阐明 Silibinin 调控 ferroptosis 的分子机制，我们使用 HuProt 人类蛋白质组微阵列鉴定了直接与 Silibinin 结合的蛋白质。共鉴定出 546 个候选 Silibinin 靶蛋白，涉及多种调控途径，这进一步表明 Silibinin 具有高度的生物活性和多种药理特性。在候选靶蛋白中，我们重点研究了那些与 ferroptosis 密切相关的蛋白质。我们发现 FTH1 与 Silibinin 结合良好。FTH1 是一种细胞内蛋白质，在维持铁代谢稳态中起着重要作用，通过其铁氧化酶活性和储存铁的能力来实现。外源性 Fe3+ 与 transferrin 结合，并通过 transferrin receptor (TfR1) 进入细胞。然后，Fe3+ 在酸性环境中从 transferrin 中释放，并由 STEAP 家族还原为 Fe2+。在细胞质中释放的 Fe2+ 参与各种代谢过程和氧化应激的调节，而过量积累的 Fe2+ 会触发 Fenton 反应并导致脂质过氧化损伤。Fe2+ 还与 ferritin 结合，ferritin 由轻链（FTL）和重链（FTH1）组成，并以稳定形式储存。因此，有必要探讨 Silibinin 的 ferroptosis 抑制作用是否通过 FTH1 实现。在我们的研究中，我们首先通过分子对接和 SPRi 验证了 Silibinin 与 FTH1 的相互作用，这表明 Silibinin 与 FTH1 之间具有较高的结合亲和力。然后，我们进行了 CETSA 和 DARTS 实验，确认了 Silibinin 与 FTH1 结合的稳定性。更重要的是，我们进一步探讨了 Silibinin 与 FTH1 结合调控 ferroptosis 的潜在机制。越来越多的证据表明，自噬与 ferroptosis 密切相关，并参与调控 ferroptosis 过程中铁依赖性的脂质过氧化和 ROS 积累。Ferritinophagy 是指通过自噬机制去除主要铁储存蛋白 ferritin 的过程。NCOA4 是一种选择性自噬受体，它与 ferritin 结合并介导随后 ferritin 的自噬降解。在本研究中，我们发现 FTH1 和 NCOA4 的表达在 IRI-AKI 小鼠中显著下调，这与之前的研究一致，但 Silibinin 处理逆转了这种下降。我们进一步通过免疫荧光检测 FTH1 和 NCOA4 的共定位，以及通过 co-IP 检测 FTH1 和 NCOA4 的相互作用。我们的结果显示，IRI-AKI 中的 ferritinophagy 明显被激活，而 Silibinin 处理破坏了 NCOA4-FTH1 的相互作用并抑制了 ferritinophagy。此外，我们发现 FTH1 在 HK-2 细胞中的敲低减弱了 Silibinin 的抗 ferroptosis 作用。这些结果强烈表明 FTH1 是 Silibinin 的一个靶点，Silibinin 通过 FTH1 展现出抗 ferroptosis 的作用。
5. 结论
综上所述，我们的结果表明 ferroptosis 在 IRI-AKI 中具有重要作用，并揭示了 Silibinin 通过靶向 FTH1 抑制 ferroptosis 来保护肾脏免受缺血再灌注引起的损伤。我们的研究结果为 Silibinin 在 IRI-AKI 中的潜在治疗价值提供了坚实的科学证据，并为未来开发和研究 Silibinin 作为 IRI-AKI 治疗选择奠定了基础。文章原文：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2213231724003380
