【文献解读】肿瘤缺氧微环境会干扰TGFβ1抗血管生成作用
文摘
科学
2024-10-24 17:01
江苏
![]()
![]()
文献：Luo YW, Fang Y, Zeng HX, Ji YC, Wu MZ, Li H, Chen JY, Zheng LM, Fang JH, Zhuang SM. HIF1α Counteracts TGFβ1-Driven TSP1 Expression in Endothelial Cells to Stimulate Angiogenesis in the Hypoxic Tumor Microenvironment. Cancer Res. 2024 Oct 2. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-24-2324. Epub ahead of print. PMID: 39356626.
杂志：CANCER RESEARCH
新兴证据表明，转化生长因子β1（TGFβ1）可能抑制血管生成，这与肿瘤微环境中活跃的血管生成与TGFβ1的高丰度共存相矛盾。本文研究了肿瘤如何克服TGFβ1的抗血管生成效应。TGFβ1处理抑制了在小鸡绒毛膜和斑马鱼模型中的生理性血管生成，但对小鼠肝癌异种移植模型的血管生成没有影响。在小鼠异种移植中，通过使用缺氧诱导因子1α（HIF1α）抑制剂可以恢复TGFβ1对血管生成的抑制作用。相反，HIF1α稳定剂在斑马鱼中抑制了血管生成，表明缺氧可能减弱TGFβ1的抗血管生成作用。在常氧条件下，TGFβ1通过上调抗血管生成因子血栓素1（TSP1），通过TGFβⅠ型受体（TGFβR1）-SMAD2/3信号通路抑制内皮细胞（ECs）的血管生成。在缺氧微环境中，HIF1α诱导微小RNA-145（miR145）表达；miR145通过结合并抑制SMAD2/3的表达，从而减少ECs中的TSP1水平，消除了TGFβ1对血管生成的抑制作用。与相邻非肿瘤肝脏中的ECs相比，从人类肝细胞癌（HCC）中分离的原代ECs表现出miR145水平升高，SMAD3和TSP1水平降低。ECs中SMAD3或TSP1的减少与HCC组织中血管生成的增加相关。综上所述，本研究确定了ECs中的TGFβ1-TGFβR1-SMAD2/3-TSP1信号通路抑制血管生成。这种抑制作用可以通过缺氧-HIF1α-miR145轴绕过，从而阐明了缺氧促进血管生成的机制。血管生成对于多种生理过程至关重要，包括胚胎发育、伤口愈合以及各种病理状态，尤其是在癌症发展过程中。癌细胞的快速生长导致缺氧微环境的形成，使缺氧诱导因子1α（HIF1α）积累，HIF1α是一种转录因子，可转录激活促血管生成基因的表达，从而导致活跃的血管生成。肿瘤血管生成是肿瘤生长和转移的先决条件，其调控因子是有前景的抗癌靶点。转化生长因子β1（TGFβ1）是一种重要的细胞因子，它结合并刺激受体TGFβR1（也称为ALK5，广泛表达）或ALK1（主要在内皮细胞中表达），随后磷酸化并激活转录因子SMAD2/SMAD3或SMAD1/SMAD5/SMAD8，导致其下游基因的转录。TGFβ1由多种细胞产生，包括免疫细胞、成纤维细胞和上皮细胞，并在发育、纤维化、免疫疾病和肿瘤发展等生理和病理过程中诱导。TGFβ1通过上调p15Ink4B和p21Cip1以及下调c-MYC，发挥抑制细胞增殖的作用。相反，TGFβ1是上皮-间质转化的重要诱导因子，促进肿瘤细胞的侵袭和转移。一些研究报道了TGFβ1对血管生成的抑制作用。例如，体外管道形成实验表明，TGFβ1处理或TGFβR1或ALK1的激活抑制了牛主动脉和人微血管内皮细胞的迁移和管道形成。此外，TGFβ1转基因小鼠表现出视网膜血管生成受损，而SMAD2的下调则促进了伤口愈合过程中的血管生成。然而，TGFβ1的抗血管生成作用的潜在机制仍不清楚。TGFβ1的抗血管生成效果无法解释肿瘤微环境中丰厚的TGFβ1和旺盛的血管生成共存现象。因此，我们旨在阐明这些矛盾现象背后的机制。通过使用临床样本及体内和体外模型，我们揭示了在正常生理条件下，TGFβ1通过刺激TGFβR1-SMAD2/3-血栓素1（TSP1，也称为THBS1）信号通路抑制血管生成。然而，在缺氧的肿瘤微环境中，HIF1α诱导微小RNA-145（miR145）表达，miR145在肿瘤内皮细胞中抑制SMAD2/SMAD3的表达，干扰TGFβ1上调TSP1和抑制血管生成的作用。这些发现揭示了TGFβ1与肿瘤血管生成之间复杂的调控网络，为推进精准医学提供了重要见解。结果
TGFβ1在肿瘤血管生成和生理血管生成中显示出不同的效果
为了研究TGFβ1在肿瘤血管生成中的作用，分别将两种稳定表达TGFβ1的小鼠肝癌细胞系（Hepa-TGFβ1和LC-Rd53-TGFβ1，见补充图1A和B）及其对照细胞系（Hepa-Ctrl和LC-Rd53-Ctrl）皮下注射到小鼠体内。对照异种移植肿瘤和TGFβ1过表达肿瘤之间在血管面积或肿瘤重量方面没有显著差异（图1A–D和补充图1C–F），这表明TGFβ1可能不抑制肿瘤血管生成。![]()
图1 TGFβ1在生理性和肿瘤性血管生成中表现出不同的效应接下来，我们使用鸡绒毛膜（CAM）实验探讨TGFβ1对生理性血管生成的影响。值得注意的是，TGFβ1处理显著减少了CAM血管的分支点（图1E和F），提示TGFβ1具有抗血管生成的功能。我们在Tg(fli1:EGFP)转基因斑马鱼中进一步验证了这一发现，该模型中内皮细胞明确标记为绿色荧光。与对照组相比，稳定表达TGFβ1的斑马鱼中，SIV和ISV（指示斑马鱼血管生成的区域）明显减少（补充图1G和H，图1G和H）。TGFβ1的过表达对斑马鱼的生长没有影响（补充图1H和I）。这些数据表明，TGFβ1可能在体内抑制生理性而非肿瘤血管生成。缺氧通过HIF1α削弱了TGFβ1的抗血管生成作用为了明确导致TGFβ1在肿瘤中失去抗血管生成作用的因素，我们首先分析了原代内皮细胞（ECs）的转录组特征。结果发现，与相邻非肿瘤肝脏中的内皮细胞（NEC）相比，从肿瘤组织中分离的肿瘤内皮细胞（TEC）中TGFβ1信号通路的关键成分显著下调（图2A），这表明TGFβ1信号通路在TEC中可能失活。缺氧是肿瘤微环境的特征，它通过稳定转录因子HIF1α来促进肿瘤血管生成。在TEC中，缺氧-HIF1α信号通路的基因表达显著增加（图2B）。进一步分析显示，TGFβ1信号通路的基因表达水平与缺氧-HIF1α通路呈显著负相关（图2C）。因此，我们通过皮下注射对照或TGFβ1过表达的Hepa1-6细胞到同系小鼠体内，随后对小鼠分别用生理盐水（对照）或HIF1α抑制剂PX-478处理不同时间（图2D），研究了缺氧是否影响TGFβ1的抗血管生成作用。尽管TGFβ1过表达细胞来源的肿瘤异种移植体内TGFβ1水平显著升高（补充图2A和B），但在不同时间点使用生理盐水处理的小鼠中，TGFβ1过表达的异种移植肿瘤与对照组肿瘤在血管面积和肿瘤重量上没有显著差异（图2E和F，补充图2C–E，第1 vs 2，第5 vs 6，第9 vs 10），这表明TGFβ1不影响肿瘤血管生成。值得注意的是，PX-478处理的小鼠中，TGFβ1过表达异种移植肿瘤的血管面积和肿瘤重量均低于其他组，并且随着治疗时间的延长，PX-478恢复TGFβ1抗血管生成作用的效果更加明显（图2E和F，补充图2C–E）。我们通过对Tg(fli1:EGFP)转基因斑马鱼胚胎用DMOG处理（DMOG可在常氧条件下稳定HIF1α，并广泛用于模拟缺氧处理），进一步验证了缺氧的作用。DMOG暴露显著消除了TGFβ1在减少SIV和ISV面积上的作用（图2G和H）。这些体内数据表明，缺氧微环境可能削弱TGFβ1在肿瘤中的抗血管生成功能。![]()
图2 缺氧通过HIF1α减弱了TGFβ1在体内抗血管生成的功能后续的体外毛细血管管道形成实验中，使用HUVEC和HBMEC发现，在常氧培养条件下，TGFβ1处理显著且剂量依赖性地抑制了ECs形成类似毛细血管结构的能力（图3A和B，补充图3A和B），这一现象与TGFβ1在斑马鱼和CAM中的抗血管生成作用相一致。内皮细胞的增殖和迁移是血管生成中的关键事件。TGFβ1处理显著抑制了常氧培养的ECs迁移，但对其增殖没有影响（图3C和D，补充图3C和D，补充图3E）。与上述体内观察一致，在缺氧环境中孵育或用DMOG处理显著上调了HIF1α（补充图4A和B），并消除了TGFβ1在抑制ECs迁移和管道形成中的作用（图3E和F，补充图4C–H）。这些缺氧效应可通过在ECs中沉默HIF1α逆转（图3G和H，补充图4I），这表明缺氧可能通过HIF1α削弱TGFβ1的抗血管生成作用。![]()
图3 缺氧通过HIF1α减弱TGFβ1在体外的抗血管生成功能综上所述，TGFβ1在常氧条件下可能抑制血管生成，但在肿瘤微环境等缺氧条件下，其抗血管生成功能可能会被削弱。TGFβ1通过TGFβR1-SMAD2/3-TSP1信号通路抑制内皮细胞中的血管生成为了阐明TGFβ1介导其抗血管生成作用的分子机制，我们考察了TGFβ1是否调控TSP1、血管抑素和内皮抑素，这三者是最重要的内源性血管生成抑制因子。结果表明，TGFβ1增加了TSP1的蛋白水平，但并未影响血管抑素、内皮抑素或其前体物在内皮细胞中的水平（图4A，补充图5A）。同时，TGFβ1处理也显著增加了内皮细胞中TSP1的mRNA水平（图4B）。沉默TSP1（补充图5B）削弱了TGFβ1抑制内皮细胞迁移的效果（图4C，补充图5C），这表明TSP1是介导TGFβ1在内皮细胞中抗血管生成功能的下游分子。![]()
图4 TGFβ1通过TGFβR1-SMAD2/3-TSP1信号通路在内皮细胞中抑制血管生成接下来，我们研究了TGFβ1如何调控TSP1的表达。首先，我们验证了TGFβ1处理诱导了SMAD2、SMAD3和SMAD1/5在内皮细胞中的磷酸化（补充图6A），并且TGFβR1（caTGFβR1）或ALK1（caALK1）构建的稳定表达细胞分别增加了SMAD2/3或SMAD1/5的磷酸化（补充图6B）。值得注意的是，caTGFβR1（但不是caALK1）的表达上调了TSP1蛋白水平（图4D），并抑制了内皮细胞的迁移和管道形成（图4E和F，补充图6C）。一致的是，TGFβR1抑制剂SB525334（图4G）、沉默TGFβR1（图4H，补充图6D和E）、SMAD2（图4I，补充图6F）或SMAD3（图4J，补充图6F）均消除了TGFβ1上调TSP1的效果。然而，沉默SMAD5并未影响TGFβ1诱导的TSP1上调（图4I）。TSP1被报道能够在肝脏星状细胞和癌细胞中诱导TGFβ1的激活。我们发现，敲低TSP1削弱了TGFβ1信号通路的活性，表现为SMAD3磷酸化的减少（图4K），这提示在内皮细胞中可能存在TGFβ1-TSP1的正反馈环路，从而增强TGFβ1的抗血管生成作用。进一步的表型分析确认，抑制TGFβR1和SMAD2/3，而非SMAD5，削弱了TGFβ1对内皮细胞迁移和管道形成的抑制作用（图4L–N，补充图6G–I）。这些结果表明，TGFβ1可能通过TGFβR1-SMAD2/3信号通路上调TSP1并抑制血管生成，而不是通过ALK1-SMAD5通路实现这一功能。缺氧通过HIF1α阻断内皮细胞中的TGFβ1-SMAD2/3-TSP1信号通路为了评估HIF1α是否以及如何干扰内皮细胞中的TGFβ1-SMAD2/3-TSP1信号，我们首先检查了缺氧对TGFβ1信号的影响。缺氧或DMOG处理减少了p-SBE报告基因的活性（图5A），并降低了内皮细胞中SMAD2、SMAD3和TSP1的mRNA和蛋白水平（图5B-D）。相反，沉默HIF1α则消除了这些缺氧效应（图5E）。一致的是，表达降解耐受突变体HIF1α（DR-HIF1α）模仿了缺氧的作用，降低了SMAD2、SMAD3和TSP1水平（图5F），并削弱了TGFβ1诱导的SMAD2/3磷酸化（图5G）。缺氧处理消除了TGFβ1在内皮细胞中升高TSP1的作用（图5H）。进一步对小鼠肿瘤异种移植体的检查显示，在载体处理的小鼠中，控制组和TGFβ1过表达异种移植体的TSP1水平相似（图5I和J，面板1与2）。相比之下，在PX-478处理的小鼠中，TGFβ1过表达异种移植体的TSP1表达在内皮细胞和肿瘤细胞中均上调（图5I和J）。综合来看，缺氧-HIF1α可能通过降低SMAD2/SMAD3水平来阻断内皮细胞中的TGFβ1信号，从而下调其下游效应分子TSP1。![]()
图5 缺氧通过HIF1α降低内皮细胞中SMAD2、SMAD3和TSP1的水平HIF1α通过上调miR145表达，靶向SMAD2和SMAD3，从而消除了TGFβ1介导的抗血管生成作用为了研究HIF1α如何降低SMAD2/SMAD3表达，我们分析了HIF1α的ChIP-seq数据。我们观察到在正常氧气和缺氧条件下，HIF1α均未结合SMAD2或SMAD3的启动子序列（补充图7A）。一致地，缺氧处理并未影响内皮细胞中SMAD2/SMAD3的mRNA前体水平（补充图7B），这表明HIF1α可能在转录后水平调控SMAD2/SMAD3表达。微小RNA（miRNAs）是主要的调控因子，能够在转录后抑制多个基因的表达。根据Targetscan数据库，只有miR145-5p（miR145）和miR5195-3p被预测为靶向SMAD2和SMAD3（补充图7C）。后续研究显示，miR145在缺氧或DMOG处理的内皮细胞中上调，而miR5195-3p则没有（图6A和补充图7D）。进一步的体内分析显示，在DMOG处理的斑马鱼中，miR145也显著增加（图6B）。含有预期miR145启动子的荧光素酶活性在缺氧或DMOG处理后显著增强（图6C），而沉默HIF1α则消除了缺氧诱导的miR145表达上调（图6D）。ChIP-seq数据验证了在缺氧条件下HIF1α能够结合miR145的启动子区域（补充图7E）。这些数据表明，缺氧可能通过HIF1α刺激miR145转录。![]()
图6 miR145被HIF1α上调，并通过靶向SMAD2和SMAD3在内皮细胞中减弱TSP1表达接下来，我们探讨了miR145是否介导缺氧在抑制SMAD2/3表达中的作用。通过过表达miR145，内皮细胞中的SMAD2、SMAD3和TSP1水平降低（图6E和F），而通过拮抗内源性miR145则增加（图6G和H）。这些发现也在斑马鱼中得到验证（图6I和补充图8）。双荧光素酶报告分析表明，miR145显著抑制含有SMAD2或SMAD3野生型3'-UTR的荧光素酶活性。相比之下，当SMAD2或SMAD3的3'-UTR中的预测miR145结合位点突变时，这一抑制效应减弱（图6J）。这些体内外数据表明，miR145可能通过与SMAD2和SMAD3的3'-UTR结合来抑制它们的表达。我们进一步分析了miR145是否可以模拟缺氧的作用。结果显示，miR145降低了TGFβ1增强SMAD2/3磷酸化（图7A）、p-SBE活性（图7B）和TSP1表达（图7C）的效果，进而消除了TGFβ1的抗血管生成功能（图7D和补充图9A），与缺氧处理的效果一致。相对而言，拮抗miR145消除了缺氧抑制SMAD2/SMAD3/TSP1表达的效果（图7E），而抗-miR145能够在缺氧条件下恢复TGFβ1抑制内皮细胞迁移的能力（图7F和补充图9B）。这种效果在沉默SMAD2/3或TSP1后被逆转（图7G和补充图9C–F）。此外，微注射抗-miR145也恢复了DMOG处理斑马鱼中TGFβ1的抗血管生成作用（图7H和I）。我们还探讨了缺氧诱导的miR145是否调控HIF1α激活的其他血管生成通路，分析的结果显示，miR145未能降低VEGFR1、PAI-1和血管生成素-2这三种蛋白的表达（补充图9G）。综合这些体内外模型的数据，表明miR145可能通过直接抑制SMAD2/3表达及降低内皮细胞中的TSP1水平，介导缺氧对阻断TGFβ1抗血管生成功能的影响。![]()
图7 miR145阻断了TGFβ1的抗血管生成效应肿瘤组织中的TEC（肿瘤内皮细胞）中SMAD3-TSP1通路受到抑制，且与肿瘤血管生成呈负相关为了在临床样本中验证SMAD3-TSP1通路，我们从肿瘤组织中分离出原代TEC（肿瘤内皮细胞），并从匹配的相邻非肿瘤肝组织中分离出NEC（非肿瘤内皮细胞），结果显示，与NEC相比，TEC中miR145的表达水平显著升高，而SMAD3和TSP1的表达水平显著降低（图8A和B）。在线数据库的TEC和NEC转录组谱中也一致观察到SMAD3和TSP1的下调（补充图10，GSE51401）。由于TEC/NEC的分离是在常氧条件下进行的，我们检查了所提出的信号通路是否在整个分离过程中（通常约3小时）保持不变。体外研究表明，内皮细胞先暴露于缺氧环境，随后再暴露于不同时间段的常氧环境，结果显示，尽管在将细胞培养从缺氧条件转换为常氧条件后0.5小时，HIF1α已经检测不到（补充图11A），但miR145的增加（补充图11B）以及SMAD2、SMAD3和TSP1的减少在复氧后6小时仍持续存在（补充图11A），这表明miR145-SMAD2/3-TSP1信号可能在分离的原代内皮细胞中得以保留。![]()
图8 人类肿瘤组织中TEC的miR-145-SMAD3-TSP1信号通路对肝细胞癌（HCC）组织的进一步染色显示，肿瘤中HIF1α的表达较高（图8C和D），与NEC（非肿瘤内皮细胞）相比，TEC（肿瘤内皮细胞）中SMAD3和TSP1蛋白的表达水平较低（图8E–H）。此外，在TEC中，SMAD3和TSP1的表达呈显著正相关（图8I）。在HCC组织中，SMAD3+或TSP1+血管的比例与血管面积呈负相关（图8J和K）。这些数据进一步表明，人肿瘤的内皮细胞中SMAD3-TSP1通路被抑制。综上所述，在常氧条件下，TGFβ1可能通过TGFβR1-SMAD2/3-TSP1信号通路抑制生理性血管生成。然而，在缺氧的肿瘤微环境中，HIF1α可反式激活miR145，随后下调TSP1并通过抑制内皮细胞中SMAD2和SMAD3的表达来减弱TGFβ1的抗血管生成作用。本研究揭示，TGFβR1-SMAD2/3-TSP1信号通路介导了TGFβ1在生理性血管生成中的抑制作用，而这一作用被缺氧-HIF1α-miR145轴所阻断，该轴抑制了SMAD2/3的表达。这些发现增进了对TGFβ1功能以及血管生成调控网络的理解。越来越多的证据表明TGFβ1对血管生成具有抑制作用，但我们在肿瘤环境中发现了TGFβ1抗血管生成作用的减弱。体内模型显示，TGFβ1抑制了鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）和斑马鱼中的生理性血管生成，但无法抑制肿瘤血管生成。体内和体外研究表明，缺氧是决定TGFβ1功能转变的关键因素，也是肿瘤克服抗血管生成控制的关键因素，这对于肿瘤血管生成可能至关重要。这些发现可能解释了为什么在富含TGFβ1的肿瘤微环境中，肿瘤血管生成仍然高度活跃。关于TGFβ1信号在内皮细胞（ECs）中的直接作用及其潜在机制的研究有限，且抗血管生成因子是否介导TGFβ1在血管生成中的功能尚未见报道。我们发现，TGFβ1通过直接抑制内皮细胞的迁移/管形成来抑制血管生成，而TSP1作为一种重要的抗血管生成因子，是TGFβ1-TGFβR1-SMAD2/3通路的下游靶标，介导了TGFβ1的抗血管生成作用。值得注意的是，我们还观察到TSP1的敲低减弱了TGFβ1诱导的内皮细胞中SMAD3的磷酸化，这表明存在一个正反馈循环，可能会增强TGFβ1信号并加强其对血管生成的抑制作用。我们提出，内皮细胞自分泌的TSP-1表达对于观察到的效应至关重要，因为内皮细胞分泌的TSP1可以以自分泌的方式结合CD36，抑制VEGF信号和基质金属蛋白酶（MMP）的激活，从而抑制内皮细胞的增殖和迁移，并诱导内皮细胞凋亡。TSP1还可以结合CD47，抑制环磷酸鸟苷（cGMP）信号和一氧化氮的释放，从而抑制血管生成。已有研究表明，分泌因子的浓度随距离增加而降低，这表明自分泌因子可能比旁分泌因子产生更大的影响。因此，内皮细胞分泌的TSP1对血管生成的影响可能比其他细胞分泌的TSP1更为显著，而缺氧诱导的内皮细胞中TSP1的下调可能优先影响内皮细胞自身的表型。HIF1α作为一种主要的转录因子，能够诱导包括血管内皮生长因子（VEGF）在内的缺氧反应基因的表达，而VEGF是一种对肿瘤血管生成至关重要的促血管生成因子。在这里，我们揭示了除了促进血管生成外，HIF1α还通过诱导miR145的表达来阻断TGFβ1-TGFβR1-SMAD2/3-TSP1信号的抗血管生成功能。尽管在再氧合后0.5小时HIF1α就已无法检测到，但在内皮细胞中，miR-145的增加以及SMAD2、SMAD3和TSP1的减少至少持续了6小时。已知miRNA具有高稳定性，这加上肿瘤微环境中持续的缺氧环境，可能导致SMAD2/SMAD3/TSP1表达的持续抑制。这些发现揭示了HIF1α通过不同机制促进肿瘤血管生成的双重功能，即诱导促血管生成因子的表达和阻断TGFβ1-TSP1的功能。据报道，TGFβ1通过增加p15和p21的表达来抑制细胞增殖，从而阻碍细胞周期的进展；然而，它也通过减少E-钙粘蛋白并增加N-钙粘蛋白/波形蛋白的水平来促进肿瘤细胞的迁移/侵袭。相比之下，我们发现TGFβ1处理通过上调TSP1来抑制内皮细胞的迁移。然而，TGFβ1既没有改变内皮连接复合物（补充图12A）的表达，包括粘附连接和紧密连接蛋白，也没有影响血管的通透性和通畅性，这由血液循环中染料外渗到异种移植瘤中的量在对照组和TGFβ1组之间无差异所证实（补充图12B）。这些发现强调了TGFβ1调控网络的环境依赖性。值得注意的是，miR145在肿瘤细胞和内皮细胞中也表现出相反的作用。我们证明，缺氧诱导的miR145表达取消了TGFβ1在肿瘤内皮细胞（TEC）中的抗血管生成作用。我们之前的研究发现，血清中高水平的miR145与肝细胞癌（HCC）组织中高微血管密度之间存在显著相关性，这支持了miR145在促进肿瘤血管生成中的潜在作用。相比之下，在肿瘤细胞中观察到miR145启动子区域的高甲基化和miR145的下调，并且miR145通过靶向SOX2、MYO6和OCT4来抑制癌细胞的增殖、迁移和侵袭，这表明miR145在肿瘤微环境中具有复杂的调控作用。这些发现表明，TGFβ1和miR145是具有多方面功能的分子，它们的作用方式依赖于细胞类型和微环境，这为合理设计抗癌策略提供了见解。试剂
实验使用了TGFβ1、HIF1α稳定剂（二甲氧乙二酰甘氨酸，DMOG）、TGFβR1抑制剂（SB525334）和HIF1α抑制剂（PX-478 2HCl）。除非另有说明，否则使用10 ng/mL的TGFβ1、100 μM的DMOG或2 μM的SB525334。所使用的RNA寡核糖核苷酸包括miR145模拟物、抗miR145、针对HIF1A（siHIF1α）、TGFBR1（siTGFβR1）、SMAD2（siSMAD2）、SMAD3（siSMAD3）、SMAD5（siSMAD5）和TSP1（siTSP1）的小干扰RNA（siRNA），以及针对miR145和siRNA的阴性对照（NC）或针对抗miR145的阴性对照（anti-NC）。用于表达目标基因的载体包括Tol2转座子载体Tg-TGFβ1，该载体在Tg(–3.5ubi:mCherry)中包含了斑马鱼的tgfb1a；慢病毒表达载体pCDH-TGFβ1、pCDH-caTGFβR1和pCDH-caALK1，它们分别在pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP中携带了小鼠Tgfb1、人类T204D突变的TGFBR1和人类Q201D突变的ACVRL1（编码ALK1的基因），并分别表达小鼠TGFβ1、人类持续活化的TGFβR1或ALK1；慢病毒表达载体plenti-PGK-DR-HIF1α-PGK-puro，该载体在plenti-PGK-MCS-PGK-puro中携带了P402A/P577G/N813A突变的HIF1A，并表达了一种抗降解突变体HIF1α（命名为DR-HIF1α）。用于验证miR145靶向的3'非翻译区（3'-UTR）的载体包括psi-SMAD2-WT、psi-SMAD2-MUT、psi-SMAD3-WT和psi-SMAD3-MUT，它们在psiCHECK2中的SMAD2或SMAD3的3'-UTR中携带了野生型（WT）或突变型（MUT）的miR145结合序列。携带了pGL3-basic中miR145启动子序列的pGL3-miR145-pro载体被用于启动子活性测定。p-SBE报告基因是一种携带12个串联的SMAD2/SMAD3结合元件（SBE）的荧光素酶报告基因，用于指示TGFβ1信号。所有载体均通过直接测序进行验证。siRNA和DNA寡核糖核苷酸引物的序列列于补充表1中。肝细胞癌（HCC）及与之匹配的相邻非肿瘤肝组织样本均采集自中山大学附属肿瘤医院接受肝细胞癌切除术的患者。肿瘤组织和非肿瘤组织均经组织学确认。每位患者均已签署书面知情同意书，且本研究方案已获得机构研究伦理委员会批准。患者的信息均按照《赫尔辛基宣言》的伦理指导原则进行匿名编码。原代内皮细胞（ECs）是从肝细胞癌（HCC）组织及与之匹配的相邻非肿瘤肝组织中分离得到的，分别定义为肿瘤内皮细胞（TEC）和正常内皮细胞（NEC），具体分离方法如文献（19）所述；人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的分离方法如文献（20）所述；从NrasG12V/sgp53诱导的小鼠肝癌中分离得到的原代小鼠肝癌细胞被命名为LC-Rd53。所用细胞系包括小鼠肝癌细胞系Hepa1-6（CRL-1830；RRID:CVCL_0327；ATCC，弗吉尼亚州，美国）、LC-Rd53、转化的人胚肾细胞系HEK293T（CRL-3216；RRID:CVCL_0063；ATCC）和人脑微血管内皮细胞系HBMEC（HTX2403，奥拓生物科技有限公司，中国深圳），这些细胞系均培养在添加有10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中。人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养在无血清的内皮细胞培养基（SFM；11111044；Gibco，赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆）中，并补充了20%胎牛血清（FBS；30044333；Gibco）和0.03 mg/mL内皮细胞生长补充剂（ECGS；02-102；默克密理博，马萨诸塞州比勒里卡）。稳定细胞系是通过用表达目标基因的慢病毒感染Hepa1-6、LC-Rd53、HUVEC或HBMEC细胞而建立的。成功构建了稳定表达TGFβ1的Hepa1-6和LC-Rd53亚系（Hepa-TGFβ1、LC-Rd53-TGFβ1）及其对照系（Hepa-Ctrl、LC-Rd53-Ctrl），稳定表达持续活化型TGFβR1或ALK1的HUVEC和HBMEC细胞及其对照系（HUVEC-pCDH-Ctrl、HBMEC-pCDH-Ctrl），以及稳定表达抗降解突变体HIF1α（DR-HIF1α）的HUVEC细胞及其对照系（HUVEC-plenti-Ctrl）。所有细胞均在37°C、含5% CO2的湿润环境中培养。根据实验要求，细胞在常氧（≈21% O2）或低氧（1% O2）条件下培养。所有细胞系在复苏后10代以内使用，并定期进行支原体检测，同时在中国广州的Cyagen Biosciences公司通过短串联重复序列指纹分析进行鉴定。将Hepa-Ctrl和Hepa-TGFβ1细胞，或LC-Rd53-Ctrl和LC-Rd53-TGFβ1细胞，分别皮下注射到同一只小鼠背部的对侧。实验所用小鼠为6周龄雄性C57BL/6小鼠。为了探讨缺氧/HIF1α对TGFβ1在体内血管生成调控作用的影响，在肿瘤细胞接种后1周，对荷瘤小鼠进行灌胃处理，给予生理盐水（载体对照）或HIF1α抑制剂（PX-478 2HCl），持续1、2或3周。为了进行体内血管通透性分析，将伊文思蓝（0.5%生理盐水溶液）注射到荷瘤小鼠的尾静脉中。用分光光度法对小鼠异种移植物外渗的伊文思蓝进行提取和定量。所有动物实验均获得中山大学动物护理委员会的批准，并按照《实验动物护理和使用指南》（美国国立卫生研究院第80-23号出版物，1996年修订版）以及机构伦理指南进行。在含有5日龄鸡胚的鸡蛋壳上开一个小窗，暴露出尿囊膜。将一个聚四氟乙烯（Teflon）环放置在尿囊膜上，并向环的中心加入磷酸盐缓冲液（PBS；载体）或TGFβ1（10 ng/mL），然后在37°C下孵育72小时。固定后，在体式显微镜下对尿囊膜进行拍照。实验所用斑马鱼为野生型AB品系和转基因Tg(fli1: EGFP)斑马鱼品系（美国俄勒冈州尤金市ZFIN）。为了评估斑马鱼的血管生成情况，在受精后0.75小时内（hpf），将处于一细胞期的Tg(fli1: EGFP)斑马鱼胚胎显微注射Tol2转座子mRNA和Tg-TGFβ1或仅对照载体，或同时注射抗miR145或抗NC，然后维持48小时，并按照指示进行另48小时的处理，之后在共聚焦显微镜下成像。评估了斑马鱼的肠下血管（SIV）面积、体节间血管（ISV）和体长。为了检测斑马鱼基因表达情况，将处于一细胞期的野生型斑马鱼胚胎显微注射miR145或NC双链，或注射抗miR145或抗NC；96小时后收集斑马鱼RNA，并进行实时定量聚合酶链式反应（qPCR）分析。使用Lipofectamine RNAiMAX转染RNA双链（25 nM）或miRNA抑制剂（100 nM）；使用Lipofectamine 3000转染质粒DNA。将慢病毒表达载体和包装载体共转染到HEK293T细胞中，以生产慢病毒。
通过qPCR、免疫印迹、免疫组织化学或免疫荧光染色分析基因表达。DNA寡核糖核苷酸引物的序列列于补充表1中，详细的抗体信息见补充材料和方法部分。使用双荧光素酶报告基因检测系统检测p-SBE、miR145靶向的3'-UTR或miR145启动子的报告活性。
细胞增殖检测
将人脐静脉内皮细胞（HUVEC）或人脑微血管内皮细胞（HBMEC）（2×104）接种于12孔板中培养24小时，然后在有无TGFβ1的条件下孵育72小时，之后使用Countstar细胞分析仪进行细胞计数。内皮细胞迁移检测是在一个24孔的Boyden小室（Transwell）中进行的，该小室装有一个8微米孔径的聚碳酸酯膜。
毛细血管管样结构形成检测是在一个涂有生长因子减少型基底膜胶（matrigel）的96孔板中进行的，该检测可以指示内皮细胞在体外的血管生成能力。转录组谱和ChIP-seq数据来源于基因表达汇编（GEO）数据集。TGFβ1通路基因数据集来源于京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库。使用GSEA v4.3.3进行基因集富集分析（GSEA）。使用R v4.1.0程序生成热图。miRNA靶标由Targetscan Human 7.2预测。数据以至少三次独立实验的平均值±标准误（SEM）表示。两组之间的差异采用Student’s t检验进行分析。三个或更多组之间因变量的均值比较采用单因素方差分析（ANOVA）来评估一个自变量的影响，采用双因素方差分析（ANOVA）来评估两个自变量的影响。所有统计检验均为双侧检验，P<0.05认为具有统计学意义。统计分析使用GraphPad Prism 8.0.1软件进行（主要研究资源标识符[RRID]：SCR_002798；GraphPad Software Inc.，美国加利福尼亚州圣地亚哥）。原文地址：https://aacrjournals.org/cancerres/article-abstract/doi/10.1158/0008-5472.CAN-24-2324/748779/HIF1-Counteracts-TGF-1-Driven-TSP1-Expression-in?redirectedFrom=fulltext注：因文章篇幅有限，所有相关引用文献，以及补充素材可以点击至原文查阅。
苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过六年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。
![]()
![]()
