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题目
靶向阻断肿瘤细胞与巨噬细胞之间的通讯，通过抑制Vtn-C1qbp相互作用，增强巨噬细胞的吞噬作用，从而抑制肿瘤进展
摘要
背景：癌细胞能够通过过度表达被称为“不要吃我”信号的抗吞噬性表面蛋白，逃避免疫系统中巨噬细胞的清除。通过靶向吞噬检查点，拮抗巨噬细胞和肿瘤细胞中的“不要吃我”信号的单克隆抗体已在多种癌症类型中显示出治疗前景。然而，研究表明，对这些药物的响应揭示了其他未知的“不要吃我”信号的存在。此外，识别调控巨噬细胞吞噬作用的关键分子和相互作用对于肿瘤治疗是必需的。方法：利用CRISPR筛选来识别阻碍巨噬细胞吞噬的基因。为探索Vtn和C1qbp在吞噬作用中的功能，进行了基因敲降和后续功能实验。通过流式细胞术探讨了巨噬细胞的吞噬率、极化和小鼠肿瘤的免疫微环境。为了探讨潜在的分子机制，进行了RNA测序、免疫共沉淀、质谱分析和免疫荧光实验。随后，通过小鼠模型的体内实验，探讨了Vtn基因敲降与抗-CD47疗法相结合在乳腺癌中的可能性。分析了来自癌症基因组图谱数据库（The Cancer Genome Atlas, TCGA）的基因表达综合数据中的单细胞测序数据。结果：我们进行了全基因组CRISPR筛选，以识别阻碍巨噬细胞吞噬的基因，随后分析了细胞间相互作用数据库。我们发现了一个配体-受体对——Vitronectin（Vtn）和补体C1Q结合蛋白（C1qbp），分别在肿瘤细胞或巨噬细胞中表达。我们证明了肿瘤细胞分泌的Vtn与肿瘤相关巨噬细胞表面定位的C1qbp相互作用，抑制了肿瘤细胞的吞噬，并使巨噬细胞在肿瘤微环境中向M2样亚型转变。从机制上看，Vtn-C1qbp轴促进了FcγRIIIA/CD16诱导的Shp1招募，从而降低了Syk的磷酸化水平。此外，Vtn基因敲降与抗-CD47抗体的联合使用有效增强了巨噬细胞的吞噬作用和浸润，导致体内肿瘤生长的减少。结论：本研究揭示了Vtn-C1qbp轴是肿瘤中的一种新的抗吞噬信号，靶向Vtn及其与C1qbp的相互作用可能使癌症对免疫治疗更加敏感，为三阴性乳腺癌的治疗提供了新的分子靶点。关键词：乳腺癌，CRISPR筛选，Vtn-C1qbp，巨噬细胞，吞噬
1. 介绍
巨噬细胞的吞噬作用在肿瘤控制中发挥着重要作用。吞噬作用是一个涉及靶细胞识别、包裹和溶酶体降解的多步骤过程，受靶细胞与吞噬细胞之间的配体-受体相互作用调控，也称为吞噬检查点。自从发现CD47-SIRPα轴作为第一个吞噬检查点以来，已经发现了其他参与肿瘤细胞逃避免疫系统吞噬清除的吞噬检查点，包括PD-1-PD-L1轴、MHC-I-LILRB1轴和CD24-Siglec-10轴。肿瘤细胞可以通过上调这些“不要吃我”的信号逃避巨噬细胞的清除。通过拮抗CD47与其受体SIRPα的相互作用的单克隆抗体能够在体内外消除肿瘤细胞，并在多种癌症中显示了治疗潜力。然而，由于CD47广泛表达，使用抗CD47抗体作为抗癌疗法可能会带来一些脱靶效应，如贫血。此外，一部分癌症患者对CD47靶向疗法没有反应。同时，研究这些药物的效应和持久性揭示了其他未知的“不要吃我”信号的存在。因此，发现这些潜在的吞噬检查点至关重要。CRISPR筛选已被用于识别巨噬细胞吞噬不同底物（包括纯化的髓鞘、酵母细胞壁颗粒和绵羊红细胞）所需的关键基因。此外，还有研究探索了抗体介导的肿瘤细胞抗吞噬的内在关键基因。然而，巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用主要由巨噬细胞与肿瘤细胞之间的配体-受体对调控，且这些配体-受体对很少被报道。在本研究中，为了找到分别存在于肿瘤细胞和巨噬细胞中的调控吞噬作用的配体-受体对，我们通过一种基于FASC的体外吞噬实验，以直接吞噬能力作为读取指标进行了CRISPR筛选。通过流式细胞术筛选出吞噬了肿瘤细胞的巨噬细胞，并在细胞-细胞相互作用数据库中映射阻碍巨噬细胞吞噬的基因，我们确定了Vtn-C1qbp配体-受体对。Vitronectin（Vtn）是一种存在于血液和细胞外基质中的多功能糖蛋白，能够结合多种配体，并在蛋白水解、免疫反应以及细胞附着、扩展和迁移中发挥作用。C1qbp最初被分离为C1q分子球状头部的受体。有报道表明，Vtn能够结合成熟形式的C1qbp，而几乎不能结合缺乏N端22个氨基酸的C1qbp。有研究表明，巨噬细胞上的Vtn受体整合素在中性粒细胞凋亡的吞噬中发挥重要作用，并抑制巨噬细胞对凋亡细胞的识别。随后的研究还表明，Vtn可以独立影响巨噬细胞和凋亡细胞，从而减少凋亡细胞的清除。然而，Vtn-C1qbp配体-受体对在吞噬作用中的机制及其潜在的重要性尚不清楚。在后续实验中，我们探讨了Vtn-C1qbp在调控巨噬细胞吞噬及肿瘤生长中的作用及其潜在机制。总之，我们的研究揭示了巨噬细胞与肿瘤细胞之间新的调控配体-受体对及其在肿瘤生长和肿瘤微环境重塑中的作用，为癌症免疫疗法提供了新的治疗靶点。2. 结果
2.1 全基因组CRISPR筛选在巨噬细胞和肿瘤细胞中识别出调节吞噬作用的基因
为了系统性地寻找调节巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的配体-受体相互作用，我们分别使用小鼠全基因组慢病毒CRISPR sgRNA文库（lentiCRISPRv2-Brie）对巨噬细胞和肿瘤细胞进行转导，进行功能丧失筛选。我们选择了小鼠巨噬细胞系Raw264.7，它具有与正常巨噬细胞相似的特性，具备吞噬活性和抗肿瘤活性。此外，临床试验中针对实体瘤，特别是三阴性乳腺癌（TNBC）的CD47靶向治疗效果发现并不理想，提示TNBC细胞可能通过CD47非依赖机制逃避巨噬细胞的吞噬清除。因此，我们选择了4T1细胞作为筛选的肿瘤细胞模型。为了可视化巨噬细胞的吞噬作用，我们用GFP（绿色荧光蛋白）转导4T1细胞，这样巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬可以通过荧光激活细胞分选仪（FACS）检测到（图1A）。我们由此建立了一种基于FACS的吞噬实验，用于快速筛选出具备吞噬肿瘤细胞能力的Raw264.7细胞，以识别调控巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的基因。利用该实验，我们进行了全基因组范围的吞噬调控基因筛选（图1B）。我们以0.5的感染复数（MOI）用逆转录病毒sgRNA文库转导Raw264.7细胞，确保每个细胞仅转导一个sgRNA。sgRNA转染的Raw264.7细胞与4T1细胞共培养进行体外吞噬实验。共培养两小时后，吞噬肿瘤细胞的CD45+GFP+吞噬细胞被分选并收集。通过PCR扩增回收分选细胞基因组DNA中的sgRNA序列，并通过高通量测序进行鉴定。通过MAGeCK（基于模型的全基因组CRISPR-Cas9敲除分析）算法计算吞噬细胞与所有巨噬细胞中的sgRNA的相对富集度。同样地，4T1细胞也经过相同的筛选过程，以识别调控癌细胞中巨噬细胞吞噬的基因。在吞噬细胞群体中富集的sgRNA（RRA分数越接近0表示富集度越高）是那些在破坏时导致巨噬细胞对肿瘤细胞吞噬增加的基因，因此代表通常抑制吞噬作用的基因。通过使用log2（fold change）>0.5和RRA分数<0.25的标准，我们在巨噬细胞中识别出660个潜在的吞噬抑制基因，在肿瘤细胞中识别出1138个潜在的介导吞噬抗性的基因（图1C-D）。正如预期，我们在肿瘤细胞中识别出了已知的乳腺癌抗吞噬基因B2M（Beta-2-Microglobulin）以及广为人知的抗体治疗靶点MS4A1（CD20）。对肿瘤细胞中识别出的吞噬抗性基因的KEGG通路富集分析显示，这些基因主要富集于代谢途径、细胞连接以及Wnt、mTOR、AMPK和PI3K-AKT等主要肿瘤信号通路（图S1A）。同时，在巨噬细胞中识别出的吞噬抑制基因则表现出与吞噬作用相关的通路强烈富集，如代谢、细胞骨架调控、内吞和溶酶体通路（图S1B）。![]()
图1全基因组CRISPR筛选吞噬作用调节基因。
(A) Raw264.7巨噬细胞与GFP标记的4T1细胞孵育2小时后的代表性吞噬图像。白色箭头指示吞噬。比例尺为20 µm。(B) 示意图展示了识别4T1细胞和Raw264.7细胞中抑制性吞噬相关基因的全基因组筛选主要步骤。(C和D) 4T1 (C) 和Raw264.7 (D) 筛选结果与未经处理的对照组的散点图，显示出正调节因子和负调节因子。满足筛选标准的基因（MAGeCK RRA评分<0.25且Log2 FC>0.5）以蓝点表示正调节因子，满足筛选标准的基因（MAGeCK RRA评分>0.75且Log2 FC<-0.5）以绿点表示负调节因子。2.2 鉴定Vtn-C1qbp配体-受体对作为肿瘤细胞巨噬细胞吞噬作用的调节因子
为了寻找存在于巨噬细胞和肿瘤细胞中的抑制性配体-受体对，我们选择了在CRISPR筛选中被鉴定为吞噬抑制因子的基因。在从Raw264.7细胞中鉴定的660个靶点中，有169个编码细胞表面蛋白，成为候选受体。我们推测，介导巨噬细胞清除逃逸的抗吞噬配体可能在肿瘤细胞中过度表达。因此，在从4T1细胞中鉴定的1138个靶点中，我们聚焦于589个基因，它们在TCGA数据库中的乳腺癌患者的癌症组织中相对于正常组织表达增加（图2A和图S2A），作为配体的候选基因（注: 肿瘤细胞中筛选配体， 巨噬细胞中筛选受体）。接着，我们将这些来自Raw264.7和4T1细胞的候选基因映射到多伦多大学BADER实验室的细胞-细胞相互作用数据库中，该数据库包含1851个受体、1593个配体和433个细胞外基质成分，代表38446种细胞-细胞相互作用，鉴定出了我们候选基因中的8个细胞间相互作用（图2B）。为了进一步缩小候选相互作用的范围，我们在4T1与Raw264.7共培养2小时后，通过流式细胞仪将非吞噬的4T1细胞、吞噬的Raw264.7细胞以及非吞噬的Raw264.7细胞分选出来（图2C）。通过检测Vtn、Hapln1、Vcan、Cxcl10、Wnt7b和Krt1的表达水平，我们发现，与未与Raw264.7共培养的4T1细胞相比，非吞噬的4T1细胞中Vtn和Hapln1的表达显著升高，而Vcan、Cxcl10、Wnt7b和Krt1的水平没有显著变化（图2D）。此外，我们对4T1肿瘤负荷小鼠中的肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、脾巨噬细胞（SpM）和腹腔巨噬细胞（PM）进行了RNA测序，发现Fzd2（Frizzled Class Receptor 2）和Kdr（Kinase Insert Domain Receptor）在巨噬细胞中几乎没有表达，而C1qbp在肿瘤相关巨噬细胞中高度表达，而Vcan在TAMs中并没有高度表达（图2E）。随后，我们在体外将骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）诱导为M1样（使用LPS）和TAM（使用4T1细胞上清），并检测了这些基因的表达。基于基因的CT值，我们观察到BMDMs中Fzd2和Kdr的弱表达，而C1qbp和Vcan的表达较高。同时，C1qbp和Vcan在TAMs中高度表达，而在M1样的BMDMs中则没有高表达（图2F和图S2B）。因此，C1qbp和Vcan被选为巨噬细胞上的候选受体基因。由于我们的研究揭示了两个候选的配体-受体对，Vtn-C1qbp和Hapln1-Vcan，我们进一步分析了Vtn和Hapln1的表达水平与基底样乳腺癌预后的相关性。根据基因表达对患者进行分层分析表明，Vtn表达较低或Hapln1表达较高的乳腺癌患者具有整体生存优势（图2G和图S2C）。通过分析TCGA大体组织RNA数据，我们发现VTN和C1QBP的双重增强与基底样乳腺癌患者相比，预后更差（图2H）。我们还发现C1QBPhigh巨噬细胞的浸润与TNBC患者的预后不良显著相关。进一步分析显示，在C1QBPhigh巨噬细胞浸润的患者中，与高表达VTN的组合相比，预后更差（图2I）。这些结果强化了TNBC患者中表达VTN和C1QBP的巨噬细胞的协同负面作用（图S3A-B）。因此，基于这些结果，我们选择了Vtn-C1qbp配体-受体对进行进一步研究。![]()
Figure 2 Vtn-C1qbp 配体-受体对作为吞噬作用的潜在调节因子。
(A) 筛选候选细胞间相互作用的标准图示。首先，从4T1细胞的阳性sgRNA筛选结果中选择与正常组织相比在TCGA-BRCA肿瘤组织中上调的肿瘤来源候选基因，并从Raw264.7细胞的阳性sgRNA筛选结果中选择可以定位在膜上的巨噬细胞来源候选基因。接下来，将这两部分基因映射到细胞间相互作用数据库中，筛选出Raw264.7和4T1之间的候选相互作用。(B) 根据筛选标准过滤后选择的候选相互作用。(C) 基于FACS的吞噬作用示意图。GFP+CD45-未被吞噬的4T1细胞：未吞噬的4T1；GFP+CD45+：吞噬的Raw264.7；GFP-CD45+：未吞噬的Raw264.7。(D) 对在未吞噬的4T1、吞噬的Raw264.7、未吞噬的Raw264.7和对照4T1细胞中候选4T1基因（如图B所示）进行qRT-PCR分析。(E) 通过热图（基于FPKM值）展示4T1肿瘤负荷小鼠的SpM、PM和TAM中的Raw264.7候选基因（如图B所示）。颜色强度表示基因表达水平。SpM: 脾巨噬细胞；PM: 腹腔巨噬细胞；TAM: 肿瘤相关巨噬细胞。(F) 在BMDM-M0（未刺激）、BMDM-M1（LPS刺激）和BMDM-TAM（4T1细胞条件培养基刺激）中对Raw264.7候选基因（如图C所示）进行qRT-PCR分析。BMDM：骨髓来源的巨噬细胞。(G) TCGA基底型乳腺癌患者（n = 140）中VTN高表达或低表达的整体生存分析，定义为中位数。双侧P值由log-rank（Mantel-Cox）检验计算。(H) 将VTN和C1QBP高表达组合与其他患者的生存曲线进行比较。双侧P值由log-rank（Mantel-Cox）检验计算。图示的x轴下方显示高表达组（红色）与其他组（蓝色）的受试者数量。(I) 在TCGA-TNBC数据库中比较C1QBP高浸润巨噬细胞患者（n = 46）中VTN高或低表达的生存曲线。双侧P值由log-rank（Mantel-Cox）检验计算。图示的x轴下方显示高表达组（红色）与其他组（蓝色）的受试者数量。所有qRT-PCR数据均来自三次独立实验，数据以均值±SEM表示，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，ns不显著，通过未配对双侧Student's t检验。2.3 C1qbp是Vtn在巨噬细胞膜上的主要结合分子
为了评估Vtn-C1qbp信号在调节巨噬细胞介导的癌症免疫反应中的作用，我们检查了C1qbp在免疫细胞中的表达。使用两种解卷积算法，肿瘤免疫估计资源（TIMER）和CIBERSORT，以及来自癌症基因组图谱（TCGA）的RNA测序数据，揭示了C1QBP在巨噬细胞中的高表达，特别是在免疫抑制性的M2样巨噬细胞中（图3A）。此外，我们的FACS分析显示，在4T1肿瘤微环境中，膜结合形式的C1qbp主要存在于巨噬细胞中，而非肿瘤细胞中（图S3C-D）。此外，浸润到4T1肿瘤中的TAMs几乎全部为膜C1qbp+，提示膜C1qbp+巨噬细胞可能具有免疫抑制功能（图3B）。Vtn通常是一种分泌蛋白，而C1qbp可以定位在质膜上或细胞内。为了研究Vtn-C1qbp信号对吞噬作用的影响，我们检测了在吞噬过程中巨噬细胞膜上是否存在Vtn和C1qbp（图3C）流式细胞术结果显示，Raw264.7细胞和4T1细胞直接共培养2小时，与未与4T1细胞共培养的Raw264.7和4T1细胞相比，C1qbp+和Vtn+巨噬细胞的比例显著增加（图3D）。为了进一步确认肿瘤来源的Vtn与巨噬细胞质膜上的C1qbp的结合，我们将对照的Raw264.7细胞或C1qbp敲低的Raw264.7细胞（C1qbp几乎不可检测）（图3E）与表达Myc标记Vtn的4T1细胞条件培养基（CM）共培养（图3F）。正如预期的那样，在没有C1qbp的情况下，Myc-Vtn在Raw264.7细胞质膜上的结合显著减少，表明C1qbp是巨噬细胞质膜上Vtn的主要受体（图3G）。为了进一步验证Vtn与C1qbp的结合，我们在Raw264.7细胞中进行了免疫共沉淀（IP）结合Western blot分析。在与4T1细胞共培养的Raw264.7细胞的全细胞裂解液及膜部分中，Vtn与C1qbp发生了共沉淀（图3H）。已有研究表明，当成熟形式的C1qbp的N端22个氨基酸被截断后，Vtn与C1qbp的结合显著减少。为了定义Vtn与C1qbp的结合域，我们构建了一个截断了C1qbp成熟形式N端第一个20个氨基酸（αA域，核苷酸229-288）并在C端添加Flag标签的小鼠C1qbp突变体。在HEK293T细胞中，我们共同转染了Myc-Vtn和野生型或突变型C1qbp并进行了共IP实验。如图3I所示，Myc-Vtn与全长C1qbp特异性共沉淀，但与缺失αA域（氨基酸残基77-96）的突变体的结合显著减弱，表明Vtn主要与C1qbp的αA域相互作用。我们使用ClusPro服务器对C1qbp（AF-O35658-F1）和Vtn（AF-P29788-F1）的预测晶体结构进行对接分析。选择了C1qbp-αA域在与Vtn结合中占主导地位的结构，并对这两个复合物之间的相互作用进行了检查（图3J）。这些数据表明，肿瘤来源的Vtn主要通过巨噬细胞质膜上的αA域与C1qbp相互作用。![]()
Figure 3 Vtn与巨噬细胞质膜上的C1qbp结合。
(A) 使用CIBERSORT评估来自TCGA乳腺癌患者的免疫细胞亚群中C1QBP mRNA的相对水平。(B) 在4T1肿瘤中的C1qbp+ TAMs的分选策略；C1qbp+ TAMs被评估为CD45+F4/80+C1qbp+，右侧显示4T1肿瘤负荷小鼠（n = 5）中C1qbp+ TAMs的频率。(C) 体外共培养实验的示意图，用于检测4T1和Raw264.7细胞表面的C1qbp和Vtn。(D) 共同培养后4T1和Raw264.7细胞表面Vtn和C1qbp表达的流式细胞术分析。图D中展示的定量数据以均值±SEM表示（n = 3），***p < 0.001，通过未配对双侧Student's t检验。(E) qRT-PCR和Western blot分析显示Raw264.7细胞中C1qbp shRNA的敲降效率。(F) 使用来自4T1（Myc-VtnOE）细胞的条件培养基（CM）刺激巨噬细胞的体外交互实验示意图。(G) 在含有Myc-Vtn的CM刺激后，C1qbp敲降的Raw264.7细胞表面Myc-Vtn的流式细胞术分析。数字表示在总细胞中Myc-Vtn+事件的频率。(H) 在用4T1细胞条件培养基（CM）刺激后的Raw264.7全裂解物和膜中进行Vtn和C1qbp的免疫共沉淀。(I) C1qbp缺失突变体及其基因互补表型的示意图。全长C1qbp（C1qbp FL）和缺少αA域的C1qbpΔαA都带有Flag标签。定义C1qbp中与Vtn相互作用的域。在HEK293T细胞中共转染Myc标记的Vtn和表达指示Flag标记的C1qbp缺失突变体或全长C1qbp的载体进行Co-IP和Western blot分析。(J) 通过ClusPro获得的C1qbp域（青色，αA域为橙色）和全长Vtn蛋白（绿色）的分子对接复合物。显示氨基酸结合相互作用的红线。2.4 Vtn-C1qbp轴通过抑制巨噬细胞吞噬作用保护癌细胞
为了探究Vtn-C1qbp信号在调控巨噬细胞介导的抗肿瘤免疫反应中的作用，我们对4T1细胞中的Vtn进行敲降，并使用Raw264.7和骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）进行吞噬实验（图4A）。在将Raw264.7或BMDM与对照组或Vtn敲降的4T1细胞直接共培养时，发现仅Vtn敲降就足以增强吞噬作用（图4B）。为了进一步验证Vtn在体内保护肿瘤细胞免受巨噬细胞吞噬的作用，我们将GFP+对照组或Vtn敲降的4T1细胞正位移植到BALB/c小鼠的乳腺脂肪垫中（图4C）。移植18天后，我们发现与对照肿瘤相比，Vtn敲降的肿瘤中浸润的肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）表现出更高水平的体内吞噬作用（图4D）。为了通过共聚焦显微镜测量吞噬清除率，我们用GFP标记对照组和Vtn敲降的4T1细胞，并与BMDM共培养6小时。与对照细胞相比，Vtn敲降细胞更容易被巨噬细胞吞噬（图4E）。为了研究C1qbp表达对吞噬作用的影响，我们使用对照和C1qbp敲降的Raw264.7细胞进行吞噬实验。C1qbp敲降的Raw264.7细胞表现出显著更强的吞噬能力，较对照组Raw264.7细胞更为明显（图4F）。我们还发现，敲除C1qbp对Vtn敲降的4T1细胞的吞噬作用没有影响（图4G），这表明除了Vtn之外，没有其他巨噬细胞分泌的因子能够刺激C1qbp抑制吞噬的能力。总体而言，这些结果表明，Vtn-C1qbp是一个抗吞噬信号，能够在体外和体内保护肿瘤细胞免受巨噬细胞吞噬。![]()
图4 Vtn-C1qbp抑制巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。
(A) qRT-PCR和Western blotting分析显示Vtn shRNA的敲降效率。(B) 代表性流式细胞仪图显示了共培养的对照4T1-GFP细胞和Vtn敲降的4T1-GFP细胞与Raw264.7或BMDMs的吞噬作用，数字表示在所有巨噬细胞中吞噬事件的频率。数据以三次独立测量的均值±标准误表示，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，采用未配对双尾Student's t检验。(C) 体内吞噬实验示意图。GFP标记的Vtn敲降或对照4T1细胞正位移植到BALB/c小鼠的乳腺脂肪垫中，并在第18天处死小鼠。(D) TAM吞噬作用通过评估在所有CD11b+F4/80+事件中的CD11b+F4/80+GFP+事件的频率来进行评估。数字表示在所有巨噬细胞中吞噬事件的频率。图是三次实验重复的代表性图像。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，采用未配对双尾Student's t检验。(E) 代表性的荧光显微镜图像显示了BMDMs（F4/80+；红色）在6小时共培养后的体外吞噬Vtn敲降或对照4T1细胞（GFP+，绿色）。实验重复进行了三次。比例尺，100 μm。*p < 0.05。(F和G) 代表性流式细胞仪图显示了C1qbp敲降的Raw264.7细胞对对照4T1-GFP细胞(F)和Vtn敲降的4T1-GFP细胞(G)的吞噬作用，数字表示在所有巨噬细胞中吞噬事件的频率。数据以三次独立测量的均值±标准误表示，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，ns表示无显著性，采用未配对双尾Student's t检验。2.5 Vtn-C1qbp 使巨噬细胞极化为 M2 样表型
为进一步研究 Vtn-C1qbp 对肿瘤生长的影响，我们在小鼠体内进行对照组和 Vtn 敲降的 4T1 细胞的正位移植，并从第 7 天开始每隔一天测量肿瘤大小。我们观察到，与对照肿瘤相比，Vtn 敲降肿瘤的生长和重量显著减少（图 5A-C）。已报道在 4T1 肿瘤负荷的小鼠中，脾脏肿大（脾脏增大）是由于脾髓样抑制细胞（MDSCs）等未成熟脾粒细胞的增加而导致的。我们还观察到与对照小鼠相比，Vtn 敲降肿瘤负荷小鼠的脾脏大小和重量显著减少（图 S4A-B），而体重没有显著差异（图 S4C）。肺部是乳腺癌转移的主要部位。我们发现，肿瘤细胞中的 Vtn 敲降导致肿瘤组织中 Vtn 表达减少，肺部转移灶的数量显著减少（图 5D 和图 S4D）。Vtn 敲降对肺的大小和重量没有显著影响（图 S4E）。我们还研究了 Vtn 敲降对其自身增殖能力的影响，发现其增殖能力与对照相比无显著变化（图 S4F）。巨噬细胞具有高度的可塑性，可以极化为 M1 样的促炎性或 M2 样的抗炎性表型。促使肿瘤生长的肿瘤相关巨噬细胞通常是 M2 样类型。为进一步研究 Vtn 是否对巨噬细胞的极化有影响，我们研究了肿瘤微环境中巨噬细胞的表型。在通过正位移植 4T1 细胞生成的同基因乳腺癌小鼠模型中，我们分析了肿瘤中的免疫细胞比例（注：如何分析），包括巨噬细胞、树突状细胞（DC）、髓样抑制细胞（MDSCs）和三种主要类型的淋巴细胞（T 细胞、B 细胞和 NK 细胞）。对照组与 Vtn 敲降小鼠的巨噬细胞（CD11b+F4/80+）比例没有显著变化（图 5E）。然而，与对照组相比，浸润到 Vtn 敲降肿瘤中的 TAM 显示出 M1 样巨噬细胞（MHCⅡhigh+）的比例增加，而 M2 样巨噬细胞（CD206+ 或 IL-10+）的比例减少（图 5F）。此外，我们观察到，与对照肿瘤相比，Vtn 敲降肿瘤中的白细胞（CD45+）比例显著升高（图 5G）。T 淋巴细胞及其亚型 CD4+ 和 CD8+ 以及 NK 细胞的比例在对照组和 Vtn 敲降肿瘤中没有显著变化（图 5E 和图 S5A）；然而，浸润到 Vtn 敲降肿瘤中的 CD4+ 和 CD8+ T 细胞表现出比对照肿瘤更高的激活状态（CD69+）（图 S5B）。Vtn 敲降肿瘤中的 DC、B 细胞和 MDSC 的比例显著减少（图 5E）。由于 CD4+ 和 CD8+ T 细胞的激活主要依赖于抗原呈递细胞，而 B 细胞和 DC 细胞数量的减少并未导致激活减少，因此很可能是由于 TAM 介导的肿瘤细胞吞噬增加，进而增强了 CD4+ 或 CD8+ T 细胞的激活。为进一步确认 Vtn-C1qbp 轴对巨噬细胞极化的影响，我们将 Raw264.7 细胞与 4T1 细胞直接在体外共培养 48 小时，随后检测巨噬细胞的表型。与对照 4T1 细胞共培养的巨噬细胞相比，与 Vtn 敲降 4T1 细胞共培养的巨噬细胞表达了更高水平的 M1 样标志物和更低水平的 M2 样标志物（注：M1和M2样巨细细胞标记物）（图 5H）。我们还发现，与对照 4T1 细胞相比，直接与 Vtn 过表达的 4T1 细胞共培养后，巨噬细胞明显偏向 M2 样表型（图 5I 和图 S6A）。同时，与对照 Raw264.7 细胞相比，C1qbp 敲降的 Raw264.7 细胞与 4T1 细胞共培养后，表达了更高水平的 M1 样标志物和更低水平的 M2 样标志物（图 5J）。当通过流式细胞术分析巨噬细胞表型时，获得了类似的结果。沉默 Vtn 或 C1qbp 增加了 M1 样（MHCII+）巨噬细胞的比例，并减少了 M2 样（CD206+）巨噬细胞的比例（图 5K-L 和图 S5C-D），而 Vtn 过表达则产生了相反的效果（图 5D 和图 S5E）。为进一步验证 Vtn-C1qbp 信号通路对巨噬细胞 M2 样表型的影响，我们进行了拯救实验，通过转染表达全长或截短 C1qbp 的质粒到 C1qbp 敲降细胞中，然后将其与 4T1 细胞共培养（图 S6B）。全长 C1qbp 的再表达恢复并甚至略微增加了 M2 相关标志物 Arg1 的表达，与载体对照相比。同时，与全长 C1qbp 相比，缺乏 Vtn 结合域的截短 C1qbp 在恢复 C1qbp 敲降细胞中 Arg1 表达的能力显著降低（图 S6C），这表明 Vtn-C1qbp 相互作用对于 Arg1 表达以及巨噬细胞向 M2 样表型转变是必需的。相比之下，无论是全长还是截短的 C1qbp 都未能抑制 C1qbp 敲降细胞中 Inos 表达的增加（图 S6D）。这可能是由于 C1qbp 的丧失可能引起了 M1 样表型的不可逆变化，或至少影响了某些 M1 标志物的表达。![]()
图 5 Vtn-C1qbp 促使巨噬细胞向 M2 样表型分化。
(A) 正交接种 Vtn 敲低或对照 4T1 细胞后的肿瘤生长曲线。（n = 5-6，数据以均值 ± SEM 表示，*p < 0.05，**p < 0.01，使用双侧未配对 Student's t 检验）。(B) 从接种了相应 4T1 细胞的 BALB/c 小鼠中解剖出的原发性肿瘤的图像。(C) 收集的肿瘤的重量。（n = 5-6，数据以均值 ± SEM 表示，*p < 0.05，**p < 0.01，使用双侧未配对 Student's t 检验）。(D) 从接种了相应 4T1 细胞的动物中获得的肺和肿瘤切片的 H&E 染色图像以及 Vtn 的免疫组化。比例尺 = 100 μm。(E 至 G) 从 Vtn 敲低或对照 4T1 小鼠（n = 4-6）中收获的肿瘤进行流式细胞术分析。箱线图显示 CD45+ 细胞中巨噬细胞、T 淋巴细胞、树突状细胞、B 淋巴细胞、髓源抑制细胞（MDSCs）和 NK 细胞的比例 (E)，巨噬细胞（CD11b+F4/80+）中 MHCⅡhigh、CD206+ 和 IL-10+ 的比例 (F)，以及总活性事件中的 CD45+ 细胞的比例 (G)。箱线从第 25 百分位延伸到第 75 百分位，箱线中的水平线代表中位数，胡须表示最大和最小值，*p < 0.05，***p < 0.001，ns 表示无显著差异，使用双侧未配对 Student's t 检验。(H) 在被 Vtn 敲低或对照 4T1 细胞刺激 48 小时后，Raw264.7 细胞中的巨噬细胞标志基因的 qRT-PCR 分析。(I 和 J) 在 Vtn 过表达或对照（Vector）4T1 细胞 (I) 以及在 4T1 细胞共培养 48 小时的对照和 C1qbp 敲低 Raw264.7 细胞 (J) 中，分析巨噬细胞标志基因 Inos 和 Arg1 的 qRT-PCR。(K 至 M) 流式细胞术分析在与 Vtn 敲低或对照 4T1 细胞 (K)，与 Vtn 过表达或对照（Vector）4T1 细胞 (M) 以及在 4T1 细胞共培养的对照和 C1qbp 敲低 Raw264.7 细胞 (L) 中共培养 48 小时后 M1 样（MHCII+）和 M2 样（CD206+）亚群。所有 qRT-PCR 数据均显示为来自三个独立实验的均值 ± SEM，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，ns 表示无显著差异，使用双侧未配对 Student's t 检验。2.6 Vtn-C1qbp 介导的 CD16 依赖性 Shp1 招募机制在巨噬细胞中的作用
为了探究 C1qbp 如何影响巨噬细胞的吞噬作用，我们使用免疫沉淀（IP）结合质谱分析（mass spectrometry）来鉴定与 C1qbp 相关的相互作用蛋白。通过使用抗 C1qbp 抗体从 Raw264.7 细胞中免疫沉淀 C1qbp，并通过质谱分析鉴定其相互作用蛋白。我们检测到了 296 种 C1qbp 的特异性结合蛋白（图 6A）。KEGG 通路富集分析显示这些蛋白主要富集在 Fcγ 受体介导的吞噬作用和吞噬相关的内吞作用通路中（图 6B）。同时，我们在 C1qbp 的特异性结合蛋白中鉴定到了 Syk，这是 Fcγ 介导的吞噬和巨噬细胞活化的一个关键效应蛋白（图 6A）。因此，我们进一步研究了 C1qbp 对 Syk 表达和磷酸化的影响。与对照 Raw264.7 细胞相比，C1qbp 敲低的 Raw264.7 细胞在与 4T1 细胞共培养后表现出更高的 Syk 表达水平（图 6C）。接下来，我们确定了 Vtn-C1qbp 信号通路在抑制巨噬细胞吞噬作用中对 Syk 蛋白表达和磷酸化的作用。在与 4T1 细胞共培养时，Raw264.7 细胞的 Syk 表达下降，而与 Vtn 敲低的 4T1 细胞共培养则显著提高了 Syk 的表达，使其达到与未与 4T1 细胞共培养的 Raw264.7 细胞相似的水平（图 6D）。为了进一步证明 Vtn-C1qbp 信号通路对 Syk 表达的影响，我们构建了过表达全长和缺失 Vtn 结合域的 C1qbp 的 Raw264.7 细胞。与对照 Raw264.7 细胞相比，在与 4T1 细胞共培养时，过表达全长 C1qbp 而非缺失 Vtn 结合域的 C1qbp 能显著减弱 Syk 的表达（图 6E），表明 Vtn-C1qbp 信号通路抑制了巨噬细胞中的 Syk 表达。此外，在 4T1 细胞中敲低 Vtn 并未进一步增加 C1qbp 敲低在巨噬细胞中对 Syk 表达的增强作用（图 S7A），表明 Vtn 对 Syk 表达的影响依赖于 C1qbp。此外，Syk 在 Raw264.7 细胞中对 4T1 条件培养基（CM）的响应是快速磷酸化的，磷酸化发生在处理后 15 分钟并持续约 2 小时；并且 C1qbp 敲低增强了 4T1 CM 诱导的 Syk 磷酸化（图 6F 和图 S7B）。与此同时，Vtn 敲低的 4T1 细胞的 CM 诱导 Raw264.7 细胞中的 Syk 磷酸化增强，表明 Vtn-C1qbp 信号通路抑制了巨噬细胞中的 Syk 磷酸化。我们进一步研究了 C1qbp 对 Syk 磷酸化影响的机制和下游分子。作为一种定位于脂筏中的蛋白，C1qbp 可以通过与细胞膜上的受体相互作用发挥其功能。在我们的 IP-质谱分析中，我们鉴定了与 C1qbp 相互作用的几种蛋白质，值得注意的是其中包括 CD16 受体和酪氨酸磷酸酶 Src 同源 2 含有磷酸酶 1 (Shp1)，Shp1 与 Syk 的磷酸化有关。Shp1 在调节酪氨酸磷酸化中起着关键作用。它可以通过结合磷酸化的免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIM）来定位，并随后与含 ITIM 的分子一起抑制信号通路，包括那些涉及 Syk 磷酸化的信号通路。CD16 受体含有 ITAM 基序，有报道称它通过在 E. coli-FcγRIII 相互作用过程中招募 Shp1 到膜上来抑制巨噬细胞对大肠杆菌的吞噬作用。基于这些发现，我们假设 Vtn-C1qbp 促进了 CD16 诱导的 Shp1 招募，且敲低 Vtn 或 C1qbp 可减少 Shp1 招募（图 6H）。为了研究 C1qbp、CD16 和 Shp1 之间的相互作用，我们进行了免疫沉淀结合蛋白质印迹分析。我们发现 CD16 在 Raw264.7 细胞中与 C1qbp 和 Shp1 共同免疫沉淀，表明 C1qbp 参与了 CD16 的 Shp1 招募过程（图 6I-J）。免疫荧光染色的结果显示 CD16、C1qbp 和 Shp1 在细胞表面部分共定位，这一结果通过沿穿过细胞核的矩形区域（白色虚线）的荧光强度轮廓得到了进一步证实（图 6K 和图 S8A）。为了探究 C1qbp 是否影响 Shp1 向 CD16 的招募，我们在 C1qbp 敲低的 Raw264.7 细胞中进行了 Shp1 染色。在对照细胞中，Shp1 蛋白显著招募到质膜并部分与 CD16 共定位。相反，C1qbp 敲低后，CD16 与 Shp1 在质膜上的共定位显著减少（图 6L）。这一观察结果也得到了后续荧光强度分析的支持。基于这些实验结果，我们提出 Syk 磷酸化的减少可能是由于 C1qbp 介导的 Shp1 招募引起的，这些 Shp1 使 Syk 去磷酸化。此外，我们还观察到 CD16 和 Shp1 的表达减少，这也可能促成了 Syk 磷酸化的增加。我们进一步检测了参与 Fcγ 受体介导吞噬作用中 Syk 下游功能的基因表达，包括 Pi3k、Akt、Dynamin2、Plcg1、Arf6、Vav1 和 Pla2g4a（注：如何确定这些基因）。在与 Vtn 敲低的 4T1 细胞共培养的 Raw264.7 细胞中，Vav1 和 Pla2g4a 的表达显著增加，而与对照 4T1 细胞共培养的 Raw264.7 细胞相比，Vtn 敲低对其他 Syk 下游基因如 Pi3k、Akt、Dynamin2、Plcg1 和 Arf6 的表达没有影响（图 S8B）。我们还研究了 C1qbp 对 Vav1 和 Pla2g4a 的影响。与对照 Raw264.7 细胞相比，C1qbp 敲低的 Raw264.7 细胞共培养 4T1 细胞后 Vav1 表达增加，但 Pla2g4a 表达减少（图 S8C）。此外，在与 4T1 细胞共培养的 Raw264.7 细胞中，过表达全长 C1qbp 而非缺失 Vtn 结合域的 C1qbp 能显著减弱 Vav1 表达，而两者对 Pla2g4a 表达的影响均较小（图 S8D）。总之，这些结果表明 Vtn-C1qbp 信号通路通过 Syk 及其下游效应因子 Vav1 抑制了吞噬作用。![]()
图6 Vtn-C1qbp通过Shp1抑制Syk磷酸化
(A) C1qbp互作蛋白的质谱分析。C1qbp-IP在Raw264.7细胞中进行，C1qbp-IP蛋白质随后通过质谱分析进行检测。对照组为Raw264.7细胞中的IgG-IP蛋白。(B) KEGG通路富集分析显示与对照相比，C1qbp-IP中独特的296个蛋白质。(C) qRT-PCR分析Syk基因在与4T1细胞共培养的对照和C1qbp敲低的Raw264.7细胞中的表达。(D) qRT-PCR分析Syk基因在与Vtn敲低或对照4T1细胞共培养的野生型Raw264.7、对照和C1qbp敲低的Raw264.7细胞中的表达。共培养时间为48小时。(E) qRT-PCR分析Syk基因在全长C1qbp过表达（Raw264.7OE-FL）、突变型C1qbp（Raw264.7OE-ΔαA）过表达和对照Raw264.7（Raw264.7MCS）细胞中的表达。(F) Western blot分析在C1qbp敲低或对照Raw264.7细胞中用来自4T1细胞的条件培养基（CM）处理后不同时间点的Syk及其磷酸化水平（p-Syk）。(G) Western blot分析在Raw264.7细胞中用来自对照或Vtn敲低的4T1细胞的CM处理后不同时间点的Syk及其磷酸化水平。p-Syk：Syk的磷酸化形式。(H) 模型图总结了Vtn-C1qbp在Syk磷酸化中的作用。CD16的示意图显示了两个免疫球蛋白样的胞外亚基和与CD3ζ链（灰色）形成复合物的α链（蓝色）。免疫受体酪氨酸基活化基序（ITAMs）以绿色显示。(I 和 J) 在用4T1细胞的CM刺激的Raw264.7细胞中，Shp1与CD16的共免疫沉淀（I）以及C1qbp与CD16的共免疫沉淀（J）。(K) 在表达flag-C1qbp的Raw264.7细胞中，CD16、flag-C1qbp和Shp1的免疫荧光染色。CD16、flag-C1qbp、Shp1和细胞核分别染为黄色、品红色、绿色和蓝色（DAPI）。比例尺，1 μm。(L) 在Raw264.7细胞中CD16、细胞表面标记（Dil）和Shp1的免疫荧光染色。CD16、细胞表面、Shp1和细胞核分别染为黄色、品红色（Dil）、绿色和蓝色（DAPI）。比例尺，1 μm。右侧的图表显示在叠加图像上标识的感兴趣区域的平均荧光强度。2.7 Vtn沉默与抗CD47抗体协同介导抗肿瘤活性并增强TAM扩展和吞噬作用CD47是研究最广泛的“别吃我”信号，过度表达在肿瘤细胞上，并通过与其受体SIRPα的相互作用抑制巨噬细胞的活性。CD47阻断在早期人体试验中显示出有希望的临床活性。此外，我们对公共单细胞测序数据的分析表明，在TNBC（三阴性乳腺癌）患者中，C1qbp阳性TAM与肿瘤细胞的免疫抑制相互作用（包括CD47-SIRPα）比C1qbp阴性TAM更强（图S9A-C）。基于Vtn-C1qbp信号通路在肿瘤免疫反应中的作用，我们进一步研究了Vtn敲低与抗CD47抗体治疗是否具有协同抗肿瘤作用。我们将对照组和Vtn敲低的乳腺癌细胞接种到小鼠的脂肪垫中，从第7天到第25天，每隔一天用IgG对照或抗CD47抗体处理小鼠，并测量肿瘤大小（图7A）。与未处理组相比，单独的Vtn敲低或抗CD47抗体治疗都减少了肿瘤的生长和重量，效果相似，而在Vtn敲低肿瘤的小鼠中进行抗CD47抗体治疗则进一步显著抑制了肿瘤的生长和重量（图7B-D）。相对于未治疗或单一治疗，Vtn敲低和抗CD47抗体治疗的协同作用与肿瘤微环境中巨噬细胞浸润的增加相关（图7E）。一致地，Vtn敲低或单独抗CD47抗体治疗促进了巨噬细胞的吞噬作用，而Vtn敲低与抗CD47抗体联合治疗进一步增加了巨噬细胞的吞噬作用（图7F），展示了Vtn敲低与抗CD47抗体之间的潜在协同作用。
为了进一步确定巨噬细胞是否是Vtn敲低引起肿瘤抑制的关键因素，我们使用氯膦酸脂质体消耗巨噬细胞（图S10A）。随后，我们比较了巨噬细胞消耗对Vtn敲低肿瘤小鼠的影响（图S10B）。值得注意的是，在巨噬细胞消耗组中，Vtn敲低的肿瘤抑制效应减弱（图S10C-D），显著大于Vtn敲低组，表明巨噬细胞在Vtn敲低引发的肿瘤抑制中发挥了重要作用。综上所述，通过在吞噬实验中使用针对肿瘤细胞和巨噬细胞的CRISPR/Cas9敲除库筛选，我们识别出癌细胞表达的Vtn与肿瘤相关巨噬细胞膜上的C1qbp之间的相互作用，抑制了巨噬细胞的吞噬作用，并促使巨噬细胞更加偏向M2样表型。Vtn与巨噬细胞膜上的C1qbp结合促进了CD16介导的Shp1募集，从而减少了Syk的磷酸化，进而抑制了巨噬细胞的吞噬作用（图7G）。这项研究可能为癌症治疗提供了一个新的分子靶点。![]()
图7 Vtn沉默与CD47阻断协同增加癌细胞对吞噬的易感性。
(A) 小鼠实验示意图（每组6只小鼠）。（B到D）肿瘤体积（B）、实验结束时的肿瘤重量（C）和代表性图像（D）进行测量（n = 6，均值 ± SEM，ns表示无显著性，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001）。（E）通过CD11b+F4/80+GFP+事件占总CD11b+F4/80+事件的频率评估TAM的吞噬作用。数字表示所有巨噬细胞中吞噬事件的频率。图为三次实验的代表性数据。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，使用未配对双侧Student's t检验。(F) 小鼠实验中的TAM群体通过FACS分析。n = 5。(G) 示意图总结了Vtn-C1qbp信号在调节巨噬细胞吞噬作用和表型中的作用。3. 讨论
巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用受多种促吞噬信号（"eat me"）和抗吞噬信号（"don't eat me"）的调控，特别是在细胞间界面的配体-受体相互作用中发挥重要作用。据报道，TNBC（三阴性乳腺癌）肿瘤中CD47高度表达，并且其表达与患者较差的预后相关。然而，一项研究表明，与Raji细胞（非霍奇金淋巴瘤）相比，MDA-MB-231（TNBC）细胞对CD47阻断抗体的吞噬率较低，这表明在TNBC和巨噬细胞之间可能还存在其他抑制吞噬的信号。基于上述背景，我们进行了CRISPR文库筛选，寻找抑制吞噬作用的基因，最终鉴定出Vtn-C1qbp配体-受体对，它能够调控巨噬细胞的吞噬作用。在以往的研究中，Vtn和C1qbp之间的相互作用曾被检测到，但尚未详细表征。我们的共免疫沉淀实验首次揭示了由肿瘤细胞分泌的Vtn能够与巨噬细胞质膜上的C1qbp结合。此外，将C1qbp成熟形式的前20个氨基酸截去后，Vtn对C1qbp的结合显著减弱。通过使用缺乏Vtn结合域的C1qbp截短形式进行的拯救实验，进一步证明了Vtn通过与巨噬细胞质膜上的C1qbp结合来抑制巨噬细胞的吞噬作用。先前关于配体-受体对的研究，如CD24-Siglec10和CD47-Sirpα，使用中和抗体直接验证了它们对吞噬作用的影响。然而，目前尚无可直接验证我们结果的C1qbp小分子抑制剂或抗体。因此，我们未来的研究将致力于发现C1qbp的抑制剂并生成其中和抗体。此外，Vtn敲降导致M1样巨噬细胞显著增加以及肿瘤微环境中CD8+ T细胞活化的显著增强，这表明增强的吞噬作用诱发了适应性免疫的间接活化，从而减缓了肿瘤的生长。已有研究报道，Vtn在血栓形成、伤口愈合和组织修复中发挥重要作用，而这些过程中的主要参与者是M2型巨噬细胞。与此一致，我们在本研究中也发现，来自肿瘤细胞的Vtn释放会诱导巨噬细胞偏向M2样，这表明Vtn也是肿瘤微环境中巨噬细胞极化的重要调节因子。C1qbp最初是在Raji细胞质膜上鉴定出的，但随后研究发现它也可以定位在细胞内或线粒体中。这也与我们的免疫荧光结果相吻合。C1qbp在线粒体中的主要功能是维持氧化磷酸化，这在组织维持和正常功能中起着关键作用。由于吞噬作用与氧化磷酸化密切相关，C1qbp的胞内形式也可能在吞噬作用中发挥作用。我们将探讨这种可能性。我们的研究结果表明，在C1qbp敲降后，与肿瘤细胞共培养的巨噬细胞显著偏向M1样型。该发现表明C1qbp对巨噬细胞表型转换至关重要，因而是免疫治疗的一个有前景的靶点。目前报道的膜形式C1qbp主要在病毒感染中发挥作用，被认为是重要的病原识别受体。丙型肝炎病毒（HCV）的核心蛋白和人类免疫缺陷病毒（HIV）gp41包膜糖蛋白可以利用C1qbp靶向CD4+ T细胞或单核细胞，介导免疫抑制。然而，膜形式C1qbp在癌症发展中的作用鲜有报道。值得注意的是，我们发现膜形式的C1qbp仅存在于CD45阳性细胞中，而不在肿瘤细胞中，且主要分布在巨噬细胞上。此外，我们还注意到，几乎所有浸润到4T1肿瘤中的巨噬细胞都表达膜形式的C1qbp，这表明C1qbp在巨噬细胞中发挥重要作用。同时，在静息状态下，巨噬细胞质膜上几乎检测不到C1qbp，但在肿瘤上清液刺激或与肿瘤细胞共培养后，C1qbp在巨噬细胞质膜上的转移显著增强。我们推测，肿瘤分泌的某些特定因子可能会影响C1qbp向质膜的转移，这种机制可能与胰腺癌肿瘤细胞中的C1qbp易位机制类似。CD16，也被称为FcγRIIIA，已被广泛报道与Syk激活相关。在败血症中，CD16与大肠杆菌相互作用诱导Shp1募集，并使磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）去磷酸化，从而抑制大肠杆菌的吞噬作用。由于我们的质谱分析结果显示CD16和Shp1是C1qbp的相互作用蛋白，我们进一步研究了C1qbp对Shp1募集的影响。免疫荧光共定位分析表明，C1qbp增加了Shp1的募集，并且提示CD16在巨噬细胞吞噬中可能具有双重作用。基于这些结果，我们进一步评估了Vtn敲降与抗CD47抗体治疗对肿瘤生长抑制的协同作用。结果显示，Vtn敲降与抗CD47抗体的组合治疗在抑制4T1肿瘤生长和提高巨噬细胞浸润方面表现出高度有效。此外，与单一治疗相比，组合治疗显著增强了巨噬细胞的吞噬作用，表明抑制Vtn和CD47具有潜在的协同效应。我们的研究为通过靶向肿瘤微环境治疗癌症提供了新的策略。
原文网址：https://www.thno.org/v14p2757.htm
