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题目
二甲双胍减缓雄性猴子的衰老时钟
研究亮点
摘要
在一项为期40个月的严格研究中，我们评估了二甲双胍对成年雄性食蟹猴的抗衰老效果，填补了灵长类动物衰老研究的空白。该研究包括全面的生理、影像学、组织学和分子评估，证实了二甲双胍在整体水平上延缓与年龄相关表型的影响。具体而言，我们利用全组织转录组学、DNA甲基化组学、血浆蛋白质组学和代谢组学开发了创新的猴子衰老时钟，并应用这些方法评估二甲双胍对衰老的影响。结果显示，衰老指标显著减缓，尤其是大脑衰老大约逆转了6年。二甲双胍对大脑具有显著的神经保护作用，保留了大脑结构并增强了认知能力。二甲双胍对灵长类动物神经元的抗衰老效果部分通过激活Nrf2（一个具有抗氧化能力的转录因子）介导。我们的研究首次展示了通过二甲双胍系统性减少灵长类动物的多维生物年龄，为推动人类抗衰老药物策略的发展铺平了道路。1. 引言
衰老是一个逐步发展的过程，会引起组织功能障碍和生理退化，最终导致与年龄相关的疾病的出现，包括神经退行性疾病、心血管疾病和糖尿病等。值得注意的是，越来越多的证据表明，通过小分子药物、基因操作、运动和饮食等干预措施，衰老的某些方面在啮齿动物中是可塑的。Metformin，作为2型糖尿病的一线治疗药物，由药用植物Galega officinalis中的guanidine类衍生物发展而来，已显示出在多种模型（包括线虫、果蝇和啮齿动物）中减缓生理衰老的潜力。先前的研究，包括我们自己的研究，也证明了Metformin有潜力减轻人类二倍体细胞的衰老。此外，回顾性研究表明，Metformin似乎降低了糖尿病患者的死亡率。然而，Metformin是否能够延缓灵长类动物的衰老并改善与衰老相关的组织退化仍然不明确。随着高通量omics技术的进步，一套尖端工具用于测量生物衰老的工具包已逐渐成型，使我们能够在分子水平上精确量化衰老速率。通过将epigenomics、transcriptomics、proteomics和metabolomics数据整合到机器学习中，开发出了“aging clocks”，为评估抗衰老干预措施的效果提供了手段。此外，单细胞测序技术的发展进一步加深了我们对衰老过程及其干预措施的复杂细胞和分子机制的理解。然而，Metformin是否能够在全组织水平上促进多维生物系统的整体复原，尚需进一步探究。为了研究Metformin是否减轻了与年龄相关的功能衰退，我们进行了为期40个月的全面研究，评估了Metformin在老年灵长类动物中的补充效果。具体而言，我们的研究涵盖了广泛的分析技术，包括生理检查、医学影像、全组织组织学分析、全体transcriptomics和单核RNA测序（snRNA-seq）。通过量化这些参数并将其整合到一个全面的“primate aging clock”中，我们提供了证据表明Metformin在雄性食蟹猴的多种组织中减缓了衰老过程。重要的是，我们的研究还强调了Metformin的显著神经保护作用，并通过人类干细胞衍生的神经元衰老模型进一步验证了这一点。我们的结果证实，长期使用Metformin减轻了灵长类动物的衰老，表明其在临床上有潜力用于衰老管理和疾病预防。2. 结果
2.1 长期服用Metformin在灵长类动物中展现出抗衰老效果为了评估长期服用Metformin是否能延缓健康灵长类动物的衰老，我们进行了一项概念验证研究，研究对象为13至16岁的雄性食蟹猴（Macaca fascicularis），相当于人类的40至50岁。在研究开始时，猴子按年龄平均分配，并随机分配到Metformin治疗组和对照组（以下简称O-Met组和O-Ctrl组）。O-Met组的猴子每天服用20 mg/kg的Metformin，这是人类糖尿病管理中的标准剂量，同时它们与O-Ctrl组在相同的环境和护理条件下生活（Figure 1A）。研究中O-Ctrl组的一只猴子在第1126天因肾衰竭死亡，经过兽医确认。其余猴子坚持该方案1,200天，约为3.3年，相当于人类的约10年。
两组每3个月进行一次常规体检（Figure 1A）。我们观察到，长期服用Metformin并未导致血糖稳态受损，也未导致体重下降（Table S1）。同样，我们未发现血液细胞组成或尿液生理特征的显著变化（Table S1）。此外，我们还包括了两个额外的对照组：分别为3至5岁和10至12岁的雄性食蟹猴，称为Y-Ctrl组和M-Ctrl组。当O-Met组完成1,200天的Metformin治疗后，我们对四组猴子进行了68个生物参数的分析，包括形态学指标（BMI和器官指数）、血液测试（常规血液测试、血液生化测试和激素）、以及影像学指标（CT扫描和MRI）（Figure 1B）。总体来看，这些结果表明长期服用Metformin的高安全性（Table S1）。另外，我们注意到，O-Met组的牙周骨流失相比O-Ctrl组有所减轻（Figure 1C）。为了评估记忆、学习和认知灵活性，我们使用了Wisconsin General Test Apparatus (WGTA)方法。在延迟任务中，该任务评估记忆保持能力，O-Met组在延迟后检索食物的准确率高于O-Ctrl组，表明Metformin可能增强老年动物的记忆力（Figure 1D）。此外，在物体辨别任务中，O-Met组表现出更好的学习能力，表明Metformin有可能改善老年受试者的学习能力（Figure 1D）。同样，在物体逆转学习中，O-Met组在认知恢复能力方面优于O-Ctrl组（Figure 1D）。当我们通过MRI研究脑部形态时，广义线性混合模型（GLMMs）显示，与年轻猴子相比，老年猴子的皮质厚度有所减少，尤其是在额叶和颞叶（Figure 1E和Figure S1A）。在接受Metformin治疗的老年猴子中，额叶皮质厚度得到保持，与O-Ctrl组相比，顶叶皮质厚度呈增加趋势（Figure 1E和Figure S1A）。组织学检查显示，Metformin治疗增强了额叶皮质厚度，而该区域在猴子中通常会随年龄增长而变薄（Figure 1F）。通过使用CHARM5图谱将大脑分为88个区域，我们发现Metformin治疗的猴子在9个区域内皮质厚度得到恢复，这些区域主要集中在额叶（Figure 1G和Figure S1B）。这些区域包括与认知功能相关的重要皮质区（Figure 1G和Figure S1B），即眶额皮质（OFC）（如第10、11、13区）、侧前额皮质（LPFC）（如第9区）、前扣带皮质（ACC）（如第24a/b区）、中扣带皮质（MCC）（如第24a/b prime区）以及运动皮质（如preSMA和SMA），其中OFC和LPFC在工作记忆、规则学习和逆转学习中发挥重要作用。总体来看，这些发现结合记忆和认知功能的提升，表明Metformin可能延缓与衰老相关的大脑结构退化，特别是在额叶区域。![]()
Figure 1. 长期Metformin治疗后食蟹猴的行为和影像评估
(A) 食蟹猴长期Metformin治疗分析流程图。本研究图中的图形元素来源于BioRender.com和Flaticon.com。
(B) 食蟹猴的形态学分析、医学影像分析和血液分析的示意图。
(C) Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴子的牙槽骨Micro-CT检查。定量数据以均值 ± SEM表示，并标注了单因素ANOVA的p值。Y-Ctrl组n = 6；M-Ctrl组n = 3；O-Ctrl组n = 5；O-Met组n = 6。
(D) 使用Wisconsin General Test Apparatus (WGTA)评估O-Ctrl组和O-Met组猴子在延迟任务（上）、辨别任务（中）和逆转任务（下）的表现。数据以中位数 ± SEM表示。延迟任务和辨别任务的ANOVA p值以及逆转任务的Mann-Whitney U检验p值均有标注。参与者数分别为O-Ctrl: n = 5, O-Met: n = 6。
(E) 通过MRI评估Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴子的额叶皮质厚度。log2(倍数变化)显示在与O-Ctrl组相比的额叶中灰表面上。皮质厚度分别为每只猴子的左右半球单独获取的数据。皮质厚度数据以每只猴子两侧半球的平均值表示。参与者数分别为Y-Ctrl: n = 6, M-Ctrl: n = 3, O-Ctrl: n = 8, O-Met: n = 6。数据以中位数 ± SEM表示，并标注了GLMM分析的p值。
(F) NeuN免疫组化评估Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴子大脑额叶。比例尺为100微米。Y-Ctrl组n = 6；M-Ctrl组n = 3；O-Ctrl组n = 5；O-Met组n = 6。定量数据以均值 ± SEM表示，并标注了单因素ANOVA和Tukey多重比较检验的p值。
(G) 通过MRI检查Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴子的大脑88个区域。图示重点标出了Metformin引发的显著（p < 0.05）皮质厚度变化区域。参与者数分别为Y-Ctrl: n = 6, M-Ctrl: n = 3, O-Ctrl: n = 8, O-Met: n = 6。饼图展示了由于Metformin引发的不同大脑区域在各大脑叶片上的复原比例。
另见Figure S1和Table S1。
2.2 Metformin减轻多组织的与衰老相关的转录波动
为了深入了解灵长类动物衰老的分子机制及Metformin干预的系统性影响，我们进行了全身范围和全基因组的RNA-seq分析。我们对食蟹猴的79个组织/器官（包括神经系统、皮肤系统、内分泌系统、消化系统、生殖系统、免疫系统、呼吸系统、心血管系统、肌肉系统、泌尿系统和骨骼系统）进行了分析，涵盖了三个不同年龄段的猴子（Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl）以及接受Metformin治疗的老猴子（O-Met）（Figure 2A和Figure S2A）。首先，我们使用Mfuzz c-means聚类法进行时间排序分析，剖析与年龄相关的转录动态。这项分析揭示了四个不同的聚类：聚类1为持续上调（U），聚类2为持续下调（D），聚类3为最初上调随后下调（UD），聚类4为最初下调随后上调（DU）（Figure 2B和Figure S2B）。聚类U中的基因主要与先天免疫反应和炎症反应相关，而聚类D中的基因则涉及细胞外基质的组织和发育过程，反映了衰老期间组织维护和再生能力的下降（Figure 2B）。接下来，我们研究了Metformin对与年龄相关的组织转录组变化的影响。当我们比较年轻、中年和老年（“Y-Ctrl、M-Ctrl至O-Ctrl”）与年轻、中年和接受Metformin治疗的老年猴子（“Y-Ctrl、M-Ctrl至O-Met”）之间的轨迹时，我们发现Metformin干预与四个聚类中所有与年龄相关的转录动态变化的全面减轻有关。基因集变异分析（GSVA）表明，Metformin显著恢复了聚类U和D中基因的表达，而对其他两个聚类的影响较小（Figure 2C）。为了量化Metformin缓解衰老的效果，我们计算了组织特异性的“恢复评分”（详见STAR Methods）。值得注意的是，Metformin在大多数衰老组织中起到了恢复作用（Figure 2D），其中前额叶、皮肤、肝脏、肾脏、股四头肌和肺在79个组织的11个系统中获得了最高的恢复评分（Figure 2D）。当我们使用GSVA在通路水平上对衰老恢复进行表征时，我们发现Metformin治疗与抑制与衰老相关的炎症反应、细胞凋亡、纤维化和活性氧（ROS）通路有关（Figure 2E、2F和Figure S2C）。相反，Metformin治疗重新激活了通常参与发育和形态发生的衰老抑制通路，包括Wnt信号、脂质代谢和DNA修复通路（Figure 2E和2F）。总之，我们的综合图谱揭示了Metformin在灵长类动物中发挥的全局抗衰老作用。![]()
Figure 2. Metformin在多种组织中逆转了与年龄相关的基因表达
(A) 转录组分析中涵盖了11个系统的79个组织的示意图。(1) 皮肤（头皮）；(2) 皮肤（FR）；(3) 皮肤（OR）；(4) 皮肤（IR）；(5) 皮下脂肪（面部）；(6) 皮肤（BR）；(7) 皮肤（MR）；(8) 大脑（PFL）；(9) 大脑（FL）；(10) 大脑（PL）；(11) 大脑（TL）；(12) 大脑（OL）；(13) 脑干；(14) 小脑；(15) 大脑（NUFL）；(16) 大脑（NUPL）；(17) 大脑（海马体）；(18) 背根神经节；(19) 脊髓；(20) 正中神经（上肢）；(21) 坐骨神经（下肢）；(22) 牙龈；(23) 舌头；(24) 食管；(25) 胃；(26) 肝脏（右叶）；(27) 肝脏（中叶）；(28) 肝脏（左叶）；(29) 内脏脂肪组织（胰腺）；(30) 胰腺；(31) 肠道（十二指肠）；(32) 肠道（空肠）；(33) 肠道（回肠）；(34) 内脏脂肪组织（胃肠）；(35) 肠道（结肠）；(36) 甲状腺；(37) 肾上腺；(38) 肾脏（髓质）；(39) 肾脏（皮质）；(40) 膀胱；(41) 外周血单个核细胞（PBMC）；(42) 脾脏；(43) 精囊；(44) 前列腺；(45) 阴茎；(46) 附睾；(47) 睾丸；(48) 背部肌肉；(49) 冈上肌腱；(50) 肱二头肌；(51) 腓肠肌；(52) 跟腱；(53) 斜方肌；(54) 腹部肌肉；(55) 臀部肌肉；(56) 股四头肌；(57) 黄韧带；(58) 腰椎间盘；(59) 心脏（右心房）；(60) 心脏（左心室）；(61) 心脏（右心室）；(62) 主动脉（弓）；(63) 主动脉（胸部）；(64) 横膈膜；(65) 肺（右上叶）；(66) 肺（左上叶）；(67) 肺（右下叶）；(68) 肺（左下叶）；(69) 气管（上部）；(70) 气管（下部）；(71) 支气管（上部）；(72) 支气管（下部）；(73) 皮肤（手）；(74) 棕色脂肪组织（颈部）；(75) 皮肤（颈部）；(76) 棕色脂肪组织（肩胛）；(77) 皮肤（背部）；(78) 皮下脂肪（腹部）；(79) 皮肤（腹部）。组织的全名列在Table S1中。
(B) 食蟹猴组织的转录组数据聚类分析，显示了每个聚类中与年龄相关的基因数目。实线和带状区域代表了每个聚类中标准化FPKM均值 ± SD。
(C) 左侧，展示了Metformin治疗后与年龄相关基因的表达变化。实线和带状区域代表了每个聚类中标准化FPKM均值 ± SD。右侧，箱线图展示了不同组中与年龄相关基因的GSVA评分。Wilcoxon秩和检验的p值标注在图中。
(D) 点图展示了Metformin治疗后不同老年组织的恢复评分。首先，使用GSVA算法量化了不同组猴子器官中持续上调和下调的与衰老相关基因（聚类U和D）的表达。
(E) 热图展示了基于GSVA评分的与衰老相关的恢复通路。
(F) 箱线图展示了在特定组织中比较的选定恢复通路。使用limma进行调整的t检验的p值标注在图中。
另见Figure S2和Table S2。
2.3 Metformin在多种组织中减轻了多种衰老标志
为了验证我们的发现，我们进行了全面的组织学评估，重点关注衰老的经典标志，特别是在恢复评分较高的组织中。我们最初的观察表明，Metformin的使用与衰老细胞的聚集减少有关，这通过O-Met组与O-Ctrl组相比，肺、肝、肾（皮质和髓质）、心脏、胃和皮肤中的p21阳性细胞数量减少得以体现（Figure 3A）。此外，与O-Ctrl组相比，Metformin治疗还减少了与衰老相关的肺、肾和心脏纤维化区域的扩展（Figure 3B）。同样，Metformin治疗减轻了泌尿系统中标志着脂质过氧化的4-hydroxynonenal (4-HNE)的衰老积累（Figure S3A）。另外，在O-Met猴子的组织中，Metformin有效地修正了与衰老相关的表观遗传不稳定性指标，例如H3K9me3的减少和内源性逆转录病毒（ERV）蛋白表达的上调（Figures S3B和S3C）。此外，Metformin治疗抵消了II型快肌纤维的减少，这是骨骼肌衰老的一个关键指标（Figure S3D）。值得注意的是，我们发现Metformin在抑制慢性炎症方面具有广泛且强大的效果，慢性炎症是几乎所有与衰老相关疾病的核心标志。Metformin补充与肝脏和胃中衰老相关的炎症区域减少以及肺、肝和肾中的免疫细胞浸润减少相关（Figures 3C和3D）。我们还注意到，Metformin治疗与衰老相关分泌表型（SASP）因子的升高被抑制有关，这些因子包括肿瘤坏死因子-a (TNF-a)、白介素-1b (IL-1b)、S100钙结合蛋白A8 (S100A8) 和基质金属蛋白酶9 (MMP9)，这些因子在多个受检组织中有所减少（Figures 3E–3G 和Figure S3E）。总之，我们的发现强调了Metformin在灵长类动物中有效减少衰老标志物的出现，包括组织退化和炎症。![]()
Figure 3. Metformin缓解了猴子多种组织中的衰老标志
(A) 对Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴子的肺、肝、肾、心脏、胃和皮肤进行p21免疫组织化学评估。箭头指示p21阳性细胞。肺、肝、肾、心脏和胃的比例尺为20微米；皮肤的比例尺为10微米。
(B) 对Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴子的肺、肾和心脏进行Masson三色染色评估。比例尺为20微米。
(C) 对Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴子的肺、肝和肾进行CD45的免疫组织化学和免疫荧光检查。箭头指示CD45阳性细胞。比例尺为20微米。
(D) 对Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴子的肝脏和胃进行苏木精和伊红（H&E）染色评估。虚线圈和箭头指示炎症区域。比例尺为40微米。
(E) 对Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴子的肺和肠进行TNF-a的免疫组织化学和免疫荧光检查。箭头指示TNF-a阳性细胞。比例尺为20微米。
(F) 对Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴子的肠进行IL-1b的免疫荧光检查。箭头指示IL-1b阳性细胞。比例尺为20微米。
(G) 对Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴子的肺、心脏、肝脏和肾进行S100A8的免疫组织化学和免疫荧光检查。箭头指示S100A8阳性细胞。比例尺为20微米。
(A)至(G)中的定量数据以均值 ± SEM表示，(C)中肝脏的Mann-Whitney检验p值标出，(A)和(B)中的单因素ANOVA和Tukey多重比较检验p值，以及(C)至(G)中的肺和肾的p值均已标注。Y-Ctrl组n = 6；M-Ctrl组n = 3；O-Ctrl组n = 4-5；O-Met组n = 5-6。
另见Figure S3。
2.4 Metformin减少了多组学生物年龄
为了量化Metformin诱导的生物年龄减缓效果，我们基于多组学数据建立了猴子的衰老时钟计算模型。除了全组织的转录组特征外，我们还获取了DNA甲基化特征，构建了对转录恢复评分最高的组织的DNA甲基化时钟。此外，我们通过质谱生成了定量的血浆蛋白质组学数据和代谢组学特征（Figures S4A–S4E）。通过整合Y-Ctrl、M-Ctrl和O-Ctrl队列的数据（共36只猴子），我们构建了一个惩罚线性模型。该模型能够估算每只猴子的生物年龄，并计算DAge，即预测的生物年龄与该猴子实际年龄预期值之间的差异。O-Met组和O-Ctrl组之间的DAge差异被量化为DAgeDiff（详见STAR Methods）。为此，我们使用ElasticNet方法量化了生物年龄指标，包括DNAmAge（基于DNA甲基化）、transcriptAge（基于转录组）、proteinAge（基于蛋白质组）和metabAge（基于代谢组），以评估每只猴子的生物年龄（Figure 4A; Table S3）。该分析估计，Metformin使用将处理猴子的proteinAge平均重置了6.41年（Figure 4B）。在转录组恢复显著的组织中，DNAmAge也得到了恢复，包括额叶、肺、肾（皮质）、肝脏和皮肤，分别恢复了约6.10年、5.11年、4.90年、3.95年和2.65年（Figure 4C）。基于这些数据，我们进一步探讨了Metformin对各组织转录组水平生物年龄的影响。分析结果表明，所有13个组织的transcriptAge均恢复到更年轻的状态，包括跟腱（DAgeDiff约5.31年）、肝脏（DAgeDiff约4.14年）、支气管（DAgeDiff约3.71年）、肌肉（DAgeDiff约3.56年）和肺（DAgeDiff约3.40年）（Figure 4D和Table S3）。总体而言，我们的研究表明，Metformin干预通过多种组织和不同组学层次延缓了衰老，这通过生物年龄的测量得到了证明。2.5 Metformin减缓了肝脏衰老并增强了老年猴子的肝脏保护
作为代谢器官的肝脏显示出Metformin相关的显著DNAmAge减少（DAgeDiff约为3.95年）和transcriptAge减少（DAgeDiff约为4.14年）（Figures 4C和4D）。为了更精确地分析Metformin的干预效果，我们对Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met组的肝脏样本进行了snRNA-seq分析（Figures 5A和S5A–S5C）。随后，我们开发了"单核转录组衰老时钟"（sn-transcriptAge），利用从青年、中年到老年的snRNA-seq数据，来表征细胞类型水平的衰老及其减缓。首先，通过比较Y-Ctrl、M-Ctrl和O-Ctrl组中的任意两组，筛选出差异表达基因（DEGs）（|log2(fold change)| > 0.25，调整后p值 < 0.05），并将这些与年龄相关的DEGs作为输入数据，利用ElasticNet模型构建了单核衰老时钟，并通过留一交叉验证（LOO）技术提高其预测精度（详见STAR Methods）。通过将所有细胞类型的数据点结合为一个输入矩阵，我们开发了一个综合模型，预测Metformin治疗可使肝脏平均恢复4.28年（Figure 5B）。值得注意的是，三种特定细胞类型——肝细胞、Kupffer细胞和T细胞，显示出明显的恢复至更年轻的状态，其sn-transcriptAge平均回退了5.83、6.66和6.43年（Figure 5B）。Metformin治疗显著恢复了在O-Ctrl组相较于Y-Ctrl和M-Ctrl组中持续上调（cluster U）或下调（cluster D）的基因表达（Figures S5D和S5E）。总体而言，Metformin恢复了约33.9%的cluster U DEGs和21.2%的cluster D DEGs（Figure S5F）。具体来说，不同的细胞类型显示出不同的恢复效果，促衰老效果则较为边缘（Figure S5G）。基因功能注释显示，cluster D基因主要与肝细胞的基本代谢功能相关，包括脂质运输（如ABCA9、HACL1和SLC22A7）和脂质代谢（如HACL1、CYP4F12和PNPLA3），以及氨基酸代谢（如ARG1、GNMT和SHMT1）（Figure S5D）。这些结果表明，Metformin治疗可以减轻衰老引起的肝脏代谢损伤。相反，cluster U基因在免疫反应（如LBP、C4BPA和C4BPB）以及转化生长因子-β（TGF-β）通路（如SMAD3、TGFBR1和TGFBR3）等通路中富集，并且在多种细胞类型中与炎症反应相关（Figure S5D）。O-Met组中cluster U基因的抑制与炎症和纤维化状态的减少相关（Figure S5H）。当我们对恢复的DEGs比例以及Augur评分（衡量每种细胞类型对特定治疗敏感性的指标）进行排名时，我们发现Kupffer细胞、肝细胞和T细胞是恢复效果最好的三种细胞类型，与我们的生物年龄估计结果一致（Figures S6A和S6B）。此外，恢复的bulk RNA-seq DEGs主要归因于肝细胞的转录变化，突显了它们在衰老及其通过Metformin治疗减缓中的关键作用（Figure S6C）。与生物信息分析一致，组织学分析证实了最近被确定为衰老标志物的载脂蛋白E（APOE）表达增加在Metformin治疗后恢复到了年轻状态（Figures S6G和S6H）。通过油红O染色，我们验证了与年龄相关的脂质滴异常积累在O-Met组中得到了缓解（Figure S6H）。此外，Metformin减少了TNF-a水平和肝脏中因衰老引起的纤维化（Figures S6I和S6J）。这些结果共同表明，Metformin可能通过增强肝细胞的代谢功能来保护肝脏功能。![]()
Figure 4. Metformin治疗猴子的多组学生物年龄分析
(A) Metformin处理猴子多层次生物年龄评估的示意图概述。
(B) 左侧为点图，显示基于血浆蛋白质组学推测的生物年龄（proteinAge）。右侧为箱线图，展示Metformin对猴子proteinAge的恢复效果。
(C) 上方为棒棒糖图，显示基于DNA甲基化数据的猴子多组织生物年龄（DNAmAge）变化。中间部分为点图，展示基于组织DNA甲基化数据的Metformin显著（p < 0.05）逆转组织DNAmAge的情况，按DAgeDiff排序。下方为箱线图，展示Metformin治疗对猴子DNAmAge的恢复效果。
(D) 上方为棒棒糖图，显示基于bulk RNA-seq数据的猴子多组织生物年龄（transcriptAge）变化。中间部分为点图，突出显示基于组织bulk RNA-seq数据，按DAgeDiff排序的Metformin诱导的前5个组织的恢复情况。下方为箱线图，展示Metformin治疗后猴子的transcriptAge降低情况。
(C)和(D)中的恢复组织位于水平线之上，组织代表的点根据Figure 2A中的颜色进行标记。(B)至(D)中的虚线表示预测生物年龄与猴子实际年龄预期值之间没有差异（DAge = 0），点与虚线之间的距离表示个体的衰老速度。(B)至(D)中的Wilcoxon秩和检验的p值已标注。
另见Figure S4和Table S3。
2.6 Metformin延缓大脑衰老并为老年猴子提供神经保护
在Metformin治疗后大脑结构和功能有所改善，并且考虑到额叶在DNAmAge恢复中表现最为显著（Figure 4C），我们的下一步是探索Metformin在额叶中的抗衰老作用。使用与肝脏相同的方法，我们对所有四组猴子的额叶样本进行了snRNA-seq分析（Figure 5C和Figure S7A）。与肝脏snRNA-seq分析一样，我们训练了ElasticNet模型来评估额叶的全面转录组景观（Figure 5D和Figure 5E）。有趣的是，我们发现Metformin治疗后大多数细胞类型恢复到了更年轻的状态，表现为sn-transcriptAge的降低。通过将所有细胞类型的数据整合到一个统一的模型中，我们得出结论，Metformin治疗使猴子的额叶平均恢复了5.90年（Figure 5D）。随后，在抑制性神经元（InN）（DAgeDiff约5.59年）、兴奋性神经元（ExN）（DAgeDiff约5.45年）、小胶质细胞（DAgeDiff约6.86年）、少突胶质细胞（OL）（DAgeDiff约6.79年）、星形胶质细胞（DAgeDiff约6.08年）以及少突胶质前体细胞（OPC）（DAgeDiff约5.70年）中均显著观察到了sn-transcriptAge的改善（Figure 5E）。Metformin治疗显著恢复了所有四个聚类（U、D、UD和DU）和所有细胞类型的基因抑制，这与生物年龄的恢复一致（Figure S7D和S7E）。在O-Met猴子中，衰老DEGs聚类U中随着年龄增长而持续上调的基因恢复了30.1%，而在聚类D中随年龄增长而持续下调的基因恢复了28.0%（Figure S7F）。基因功能（GO-term）分析表明，对于神经元功能至关重要的基因，如树突形态发生/延伸和突触组装相关基因（例如GSK3B、GRID2和NRG3），在ExN、InN、OL、OPC、小胶质细胞和星形胶质细胞中随着衰老而下调，但通过Metformin治疗得以恢复（Figure 5F）。相反，在衰老过程中上调的通路，包括免疫反应激活、补体激活和TGF-β受体信号通路的调节，通过Metformin治疗被重置为较低水平（Figure 5F）。我们还调查了Metformin是否会通过加剧衰老DEGs的表达变化而产生潜在的副作用，结果发现所有细胞类型中捕获的促衰老DEGs数量非常有限，这表明该剂量下Metformin的促衰老影响是可控的（Figure S7G和S7H）。通过实验，我们验证了与大脑衰老和神经退行性疾病进展相关的标志物在Metformin治疗后恢复到类似年轻猴子的水平。这包括SA-β-gal阳性细胞的减少、p-Tau (T181)的累积减少以及MMP9等促炎因子的下降（Figure 5G）。此外，我们观察到，随着衰老而减薄的髓鞘厚度在Metformin治疗后恢复到了更年轻的状态（Figure 5G）。![]()
Figure 5. Metformin减缓了猴子的肝脏和额叶衰老
(A) UMAP图显示了猴子不同肝细胞类型的分布（上方）。下方的UMAP图显示了4组中不同细胞类型的分布情况。
(B) 径向条形图展示了通过Metformin恢复的多种猴子肝脏细胞类型的生物年龄（sn-transcriptAge），该数据基于肝脏的snRNA-seq分析。点图展示了肝脏snRNA-seq的sn-transcriptAge。箱线图展示了Metformin对猴子肝脏sn-transcriptAge的恢复效果。仅绘制了显著恢复的细胞类型（Wilcoxon秩和检验p值 < 0.05）。点代表测试组或O-Met组中的一个metacell。
(C) UMAP图展示了大脑（额叶，FL）中不同细胞类型的分布（左侧）。右侧UMAP图展示了4组中不同细胞类型的分布情况。
(D) 点图展示了从额叶snRNA-seq数据中推测的整合生物年龄（sn-transcriptAge）（左侧）。箱线图展示了Metformin治疗后猴子额叶整合生物年龄的恢复情况。每个点代表测试组或O-Met组中的一个metacell。
(E) 径向条形图展示了基于额叶snRNA-seq数据，通过Metformin恢复的猴子额叶多细胞类型的生物年龄（sn-transcriptAge）（左侧）。点图（右上）展示了从额叶snRNA-seq数据中推测的sn-transcriptAge。箱线图（右下）展示了Metformin治疗后猴子额叶sn-transcriptAge的恢复情况。仅绘制了通过Wilcoxon秩和检验p值 < 0.05显著恢复的细胞类型。
(F) 通过功能富集分析识别出不同细胞类型中显著富集的上调和下调的恢复DEGs代表GO术语网络图。
(G) 对Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴子大脑衰老的评估包括SA-β-gal染色、p-Tau (T181) 和MMP9的免疫荧光分析，以及额叶（FL）髓鞘厚度的电子显微镜分析。SA-β-gal染色、p-Tau (T181) 和MMP9免疫荧光分析的比例尺为20微米。髓鞘厚度电子显微镜分析的比例尺为1微米。Y-Ctrl组n = 6；M-Ctrl组n = 3；O-Ctrl组n = 5；O-Met组n = 6。定量数据以均值 ± SEM表示，并标注了单因素ANOVA和Tukey多重比较检验的p值。
(B)、(D)和(E)中的虚线表示预测生物年龄与猴子实际年龄预期值之间没有差异（DAge = 0），点与虚线之间的差距代表个体的衰老速度。
另见Figures S5、S6、S7及Table S4。
接下来，Augur评分评估显示ExN在Metformin诱导的抗衰老效果中表现最为显著（Figure 6A）。鉴于ExN在认知功能中的关键作用，我们对额叶的ExNs进行了深入分析（Figure 6A–6C）。基因集富集分析（GSEA）表明，随着衰老通常下调的通路，如突触膜黏附、树突形态发生和神经发生，在Metformin治疗后得以恢复（Figure 6B）。此外，与神经保护相关的基因，通常在衰老过程中被抑制，但在Metformin的作用下得以上调。相反，与神经元衰老和凋亡相关的基因在Metformin的作用下被下调（Figure 6C）。这些结果进一步得到了系列组织学检测的支持，这些检测提供了Metformin神经保护的有力证据。具体而言，Metformin治疗减少了SPiDER-β-gal阳性神经元的比例，并减轻了核膜完整性的丧失（Figure 6D和6E）。此外，该药物减轻了神经元内蛋白质异常积累，表现为内含体和淀粉样蛋白（Ab）斑块的减少（Figure 6F）。Metformin还增强了神经元再生和突触连接性，表现为树突延长，这对于神经元结构可塑性和功能能力至关重要（Figure 6G）。此外，在特别容易受衰老影响的脑区——海马体中，我们检测到小胶质细胞的累积减少，这种细胞类型与多种神经退行性疾病和衰老有关，同时神经元核膜完整性得到恢复（Figure 6H）。此外，Metformin增加了海马区域的神经前体活性（Figure 6H）。这些结果共同表明，Metformin通过对抗与衰老相关的细胞变化，提供了针对衰老有害影响的全面神经保护。![]()
Figure 6. Metformin在老年猴子额叶中展示了神经保护特性
(A) 点图显示了通过Augur对snRNA-seq的细胞类型优先排序。
(B) 点图展示了与年龄相关的差异表达基因（DEG），按log2(倍数变化) (O-Met/O-Ctrl) 排序（左侧）。红点、蓝点和灰点分别代表恢复上调、恢复下调和未恢复的基因。条形图（右侧）展示了Metformin治疗后猴子额叶兴奋性神经元的基因集富集分析（GSEA）结果。
(C) 山脊图展示了四组中的代表性基因集评分。黑线表示中位数表达水平。标出了Wilcoxon秩和检验的p值。
(D) 使用SPiDER-β-gal染色评估额叶（FL）的脑组织，并对Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴子的大脑进行NeuN的免疫荧光检测。比例尺，20微米。
(E) 对Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴子额叶（FL）中的Lamin B2和NeuN进行免疫荧光评估。比例尺，20微米。
(F) 顶部为内含体评估，底部为淀粉样蛋白（Ab，4G8）的免疫荧光检测，以及对Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴子额叶（FL）进行NeuN的免疫荧光检测。比例尺，20微米。
(G) 对Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴子额叶（FL）进行Golgi染色分析。比例尺，20微米。
(H) 对Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴子海马体进行IBA-1、DCX和LAP2的免疫荧光分析。比例尺，20微米。
(D)至(H)中的定量数据以均值 ± SEM表示，(D)至(G)中的单因素ANOVA和Tukey多重比较检验的p值、(H)中IBA-1和LAP2的p值，以及(H)中DCX的Mann-Whitney检验p值均已标注。Y-Ctrl组n = 5-6；M-Ctrl组n = 3；O-Ctrl组n = 5；O-Met组n = 5-6。
另见Figure S7和Table S4。
2.7 Metformin通过Nrf2依赖机制自主减轻神经元衰老
随后，我们利用已建立的体外模型，即使用人类胚胎干细胞（hESC）来源的神经元，评估Metformin的潜在抗衰老作用（Figure S8A-S8C）。使用低剂量的Metformin（5 mM）治疗15天缓解了神经元衰老的指标，包括SA-β-gal活性降低，内含体和淀粉样蛋白（Ab）积累减少，IL-6表达降低以及Lamin B2水平恢复（Figure 7A-7C和S8D-S8F）。这些发现表明，Metformin可能通过细胞自主机制减缓人类神经元的衰老。在评估Metformin潜在下游效应蛋白水平时，我们发现Metformin治疗恢复了核因子Nrf2（磷酸化Nrf2）的活性形式，这是调节细胞抗氧化反应的重要因子，通常在长期神经元培养期间减少（Figure S8G和S8H）。Metformin治疗增加了核内磷酸化Nrf2的水平，并伴随着Nrf2靶基因如HO-1、NQO-1、SOD3、GPX2和GPX1的上调，这些基因在神经元衰老过程中通常受到抑制并下调（Figure 7D、7E、S8I和S8J）。此外，Metformin治疗降低了4-HNE（一种脂质过氧化产物）的表达以及ROS水平，表明与O-Ctrl组相比，O-Met组织中的氧化应激水平较低（Figure 7F和S8K）。此外，部分Metformin诱导的人类神经元基因表达变化在体内实验中也得到了部分验证（Figure S8L）。我们未观察到Metformin治疗后衰老神经元中线粒体基因表达或mtDNA含量的显著变化（Figure S8M-S8P）。这些结果表明，Nrf2活性增加可能介导了Metformin对灵长类神经元的抗衰老作用。为了验证这一假设，我们采用了两种方法操控神经元中的Nrf2活性。首先，我们使用小干扰RNA（siRNA）敲低Nrf2（Figure 7G、S9A和S9B），即使在存在Metformin的情况下，Nrf2及其靶基因的核水平也显著降低（Figure 7H、7J、S9C和S9D）。Nrf2抑制加速了神经元衰老，而Metformin治疗无法减缓这种加速的衰老过程（Figure 7I和7J）。这些观察表明，Metformin的神经保护作用至少部分依赖于Nrf2活性。其次，我们生成了具有E82G Nrf2突变的人类神经元，这种突变通过阻止KEAP1结合增强了Nrf2的激活（Figure 7K、S9E和S9F）。这种遗传增强策略显著激活了Nrf2通路，表现为核内Nrf2磷酸化水平增加、靶基因表达上升，以及4-HNE和ROS等氧化标志物在Nrf2 E82G神经元中的减少，与野生型形成对比（Figure 7L、7N和S9G-S9I）。结果表明，Metformin无法在Nrf2 E82G突变下进一步增强其抗衰老效果（Figure 7M和7N）。这些结果与核定位磷酸化Nrf2水平一致，表明Nrf2通路激活是Metformin延缓人类神经元衰老的关键机制。与体外研究一致，Nrf2通路激活也在Metformin治疗的猴子多个组织中被检测到，包括额叶神经元（Figure 7O、7P和S9J）。总之，Metformin通过激活Nrf2通路，大大减缓了神经元和大脑的衰老。![]()
Figure 7. Metformin通过Nrf2依赖机制延缓神经元衰老
(A) 展示Metformin对体外培养hNeurons的抗衰老效果示意图，详细说明了所使用的治疗方案。Veh，载体；Met，Metformin。
(B) 对hNeurons在第35天进行SA-β-gal染色评估，处理分别为Veh或Met。比例尺，20微米。
(C) 在第35天对MAP2标记的hNeurons进行Ab (4G8)的免疫荧光分析。箭头指示Ab (4G8)阳性神经元。比例尺，20微米和5微米（放大图）。
(D) 在第35天对处理为Veh或Met的hNeurons进行p-Nrf2水平的Western blot分析。
(E) 在第35天对MAP2标记的hNeurons进行p-Nrf2的免疫荧光检测。比例尺，20微米和5微米（放大图）。
(F) 在第35天对MAP2标记的hNeurons进行4-HNE的免疫荧光分析。比例尺，20微米和5微米（放大图）。
(G) si-NC或si-Nrf2 hNeurons长期培养中Metformin治疗的示意图，并说明相应的治疗方案。
(H) 在第21天对MAP2阳性si-NC或si-Nrf2 hNeurons进行p-Nrf2的免疫荧光分析。比例尺，20微米。
(I) 在第21天对si-NC或si-Nrf2 hNeurons进行SA-β-gal染色评估。比例尺，20微米。
(J) 对在第21天处理为Veh或Met的si-NC或si-Nrf2 hNeurons的p-Nrf2平均荧光强度和SA-β-gal阳性细胞比例进行定量分析。
(K) 野生型（WT）或Nrf2 E82G hNeurons长期培养中Metformin治疗的示意图，并说明相应的治疗方案。
(L) 在第35天对MAP2标记的WT或Nrf2 E82G hNeurons进行p-Nrf2的免疫荧光检测。比例尺，20微米。
(M) 在第35天对WT或Nrf2 E82G hNeurons进行SA-β-gal染色评估。比例尺，20微米。
(N) 对在第35天处理为Veh或Met的WT或Nrf2 E82G hNeurons的p-Nrf2平均荧光强度和SA-β-gal阳性细胞的比例进行定量评估。
(O) 对Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴子额叶（FL）中的p-Nrf2和NeuN进行免疫荧光检测。比例尺，20微米。
(P) 对Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴子额叶（FL）中的4-HNE和NeuN进行免疫荧光分析。比例尺，20微米。
(B)至(F)、(J)和(N)至(P)中的定量数据以均值 ± SEM表示，(B)至(F)中的双尾Student's t检验p值已标注，(J)和(N)至(P)中的单因素ANOVA和Tukey多重比较检验的p值也已标注。(B)至(F)、(J)和(N)每组n = 3个生物样本；(O)和(P)中Y-Ctrl组n = 6，M-Ctrl组n = 3，O-Ctrl组n = 5，O-Met组n = 6只猴子。
另见Figures S8和S9。
3. 讨论
在超过3年的时间里，我们评估了Metformin在健康猴子中全身性的抗衰老效果，利用了其与人类相似的生理和器官结构，以及其对疾病和药物的反应。我们的结果表明，Metformin能够改善灵长类动物全身的衰老，经过治疗后，多维度的衰老时钟显示出显著的年轻化趋势。鉴于衰老的复杂性，对抗衰老干预措施的全面评估至关重要。我们的研究揭示了Metformin在组织和细胞特异性上的抗衰老作用，特别是在灵长类动物中增强了认知表现。结合证据表明，即使在5 mM的浓度下，Metformin也能够穿过血脑屏障并提供神经保护，这些发现表明Metformin有可能减缓大脑衰老，并可能用于治疗神经退行性和其他慢性疾病。除了其在糖尿病管理中的作用，我们的研究表明Metformin对健康老年猴子的血糖几乎没有影响。我们证明Metformin主要通过细胞自主途径减缓神经元衰老和大脑衰老，而Nrf2固有的抗氧化机制在其中起到了关键作用。与Metformin通过激活AMP活化蛋白激酶（AMPK）和抑制线粒体电子传递的已知保护机制不同，我们的研究强调了Nrf2抗氧化通路作为抗衰老的一个有前景的靶点。值得注意的是，我们在灵长类动物研究中使用的Metformin剂量位于标准治疗范围内，增强了我们研究结果对人类治疗的适用性。观察到的灵长类动物衰老标志物逆转，表明通过针对器官的核心衰老机制来改善慢性病和预防与衰老相关的疾病是可行的。我们的研究确定了灵长类动物中Metformin的最佳剂量和治疗时间，阐明了器官特异性的敏感性，并提供了药效学见解。此外，我们引入了干预效果评估的预测性生物标志物，包括从临床可获取的活检中获得的血浆和组织时钟。这些创新的生物标志物为评估抗衰老干预措施建立了临床标准，提供了一种结构化的方法来评估药物对衰老的影响，并制定应对与衰老相关的慢性疾病的策略。
4. 研究的局限性
我们的研究揭示了Metformin在减缓灵长类动物衰老方面的多方面影响，目前的研究重点集中在雄性个体上。我们注意到Metformin可能在分子和组织层面减缓了雄性个体的衰老，但功能性年轻化的确凿证据仍然有限，且其在人类中的副作用尚未完全了解。该研究还未评估猴子的死亡率和停用Metformin后的长期影响。认识到抗衰老药物与多个靶点之间复杂的相互作用至关重要，表明研究Nrf2以外的通路具有潜力。尽管Metformin在灵长类动物中的综合影响和机制尚未完全描绘清楚，但我们的研究表明其能够显著延缓衰老过程。这一发现是迈向前进的重要一步，为制定减轻衰老影响及其相关健康问题的临床策略提供了指导。文章链接：
https://www.cell.com/cell/abstract/S0092-8674(24)00914-0
